毕业论文定稿(共12页)

1、编号(bin ho):2010041152毕业论文(b y ln wn)（2014届本科(bnk)）论文题目：大肠杆菌噬菌体分离纯化研究学 院: 生命科学与技术学院 专 业: 生物科学 班 级： 10级生科（1）班 作者姓名： 郑小云 指导教师： 毛宁 职称： 助教 完成日期： 2014 年 6 月 3 日目 录 TOC o 1-3 h z u HYPERLINK l _Toc390034229 陇东学院(xuyun)本科生毕业论文诚信声明 陇东学院本科生毕业论文诚信(chn xn)声明本人郑重声明：所呈交的本科毕业论文，是本人在指导老师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果，成果不存在知识产

2、权争议，除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体均已在文中以明确方式标明。本人完全意识(y sh)到本声明的法律结果由本人承担。作者(zuzh)签名：二O一年月日大肠杆菌噬菌体分离(fnl)纯化研究郑小云（陇东学院(xuyun)生命科学与技术学院 甘肃 庆阳 745000）摘要(zhiyo)：以本实验室保藏的大肠杆菌E.coli NO1和E.coli NO2为宿主菌，采用双层琼脂平板法从环境污水中分离纯化得到一株烈性大肠杆菌噬菌体Pha1，研究其对大肠杆菌的裂解曲线及Ca2+、Mg2+对噬菌体裂解率的影响。结果表明

3、，噬菌体pha1对E.coli NO1有较强的裂解作用，对E.coli NO2没有裂解作用；在培养基中添加Ca2+和Mg2+时，噬菌体出斑率明显高于对照，说明Ca2+和Mg2+均可促进噬菌体生长；当加入200mg/ L 的Ca2+或250mg/L Mg2+时，相对出斑率最高，分别达到187%和178%。关键词：大肠杆菌；噬菌体；分离纯化 Research on separation and purification of E.coli phageZHENG Xiao-yun(College of life science and technology, Long dong University

4、, Qing yang Gansu 745000 )Abstract: A strain of bacteriophage Pha1 was isolated from wastewater using double layer agar plate method, With the E.coli NO1 and E.coli NO2 preserved in our laboratory as the host cell. The curves of E.coli lysed by Pha1 and the effects of Ca2+, Mg2+ on phage cracking ra

5、te was studied. The results showed that, pha1 had strong schizolysis effect on E-coli NO1, but no effect on E-coli NO2; the number of plagues was significantly higher in the medium supplemented with Ca2+ and Mg2+ than in the control, which indicated that Ca2+ and Mg2+ could promote the growth of pha

6、1; when adding 200mg/ L Ca2+ or 250mg/L Mg2+, the plagues ratio was the highest, reaching 187% and 178% respectively.Key words: E.coli; phages; isolating and purifing1引言 噬菌体是一类感染细菌、放线菌等微生物的病毒，体积微小、结构简单、具有严格的寄生性，广泛分布于自然界中1。噬菌体作为指示微生物，在监测水质环境、指示污染程度等方面的研究也有了一些进展2。因此，分离和研究噬菌体，弄清楚噬菌体与其宿主之间的生态学关系，对于监测水质环

7、境，控制水质污染等方面的工作无疑具有指导意义。鉴于噬菌体有溶菌作用和严格的种型特异性3，可利用噬菌体作细菌的鉴定和分型，亦可用于检测标本中的未知细菌和防治某些传染病4。噬菌体作为一种新的治疗制剂已受到广泛关注5。本研究旨在通过分离大肠杆菌噬菌体, 研究其生理特性，为将噬菌体作为一种生物制剂，应用于治疗细菌性感染等方面提供参考和依据。2 材料(cilio)与方法(fngf)2.1材料(cilio)噬菌体样品来源：阴沟污水（100ml）菌种：陇东学院生命科学与技术学院微生物实验室保藏的大肠杆菌E.coli NO1和E.coli NO2培养基：3倍牛肉膏蛋白胨培养液，牛肉膏培养液，牛肉膏蛋白胨半固体

8、培养基（倒上层用），牛肉膏蛋白胨琼脂培养基（倒底层平板用）6试验器材：离心机，细菌滤器，抽滤装置，恒温水浴锅，高压蒸汽灭菌锅，超净工作台，无菌涂布器，无菌吸管，培养皿，三角瓶，移液管，试管，漏斗等2.2方法2.2.1大肠杆菌噬菌体的分离7,8A.培养大肠杆菌：活化培养实验室保藏的大肠杆菌E.coli NO1和E.coli NO2至对数期（OD600值0.8左右）。B.增殖噬菌体样品：取上述大肠杆菌培养液6ml于盛有50ml 3倍牛肉膏蛋白胨培养液的三角瓶内，后加入污水样100ml（离心并过滤除菌），继续37摇床振荡培养1214h，以增殖噬菌体。C.富集噬菌体：将以上培养液3000r/min离心

