单核细胞增生李斯特氏菌检测方法进展(共13页)

1、食品微生物期末(q m)考核题目(tm)：单核细胞增生李斯特氏菌检测方法(fngf)进展姓名： 学号： 班级： 单核细胞增生李斯特氏菌检测方法进展康阳妃西南大学(dxu)食品科学学院，重庆400715摘要(zhiyo)：单核细胞增生李斯特氏菌是一种(y zhn)能引起人畜共患病的食源性致病菌之一，在自然界中分布广泛。近年来，在许多国家，它是卫生部门重点监测的几种食源性致病菌之一。本文介绍了单核细胞增生李斯特氏菌的生物学特性，流行病学特征。总结了单核细胞增生李斯特氏菌现行有效的的常规和快速的检测方法及流程，并对各方法的优缺点进行了比较。关键词：单核细胞增生李斯特氏菌；生物学特征；流行病学特性；检

2、测；致病菌The progress of detection methods to Listeria monocytogenes Kang yangfeiCollege of Food Science ,SouthwestUniversity,Chongqing400715Abstract:Listeria monocytogenes is one of foodborne pathogens that can cause zoonosis,it is found ubiquitously in the environment. In recent years, it is one of se

3、veral kind of foodborne pathogens that the Health department focus on surveillance to in many countries.This paper introduce the biological and epidemiological characteristics of Listeria monocytogenes. Summarize the current effective conventional and rapid detection methods and processes of Listeri

4、a monocytogenes.Key words:Listeria monocytogenes; biological characteristics;epidemiological characteristics ; Detection;pathogens引言单核细胞增生性李斯特菌是一种短小的革兰氏阳性无芽胞杆菌，是一种人畜共患病的致病菌，可使人和动物患李斯特菌病。李斯特菌属（listeria) 现在有2个群7个种, 分别是单核细胞增生性李斯特菌(L monocytogenes , LM) (亦称产单核细胞李斯特菌)、 伊氏李斯特（L.ivanovii)(亦称绵羊李斯特菌)、英诺克李斯特菌

5、（L innocua)亦称无害李斯特菌)、韦氏李斯特菌（L welshimei)、 塞氏李斯特菌（L seeligeri)、格氏李斯特菌（L.grayi) 和莫氏李斯特菌(L.murrayi) James M JAY. 代食品微生物学M杰伊( 美) 北京: 中国轻工业出版社，2001。食品中存在的李斯特氏菌对人类的安全具有较大威胁，是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一，因此，在食品微生物检验中，必须加以重视。本文拟对李斯特氏菌的生物学特性，流行病学特征，检测方法及其当前存在的问题等作系统介绍，以期为进一步深入研究提供参考。1单核细胞增生(zngshng)李斯特氏菌的生物学特性1.1 形态学特

6、征(tzhng) 李斯特菌(以下简称李氏菌)的幼龄菌(取1624h的培养物进行革兰染色), 呈革兰阳性小杆菌,长0152Lm, 宽014 016Lm, 直或稍弯, 常呈V字形, 成对排列。但是陈旧培养物多转为革兰阴性,两端浓染, 而且菌体可成球形。在染色过重的玻片上菌体有栅栏状排列的趋势, 易误认为白喉菌而错判。无芽胞, 一般不形成荚膜, 但在含血清(xuqng)的葡萄糖蛋白胨水中能形成粘多糖荚膜。在22 25e 环境中形成4根鞭毛, 故在25e 肉汤培养液中运动活泼, 用生理盐水制成菌悬液, 在油镜或相差显微镜下观察, 该菌出现轻微旋转或翻滚样的运动; 而在32e时仅形成一根鞭毛, 动力缓慢

7、 何冬梅,邓峰,赖蔚苳,严纪文,宋曼丹,朱海明,柯昌文,马聪. 单核细胞增生李斯特菌生物学研究进展J. 华南预防医学,2006,06:26-29.。1.2 培养特征本菌为需氧或兼性厌氧菌。在340均可生长。生长需要生物素、核黄素、硫胺素各种氨基酸、水解吐温。在含肝浸汁、腹水、血液中生长良好。在EB和葡萄糖肉汤中呈混浊生长, 后者不产气, 液面形成菌膜, 管底有少量沉淀。在SS平板和麦康凯上不生长。在TSAYE平板上生长为灰白色、半透明、圆润、边缘整齐, 直径为0. 710mm的菌落, 在血平板上菌落灰白色、圆润、直径为1. 01. 5mm, 菌落周围为3mm的清晰溶血环。4放置4天后,菌落和溶

