VEGF在妊娠肝内胆汁淤积症中的作用以及丹参治疗机制的研究

1、VEGF在妊娠肝内胆汁淤积症中的作用以及丹参治疗机制的研究【摘要】目的讨论VEGF在妊娠肝内胆汁淤积症中的作用以及丹参活血化瘀改善胎儿血供的可能机制。方法采集妊娠肝内胆汁淤积症患者血清，Jaffe法别离培养脐静脉内皮细胞，用IP患者血清刺激培养的内皮细胞，模拟IP的体内环境，行丹参干预，与正常妊娠血清组比拟，不同含量作用不同的时间，TT法检测细胞活力，ELISA法检测分泌型VEGF蛋白表达。结果IP患者血清与HUVEs共培养：1TT法发现随着血清含量的增加A值逐渐降低020%，且低于相应浓度的正常妊娠血清组，有统计学差异；2ELISA法发现：同正常孕妇血清组相比，IP患者血清组HUVEs表达分

2、泌型VEGF蛋白降低，且随着血清含量的增加和培养时间的延长，VEGF表达逐渐降低。不同浓度的丹参干预后随着含量的增加18g/l，细胞活力和VEGF蛋白表达逐渐升高，以8g/l组作用最正确。结论IP患者血清对HUVEs具有损伤作用，使细胞活力降低。其损伤作用可能与VEGF的分泌减少有关。丹参对内皮细胞具有保护作用并能增加VEGF蛋白的表达。丹参可能通过增加VEGF蛋白的表达具有活血化瘀作用，改善胎盘和胎儿的血供而改善围生儿预后。【关键词】妊娠肝内胆汁淤积症；脐静脉；血管内皮细胞；血管内皮生长因子；丹参Studyftheeffetsfvasularendthelialgrthfatrandthet

3、herapeutiehanissfSalviailtirrhizaBgeinintrahepatihlestasisfpregnany【Abstrat】bjetiveTsudytheeffetsfvasularendthelialgrthfatrandthetherapeutiehanissfSalviailtirrhizaBgeinintrahepatihlestasisfpregnany(IP).ethdsTelvepatientsithIPandtelvenralpregnanyentakepartinthisstudy,thEirseruislletedbefretherapyheni

4、nhspital.Endthelialellsareislatedfrhuanubilialveinshsedangthe10nralpregnanyardingtJaffesethd,serufdifferentnentratinfIPgrupsandnralpregnanygrupsisulturedithHUVEsfrdifferenttiepintrespetively.TTethdisappliedteasuringthevitalityfHUVEs.Theexpressinvaluefvasularendthelialgrthfatr(VEGF)isdetetedbyenzye-l

5、inkediunsrbentassay(ELISA).Resultsparedithnralpregnany,thevaluefTTinIPserugrups,theAvalueissignifiantlyler,P0.05.ThevaluefslubleVEGFinIPserugrupislerthanthatinthenalpregnanyserugrup.iththeserunetratininreases,thevaluefsVEGFdereasesintheIPgrups.paredithIPgrup,thevaluefTTandsVEGFintheSalviailtirrhizaB

6、getherapeutigrupinreasesiththenentratininrease,8g/lfSalviailtirrhizaBgeistheptialnentratin.nlusinSerufIPpatientsipairsHUVEsinvitranddereasestheexpressinfVEGF.TheehanisfserufIPpatientsipairsHUVEsaybebydereasingtheexpressinfVEGF.SalviailtirrhizaBgeuldprtetHUVEsagainsttheinjuryfIPseruandprtestheexpress

7、infVEGF.SalviailtirrhizaBgeiprvesHUVEsbyinreasingthevaluefVEGF.【Keyrds】intrahepatihlestasisfpregnany;ubilialvein;vasularendthelialell(VE);vasularendthelialgrthfatr;SalviailtirrhizaBge妊娠肝内胆汁淤积症intrahepatihlestasisfpregnany，IP是一种妊娠特异性的疾病1，以孕妇出现全身或部分皮肤瘙痒、黄疸及胆酸增高为特征。IP可引起严重的围生儿并发症，围生儿发病率和死亡率明显增加。关于IP胎儿宫

8、内缺氧的机制尚不清楚。胎盘-胎儿血供受到一系列生长因子的调节，血管内皮生长因子vasularendthelialgrthfatr，VEGF是一种直接而特异作用于血管内皮细胞的高效促有丝分裂因子，在刺激新血管发生与生长及维持血管壁的完好性和通透性方面均有重要意义。VEGF对于受精、着床、胎盘血管形成及胎儿生长发育起着重要的作用。表达异常那么可能导致胎儿宫内氧供不良，对围生儿产生不良影响。具有行气活血作用的中药丹参，临床上被用于治疗IP以改善围生儿预后。本文以IP患者血清与正常脐静脉内皮细胞共培养并用不同含量的丹参注射液进展干预，讨论VEGF在妊娠肝内胆汁淤积症中的作用，以及丹参活血化瘀改善胎儿血