9、30min，将上清液过滤除菌，取100ml滤液及5ml大肠杆菌液加入50ml 3倍牛肉膏蛋白胨培养液中，37培养1218h进行噬菌体富集。将以上富集液3000r/min离心30min后，取上清液10mL加入 5mL 3倍牛肉膏蛋白胨培养液及相应宿主菌液1mL，室温下放置 1h，37 120rpm振荡培养 3.5h。D.收集(shuj)噬菌体：将上述(shngsh)培养液于 4下12000g 离心(lxn)30min，上清液再经微孔滤膜（0.22m）过滤，滤液即为拟含有相应宿主菌噬菌体的原液9。E.验证噬菌体存在：在大肠杆菌平板上，滴加上述滤液57小滴,同时滴加生理盐水作为对照，进行标记，37培

10、养1820h，若出现噬菌斑，则证明滤液中存在噬菌体10,11 。2.2.2大肠杆菌噬菌体的纯化12(1)用接种环取菌液一环接种于液体培养基内，再加人0.1ml大肠杆菌悬液，使混合均匀。(2）取上层琼脂培养基，溶化并冷至48（可预先溶化、冷却，放48水溶箱内备用）,加入以上噬菌体与细菌的混合液0.2ml，立即混匀，并立即倒人底层培养基上，混匀，置37培养12h。(3）此时长出的分离的单个噬菌斑，其形态、大小常不一致，再用接种针在单个噬菌斑中刺一下，小心采取噬菌体，接入含有大肠杆菌的液体培养基内。于37培养。(4)等待管内菌液完全溶解后，过滤除菌，即得到纯化的噬菌体。2.2.3噬菌体效价的测定13

11、(1)倒平板：将融化后冷却到45左右的下层肉膏蛋白胨固体培养基倾倒于11个无菌培养皿中，每皿约倾注10mL培养基，平放，待冷凝后在培养皿底部注明噬菌体稀释度。(2)稀释噬菌体：按10倍稀释法，吸取0.5mL大肠杆菌噬菌体，注入一支装有4.5mL1%蛋白胨水的试管中，即稀释到10-1，依次稀释到10-6稀释度。(3)噬菌体与菌液混合:将11支灭菌空试管分别标记10-4、10-5、10-6和对照。分别从10-4、10-5和10-6噬菌体稀释液中吸取0.1mL于上述编号的无菌试管中，每个稀释度平行做三个管，在另外两支对照管中加0.1mL无菌水，并分别于各管中加入0.2mL大肠杆菌菌悬液，振荡试管使菌

12、液与噬菌体液混合均匀，置37水浴中保温5min，让噬菌体粒子充分吸附并侵入菌体细胞。(4)接种上层平板:将11支融化并保温于45的上层肉膏蛋白胨半固体琼脂培养基5mL分别加入到含有噬菌体和敏感菌液的混合管中，迅速摇匀，立即倒入相应编号的底层培养基平板表面，边倒入边摇动平板使其迅速地铺展表面。水平静置，凝固后置37培养。(5)观察并计数(j sh)：观察平板中的噬菌斑，并将结果记录于实验报告表格(biog)内，选取每皿有30300个噬菌斑的平板计算(j sun)噬菌体效价的测定。 计算公式：N=Y/VX（：效价值，：平均噬菌斑数皿，：取样量，：稀释度） 2.2.4噬菌体对大肠杆菌的裂解曲线14在

13、细菌悬液中加入噬菌体，由于噬菌体对细菌的裂解作用，导致细菌悬液OD600的值产生变化，由此得到噬菌体对细菌的裂解曲线。分别以E. coli NO1和E. coli NO2作为宿主菌。将过夜培养的细菌悬液以1:100的比例转接到100mL LB培养基中，37160rpm振荡培养1.5h（OD600约0.5，约 1.5108cfu/ml），将菌悬液平均分装在2个无菌的锥形瓶中，向其中分别加入E. coliNO1和E. coliNO2噬菌体悬液1109pfu（经过 0.22m微孔滤膜过滤），立即置于37、160rpm振荡培养，每隔20min取样0.1ml，测定OD600的值。同时以不加噬菌体的细菌作

14、为对照，试验重复三次。2.2.5 Ca2+、Mg2+对噬菌体裂解率的影响15,16在下层固体琼脂和上层半固体琼脂中分别加入Mg2+和Ca2+ ,使终浓度分别为0、50、100、150、200、250、300、350、400、450mg/l, 然后取1.0103pfu/ml的噬菌体液和培养8h 的菌液，用双层平板法，测定出斑情况17。3结果与分析3.1噬菌体的分离与纯化本试验采用双层琼脂平板法分离纯化噬菌体，以实验室保藏的E. coli NO1和E. coli NO2为宿主菌，分离得到了1株烈性噬菌体Pha1。初次分离所得的噬菌体噬菌斑较小，效价比较低，约为1.5104pfu/mL。故需进一步纯