8、血环直径增至5mm呈典型奶油滴状。在SIM或半固体培养基上沿穿刺成伞形生长。在MMA 琼脂上用Hemg侧光检查, 可见蓝绿色光 王捷.李斯特氏菌食物中毒J.现代预防医学，1999,26（4）：550-551。1.3 生化特性由于菌株不同，糖发酵结果有差别。本菌一般可分解葡萄糖及( 水) 杨苷，37时产酸; 对伯胶糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、鼠李糖、松甜糖、糊精、马栗苷、山梨醇及甘油等糖类，于310d产酸不发酵; 对棉实糖、肌醇、卫矛醇、侧金盏花醇及甘露醇等则不发酵。不利用枸椽酸盐，40%胆汁不溶解，吲哚硫化氢、尿素、明胶液化、硝酸盐还原、赖氨酸和鸟氨酸均阴性。VP、甲基红和精氨酸双水解阳性。陈倩等

9、用VITEK对LM进行系统的生化鉴定，结果显示蛋白胨、杆菌肽、奥普托钦、6%Nacl、10%胆汁、七叶苷、红四氮唑、右旋葡萄糖、水杨素、海藻糖和纤维二糖为阳性; 半纤维素酶、40%胆汁、精氨酸、尿素、新生霉素、乳糖、甘露醇、棉子糖、山梨醇、蔗糖、阿拉伯糖、丙酮酸、淀粉、菊糖、蜜二 糖、松三糖、核糖、木糖为阴性 胡文忠,萨仁高娃,姜爱丽,刘程惠,何煜波. 产单核细胞增生性李斯特氏菌的研究进展A. 中国食品科学技术学会.中国食品科学技术学会第九届年会论文摘要集C.中国食品科学技术学会:,2012:2.。1.4 抗原(kngyun)特性LM具有(jyu)菌体(O)抗原和鞭毛(H)抗原, 采用凝集和粘

10、附试验可将LM分成四个血清型: 1, 2, 3, 4型,之后再进一步分成16个血清变种。调查研究表明 Kessel JSV,Karns JS,Gorski L,et al.Prevalence of Salmonellae, Listeria monocytogenes, and fecal coliforms in bulk tank m ilk on US dairies. Journal of Dairy Science . 2004, 87: 2822-28301, 致使食源性李斯特菌病发生(fshng)的多由血清4b型引起,其次是1/2a、1/2b。2 单核细胞增生李斯特氏菌的流行性

11、病学2.1 致病因子2.1.1 李斯特菌溶血素（Listeriolysion O,LLO) 李斯特菌溶血素是由hly基因编码的蛋白,是一种孔形成毒素，是主要的毒力因子，可破坏吞噬体，使细菌进入胞液并在其中繁殖，失去后导致细菌毒力的丧失。不产生LLO的可在非吞噬细胞的胞液中生存一段时间，但却不能繁殖，可被吞噬细胞杀灭。近年的研究表明LLO是一个多功能的毒力因子，能引起宿主细胞很多反应，如细胞增殖、黏膜细胞外渗作用、巨噬细胞中细胞因子的表达树突状细胞的凋亡、磷脂代谢及 引起机体产生免疫反应等 朱献忠. 单核细胞增生性李斯特菌研究进展J. 中国卫生检验杂志,2007,07:1333-1335.。2.

12、1.2 P60蛋白 P60蛋白是一种胞壁质水解酶, 由iap基因编码。通常P60蛋白于细胞表面产生, 并大量分泌到生长介质中, 对于细胞的分裂是必不可少的。分析P60蛋白编码基因的突变体显示, 对于LM的吞噬细胞溶解作用以及对机体的感染过程, P60蛋白是一个重要的因素。2.1.3 磷脂酶C 由plcB基因编码,具有锌依赖性, 分为性质不同的两类,即磷脂酰肌醇磷脂酶C( PI- PLC)和磷脂酰胆碱磷脂酶( PC-PLC)。PI-PLC系以活化的形式合成, 而PC- PLC则先以非活化的前肽被分泌出来, 然后在胞外由mpl的基因产物Mpl蛋白酶加工。PI- PLC可辅助细菌逸出初级吞噬体,而细