9、供的可能机制。1资料与方法1.1研究对象搜集2022年812月在东南大学附属中大医院和南京市妇幼保健院妇产科住院的正常妊娠和IP患者各12例，无菌抽取孕妇肘前静脉血。选取择期剖宫产的足月妊娠脐带10例。纳入标准：正常妊娠组：整个孕期无合并症或并发症；IP组：IP诊断标准遵照?中华妇产科学?2，并排除合并妊高征，糖尿并肾并原发性高血压、贫血及其他内科合并症。孕龄诊断正确，否认有吸烟、激素治疗史。剖宫产指征：均未临产，系因骨盆、胎位、珍贵儿及社会因素等而行择期剖宫产者。1.2方法参照Jaffe法行脐静脉内皮细胞原代培养，经倒置相差显微镜、Giesa染色和人第因子抗原鉴定为血管内皮细胞。以正常妊娠孕

10、妇血清作为对照,当细胞交融60%-80%时，参加不同浓度的IP患者血清刺激24h，TT法检测脐静脉内皮细胞的活力；不同含量的IP患者血清分别刺激12h、24h、36h，按照ELISA试剂盒操作步骤检测培养上清液中分泌型可溶性VEGF的变化。不同含量的丹参注射液进展干预，分别检测细胞活力和VEGF蛋白的变化。1.3试剂和仪器RPIediu1640培养基：GIBBRL公司产品；胎牛血清(100l/瓶)：杭州四季青消费；型胶原酶：HYbiheialrpratin公司产品；TT粉剂，购自SIGA公司；ELISA试剂盒购自晶美生物工程北京。GBB16型2培养箱，LYPUSK2型倒置显微镜，SPETRAA

11、X250型酶联免疫检测仪，96孔培养板。1.4统计学分析数据均以xs表示，组间多个样本均数间比拟采用方差分析，两两之间用q检验，两样本均数比拟用成组t检验。采用SPSS11.5统计软件2结果2.1IP患者血清对脐静脉内皮细胞活力的影响IP患者血清刺激内皮细胞24h后，细胞吸光度A值随着浓度的增加逐渐降低；并低于相应浓度的正常血清组P0.05。详细数据如表1所示。表1不同浓度的正常孕妇和IP患者血清干预后HUVEs的A值略2.2IP患者血清对脐静脉内皮细胞分泌VEGF蛋白的影响不同浓度的IP患者血清刺激不同的时间，HUVEs分泌VEGF蛋白量详细数据见表2。IP患者血清各浓度组均低于相应浓度正常

12、组，有统计学差异。随着血清含量的增加，VEGF蛋白量降低，有统计学差异。此外随着IP患者血清与HUVEs作用时间的延长，VEGF蛋白的分泌量逐渐降低。表2不同浓度的IP患者血清干预后HUVEs分泌VEGF蛋白量略注：10%IP患者血清组，24h、36h和12h相比P0.05；20%IP患者血清组，24h、36h和12h相比P0.052.3丹参注射液对脐静脉内皮细胞活力的影响在20%IP患者血清干预的同时，分别参加不同含量丹参注射液共同培养24h后，相应组别的细胞吸光度A值见表3。与IP患者血清组相比，随着丹参含量的增加，其A值逐渐增加。表3不同浓度的丹参注射液干预后HUVEs的A值略注：与IP

13、组比1)P0.052.4丹参注射液对脐静脉内皮细胞分泌型VEGF蛋白的影响20%IP患者血清和不同含量的丹参注射液共刺激HUVEs24h后，ELISA法检测培养上清液中VEGF蛋白量的变化，详细数据见表4。表4不同浓度的丹参注射液干预24h后HUVEs分泌的VEGF量略注：与IP组比1)P0.053讨论妊娠肝内胆汁淤积症是一种妊娠特有的疾病，其对孕妇的损伤相对较轻，妊娠终止后12天患者的瘙痒病症消失，胆汁酸、转氨酶等也迅速恢复正常。但其对围生儿的影响严重，围生儿的发病率和死亡率明显升高，如导致早产、胎儿宫内窘迫、死胎、死产等，成为高危妊娠极为棘手的疾病13。IP胎儿宫内缺氧、围生儿预后不良确实