15、化扩增。为得到效价较高、裂解能力较强的噬菌体，对初次分离得到的噬菌体进行反复分离纯化，直到噬菌斑在形态和大小上基本一致，即可得到纯化的大肠杆菌噬菌体(图1)。噬菌体Pha1形成的噬菌斑较明显，圆形透明，直径0.8-2.0mm，表现出典型的裂性噬菌体的菌斑特征。噬菌斑的大小不一，可能表示有不同的噬菌体被富集, 为不同噬菌体的进一步纯化提供了良好的基础。图1.分离(fnl)所得大肠杆菌(d chn n jn)噬菌斑Fig1. Plaques of pha13.2噬菌体效价的测定(cdng)表1. 噬菌体效价测定结果Tab 1 Pfu/ml of phage Pha1噬菌体稀释倍数效价（pfu/ml

16、）10-410-510-610-7CK4.311033.131042.981032.03102/3.3噬菌体pha1对大肠杆菌的裂解曲线 图2 噬菌体pha1对大肠杆菌(d chn n jn)E-coli NO1的裂解(li ji)曲线Fig.2 The curves of E.coli NO1 lysed by pha1图3 噬菌体pha1对大肠杆菌(d chn n jn)E-coli NO2的裂解曲线Fig.2 The curves of E.coli NO2 lysed by pha1由图2和3可知，E. coli NO1菌体混合悬液的OD600值先升高后下降，说明噬菌体pha1对E-c

17、oli NO1有较强的裂解作用；E. coli NO2与噬菌体混合液的OD600值一直呈上升趋势，故噬菌体pha1对E. coli NO2没有裂解作用。3.4 Ca2+、Mg2+对噬菌体裂解率的影响18由结果(图4) 可知，在培养基中添加Ca2+和Mg2+时，噬菌体出斑率明显高于对照，说明添加Ca2+和Mg2+均可促进噬菌体出斑。当加入200mg/ L 的Ca2+或250mg/L Mg2+时，相对出斑率最高，分别达到187%和178%。图4 Ca2+ 和Mg2+离子(lz)对噬菌体出斑率的影响(yngxing)Fig 4 .The effects of Ca2+ and Mg2+ on the

18、 number of plagues4讨论(toln)噬菌体是感染细菌的病毒, 按其与宿主的关系可将其可分为烈性噬菌体与温和噬菌体19。噬菌体对宿主的裂解和感染是特异性的, 是由受体决定的, 很少产生耐药性的问题, 也不会造成机体的菌群失调, 每种细菌都有自身敏感的噬菌体 20,21 。本试验从污水中分离出1株烈性大肠噬菌体Pha1。初次分离所得的噬菌体噬菌斑较小，效价比较低，对初次分离得到的噬菌体进行反复分离纯化得到了效价较高、裂解能力较强的噬菌体。噬菌体对宿主菌的裂解作用具有极强的特异性22，噬菌体pha1对E.coli NO1有较强的裂解作用，对E.coli NO2没有裂解作用，说明噬菌

19、体pha1对E.coli NO1有特异性。Ca2+和Mg2+能够促进噬菌体的吸附与注入，有利于噬菌体的繁殖，对促进噬菌体的形成有明显效果，所以在培养基中添加Ca2+和Mg2+时，噬菌体出斑率明显高于对照。参考文献1司穉东,何晓青.噬菌体学M.北京:科学出版社,1996. 2 李梅, 胡洪营. 噬菌体作为水中病毒指示物的研究进展 J . 中国给水排水, 2005, 21 ( 2) : 23 26.3徐焰.噬菌体溶菌机制研究进展J.重庆医学,2003,32(1):106-108.4 邢继兰(译).利用噬菌体治疗大肠杆菌病和预防食源性 病原J.国外畜牧学-猪与畜,2005,25(6):39-41.5

20、王静,王劲,孙运峰,等.治疗性噬菌体制剂的研究进展J.食品与药品,2011,13(9): 366370.6萨姆布努克 J, 弗里奇 EF, 曼妮阿迪期 T. 分子(fnz)克隆实验指南 M . 第 2 版. 北京(bi jn): 科学出版社, 1996. 908- 910.7张培东,孙岩,任慧英,等.大肠杆菌的分离(fnl)及其生物学特性J.中国兽医杂志,2008,44(4):10-11.8杜银香,从污水中分离大肠杆菌噬菌体的方法改进J.湖北民族学院学报,2004,21(3):1.9沈萍,范秀荣.微生物学实验M.3版,北京:高等教育出版社,1999.10 林业杰, 陈亢川, 胡海林, 等. 海

21、峡预防医学杂志, 1998, 4( 1) : 9 - 11. 11 陈 敏, 方 序. 杭州师范学院学报, 2000, 6: 78 - 80.12王晓丽,赵树欣,赵璐,等.欧文氏菌噬菌体的分离纯化及其生物学特性研究J.工业微生物,2011,41(6):4751.13孙海虹,马同锁,于珊,等.致病性鸡大肠杆菌噬菌体的分离与效价测定J.河北师范大学学报,2007,31(1):108-114.14熊鸿燕.一种新型的微生物控制技术噬菌体溶菌技术J.中国消毒学杂志,2006, 23(4): 342344.15周德庆.微生物学教程M，北京：高等教育出版社，2002：63-8116杜连祥.工业微生物学学实验技术M，天津：天津科学技术出版社，1992：207-20917 李广武, 杨朝晖, 岳海峰. 武汉大学学报(自然科学版) , 1995, 41