13、菌在细胞与细胞之间的扩散过程中, PC- PLC则表现出一定的活性作用。AngelikaGrundling等通过利用诱导PC- PLC表达系统证明, 缺乏LLO的LM, PC- PLC的活性不仅对在人类上皮细胞中初级吞噬体的溶解是必需的, 而且对细胞与细胞之间的扩散也是必需的。2.1.4 ActA蛋白 系由actA基因编码的表面蛋白, 通过诱导细胞肌动蛋白分子的聚合作用促使细菌在细胞与细胞之间的传递, 同时也与细菌被宿主细胞内化有关。2.1.5 PrfA蛋白 系由prfA基因编码,是一种转录因子, 是李斯特菌所有基因簇(包括prfA本身)转录激活所必需, 是迄今鉴定出的李斯特菌的唯一毒力调节蛋

14、白; 在感染宿主细胞的过程中, 对于许多毒力因子的等位表达起到了关键调控因子的作用。2.1.6 内化素( Internalis) LM通过吞噬作用进入宿主细胞体内, 有些细胞如巨噬细胞是“专职”吞噬细胞, 通常吞噬细菌并将其杀灭; 而其它的上皮细胞、内皮细胞则为非/专职0吞噬细胞, 但可经诱导产生吞噬细胞的能力。InlA是被认定的第一个LM表面蛋白, 对于LM穿入非吞噬细胞如上皮细胞来说是必需的, InlB在对肝细胞的侵袭过程中起着重要的作用, 即InlA和InlB是LM被非吞噬细胞内化所必需。另外, 小的分泌性亚族在体内对传染过程有明显影响, 实验证明, LM的inlC缺失后, 对小鼠的LD

15、50明显增加。2.1.7 表面(biomin)蛋白P104 除了内化素以外, LM另一种表面蛋白P104也已被证实对于肠道细胞的粘附非常(fichng)重要 李郁,魏建忠,王桂军. 产单核李斯特菌的研究进展J. 中国卫生检验杂志,2005,08:1018-1020。2.2致病机理(j l)（1）寄生物介导的细胞内增生，使它附着及进入肠细胞与巨噬细胞； （2）抗活化的巨噬细胞，单增李氏菌有细菌性过氧化物歧化酶，使它能抗活化巨噬细胞内的过氧物（为杀菌的毒性游离基团）分解； （3）溶血素，即李氏杆菌素O，可以从培养物上清液中获得，能引起宿主细胞很多反应，如细胞增殖、黏膜细胞外渗作用、巨噬细胞中细胞因

16、子的表达树突状细胞的凋亡、磷脂代谢及 引起机体产生免疫反应等 NIGHTINGALE K K，WINDHAM K，WIEDMANN M，et alEvolution and molecular phylogeny of Listeria monocytogenes isolated from human and animal listeriosis cases and foods JJ Bacteriol，2005，187（16）：55375551。2.3传播途径及所致疾病 该菌广泛存在于自然界，如土壤、污水、人和动物粪便、蔬菜、青贮饲料及多种食物中。本菌可通过眼及破损皮肤黏膜进入人体而造成感

17、染，孕妇感染该菌后出现类似流感症状，通过胎盘或产道感染胎儿或新生儿，并致流产; 栖居于阴道子宫颈也引起感染，兽医师及从事相关职业的人员易患皮肤型李斯特菌病。主要表现为： 妊娠感染：可在妊娠的任何时期发生，更多发生在后 3 个月，有畏寒、背痛、发热现象，不进行血培养时，往往被疑为是尿路感染，症状可自限，也许不影响胎儿，但也可致胎儿早产或死胎；足月分娩经产道感染新生儿，常会在产后一个月出现症状，多数表现为脑膜炎。 新生儿败血性肉芽肿病：通过胎盘途径感染，分娩后发病。患儿有多内脏播散性脓肿或肉芽肿，包括脑、肺、肾、肝、脾等组织，常伴有皮肤红丘疹、结膜炎、咽炎，多发于躯干及肢端，患儿可出现循环和呼吸衰