14、切机制尚不明了。胎儿在母体内血、氧的供给来自于胎盘，胎盘血管的发育受到血管内皮生长因子等一系列生长因子的调节。研究发现4妊娠全过程中胎盘、胎儿均有较高的VEGF及其受体的表达，并具有时间和空间的特异性。inther5提出VEGF对胎盘的形成和发育起重要作用，其在胎盘中表达量的变化与胎盘血管的发育相一致。妊娠早期VEGF促进胎盘血管网络的发育，妊娠晚期又发挥调节血管完好性和通透性的作用，维持母胎之间的营养交换。Stephen6等发现羊的胎儿胎盘动脉内皮细胞中通过自分泌机制调节胎盘的血管发生和其他功能。IP的母体循环、胎儿循环、羊水及胎粪均表现为高胆汁酸程度，研究发现胆汁酸对细胞具有毒性作用，并与

15、浓度和时间呈正相关。有学者在体外应用胆汁酸刺激培养的血管内皮细胞，结果发现细胞膜的通透性增强，细胞凋亡。在胆汁酸等病理因素的刺激下，胎盘绒毛滋养细胞及胎盘血管内皮细胞受损，导致VEGF的分泌量降低，因此血管发生、增加血管通透性、调节内皮细胞的完好性等功能降低，这一结果更加重了滋养细胞和内皮细胞的受损，导致胎儿缺氧等严重的并发症。本实验以IP患者血清与脐静脉内皮细胞共培养发现，与正常妊娠组相比，IP患者血清刺激后的内皮细胞活力降低，细胞增殖缓慢，随着血清浓度的增加细胞的活力逐渐降低，表现为TT实验的A值降低。说明IP患者血清对内皮细胞具有损伤作用。通过ELISA检测培养上清液中的VEGF蛋白含量

16、发现，随着血清浓度的增加VEGF蛋白量降低，一样浓度下，VEGF分泌量随血清培养时间的增加而降低。在IP患者血清的干预下，可使内皮细胞自分泌血管内皮生长因子降低，VEGF具有促内皮细胞的有丝分裂作用，因此细胞数目减少，细胞活力降低。由此推论，IP时内皮细胞分泌VEGF的降低，导致了胎盘、胎儿血管生发和血管通透性的降低，导致了胎儿供血、供氧的缺乏，进而出现一系列的并发症。中医理论认为IP湿热内蕴，营卫不和，气滞血行不畅7。丹参已被临床用于治疗IP减轻患者的瘙痒病症。大量研究说明丹参对血管内皮细胞具有保护作用8，9，可以减少细胞的氧化损伤、抑制细胞的凋亡。本实验以IP患者血清和HUVEs共培养，并

17、用不同含量的丹参注射液进展干预。TT结果说明：丹参干预后细胞的A值增加，随着药物浓度的增加18g/lA值逐渐升高，具有一定的浓度依赖性。这说明丹参能促进脐静脉内皮细胞的生长、增殖，对血管内皮细胞具有保护作用，能抑制或减轻IP患者血清对脐静脉内皮细胞的损伤。在一定浓度的范围内，此种保护作用随着浓度的增加而增加。中医学认为“气血相关、“补气活血，因此具有行气活血作用的丹参药可能具有促血管生成作用。丹参活血化瘀、对内皮细胞的保护作用是否与VEGF有关？仅徐杰等10研究发现丹参多酚酸盐能使单核细胞VEGFRNA分泌升高，并能促进内皮细胞的迁移。本实验也证实了丹参注射液能使受损伤HUVEs的分泌VEGF

18、蛋白增加ELISA法检测培养液中的VEGF，随着浓度的增加，VEGF分泌量具有一定的浓度依赖性。丹参促使VEGF蛋白分泌增加与对血管内皮细胞地保护作用相一致。由此推论丹参可能通过促使脐静脉内皮细胞自分泌VEGF这一内皮细胞的有丝分裂原，促进内皮细胞的分裂、增殖，加速细胞的生长，进而间接的保护了内皮细胞；内皮细胞增殖的加速以及功能的维持又促进了VEGF的表达和分泌。因此，丹参可能通过增强内皮细胞的VEGF表达，促使血管生发和增强血管的通透性，胎盘部位血流灌注增加，促进了母胎之间血、氧交换，改善了围生儿因血供缺乏而引起的缺氧窘迫、发育缓慢，从而改善了围生儿预后。【参考文献】1GerainA,arvajalJA,GlasinviJ,etal.Intrahepatihlestasisfpregnany:anintriguingpregnany-speifidisrder.JSGynelInvestig,2002,9:10-14.2曹泽毅.中华妇产科学.北京：人民卫生出版社,1999,500-507.3ReyesH.Revie:intrahepatihlestasis.Apuzzlingdisrderfpre