18、竭，致死率高达 33%100%，及早治疗可以提高存活率。 败血症：成人和婴幼儿均可发生，部分患者会出现感染性休克，成人患者常伴有免疫缺陷，新生儿出生后 3 天即可出现症状，临床表现与其他革兰氏阴性菌引起的败血症相似。 脑炎、脑膜炎：在新生儿出生 3 天后发病，成人患者大多数在器官移植、肝硬化、免疫球蛋白低下及恶性肿瘤等基础上，显亚急性过程，中度发热，昏迷情况较少，共济失调较为多见，李斯特菌脑膜炎应与弓形体、新形隐球菌和肺炎球菌等引起的脑膜炎相鉴别。 脑干脑炎：患者均为成年人，发病率虽低，但临床表现却很严重，症状表现为颅神经非对称性偏瘫、共济失调等，严重时可出现呼吸衰竭，致死率高达 50%以上。

19、 局部感染：化脓性结膜炎及皮肤感染可以是婴儿败血(bi xu)肉芽肿的一部分。实验人员、兽医可因直接接触感染，淋巴结感染常见于颈部，可与结核性淋巴结感染混合存在；除此之外，李斯特菌尚可引起心内膜炎、脑脓肿、肝脓肿、肝炎、胆囊炎、关节炎、骨髓炎等 阎雪. 食源性单核增生性李斯特氏菌LIPI-1基因分布和致病力研究D.河北农业大学,2010.- 萨仁高娃,胡文忠,姜爱丽,马杰,冯可. 产单核细胞增生性李斯特氏菌致病机制的研究进展J. 食品工业科技,2013,01:372-376.。 本菌还可引起畜禽多种严重疾病，可引起家兔单核细胞增多症，兔和鼠眼结膜炎；可引起绵羊和山羊一种所谓旋转病；可引起羊羔、

20、猪败血症、脑膜炎、脑脊髓膜炎I禽类如 鸡、鸭、火鸡感染(gnrn)病死后剖验，心肌呈明显退行性病变，心周围有时伴有渗出液肝和肾局部坏死及垒身 水肿。马、羊、牛、鸡、兔、猪和尤有较高的病死率 (52100 ) 董丽丽,王春生,安笑秋,韩立卓. 单核细胞增生李斯特菌简介J. 中国乡村医药,2000,12:24-25。2.4 预防(yfng)控制措施单核细胞增生李斯特菌在自然界广泛分布，主要是通过食源性传播，污染食品的来源和途径很多，所以预防此菌的感染要从多个环节进行，如食品的生产、加工、包装、储存和销售的过程及部门、家庭个人的饮食卫生、牲畜的养殖等，减少细菌的污染，切断细菌的传播途径并杀灭细菌。具

21、体措施如下：（1）单增李斯特氏菌在一般热加工处理中能存活，热处理已杀灭了竞争性细菌群，使单增李斯特氏菌在没有竞争的环境条件下易于存活，所以在食品加工中，中心温度必须达到70持续2分钟以上。（2）单增李斯特氏菌在自然界中广泛存在，所以即使产品已经过热加工处理充分灭活了单增李斯特氏菌，但有可能造成产品的二次污染，因此蒸煮后防止二次污染是极为重要的。（3）由于单增李斯特氏菌在4下仍然能生长繁殖，所以未加热的冰箱食品增加了食物中毒的危险。冰箱食品需加热后再食用。3 单核细胞增生李斯特氏菌检验方法及流程3.1 传统检测方法分离培养 我国于1994年开始发布单核细胞增生李斯特氏菌检测的国家标准,即GB/T

22、4789.30-1994。目前,很多检测部门和单位在进行食品中单核细胞增生李斯特氏菌的检测时,其主要依据依然是国标法。国标GB/T4789.30-1994自从颁布以来,分别进行了3次修订,分别是GB/T4789.30-2003,GB/T4789.30-2008,直至现在正在实行中的GB/T4789.30-2010版本。修订后的GB/T4789.30-2010法,对于样品检测依次进行增菌、选择性分离平板分离培养、初筛试验、鉴定等步骤,通过增加API鉴定试验代替生化试验和协同溶血试验。其主要流程如图1。虽然近年来显色培养基的应用和ATB生化鉴定仪的联合使用已大大简化了鉴定步骤,缩短了检测周期,但由

23、于ATB生化鉴定仪鉴定单核细胞增生李斯特氏菌主要依据10种生化反应(主要为糖发酵),结果的判定主要是依据颜色变化,因此颜色变化不明显或者(huzh)不好界定时,其阴阳性判定带有一定的主观性。而且使用的API试条和试剂质量必须是符合有关的要求。另外,由于需要二次增菌、平板分离及生化鉴定,整个过程至少需要45 d。总之,传统单核细胞增生李斯特氏菌分离鉴定方法耗时长、程序繁琐、试剂和人力成本都比较高。 GB/T 4789.30-2008, 食品卫生微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验S. GB 4789.30-2010, 食品安全国家标准食品微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验S.。3.2 酶联

24、免疫(miny)法（ELISA)由于细菌菌体和鞭毛抗原的存在使得人们(rn men)可以建立基于抗原抗体反应的方法来检测食品中的致病菌。其检测原理主要是将抗原或抗体结合到固相载体表面,再将抗原或抗体特定基团与酶交联成酶结合物,当酶结合物同相应的抗原或抗体结合后,则形成酶-抗原抗体复合物;当酶遇到相应的底物时,可以催化产物水解、氧化或还原,从而产生有色物质。检测时根据有色物质的有无及其深浅,即可间接推断被检样品中有无相应抗原或抗体存在和数量多少,从而达到定性和定量检测的目的。其检验流程如下： = 1 * GB3 * MERGEFORMAT 前增菌：无菌操作取25g(mL)样品(yngpn)到均质

25、袋中，并向其中加入225mL Fraser = 1 * ROMAN * MERGEFORMAT I增菌液,充分(chngfn)均质，于301培养(piyng)24h1h。 = 2 * GB3 * MERGEFORMAT 增菌：移取1mL Fraser = 1 * ROMAN * MERGEFORMAT I 增菌液到9mL Fraser = 2 * ROMAN * MERGEFORMAT II 增菌液中，于301培养24h1h。 = 3 * GB3 * MERGEFORMAT 增菌后处理：移取1mL增菌液到灭菌小试管中，于沸水中加热15min。剩余的增菌液于4保存，以便于阳性确认。 = 4 *

26、GB3 * MERGEFORMAT 取单核细胞增生李斯特氏菌的酶联免疫试剂盒，于1530的环境中放置30min。 = 5 * GB3 * MERGEFORMAT 取适量加热处理后的增菌液到试剂盒测试孔中，通过自动或手动操作，经过酶联免疫反应过程后，检测反应强度（荧光强度或吸光度），与参照值比较，得出检测结果 GB/T 22429-2008, 食品中沙门氏菌、肠出血性大肠埃希氏菌O157及单核细胞增生李斯特氏菌的快速筛选检验酶联免疫法S.。该方法具有操作简便、通量高的特点,可在同一时间内检测大量样品,并可将纯肉汤培养物中的分离物进行属水平的鉴定。但由于菌体及鞭毛抗原交叉反应的存在,还难以进行李斯

27、特氏菌种间特异分析。同时,由于单核细胞增生李斯特氏菌表面抗原极其丰富,且大部分优势表位与属内外细菌有广泛的交叉抗原,给筛选特异性单克隆抗体带来一定的困难,增加了假阳性结果的几率。因此,用ELISA方法从增菌培养物中筛选李斯特氏菌,一般还需要在选择性分离平板上划线培养,这同时也延长了检测周期。 3.3 PCR检测方法美国科学家KaryMullis在1985年发明了聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction，PCR），并在 Science 杂志上发表了关于该技术的第一篇学术论文。从此，PCR 技术得到了生命科学界的普遍认同，KaryMullis 也因此而获得 1993 年的诺贝

28、尔化学奖。随着科学技术的快速发展，PCR 方法被不断改进，它从一种定性的分析方法发展到定量测定，从原先只能扩增几个 kb 的基因到目前已能扩增长达几十个 kb 的 DNA 片段。到目前为止，由传统的 Direct-PCR 衍生出的技术已有十几种之多，如 RT-PCR、nested-PCR、IMS-PCR、多重 PCR、Realtime-PCR、免疫捕捉 PCR 等等，许多研究者也将这些技术用于食品 LM的检测 刘雅莉. 单核细胞增生性李斯特菌快速检测技术研究D.甘肃农业大学,2012.。目前国标规定的PCR检测方法是多重PCR法。其检测流程如下：3.3.1样品的收集与处理 如为冷冻样品，应于2

29、-5解冻，且不超过18 h,若不能及时检验，应置于-1 5保存。非冷冻的易腐样品应尽可能及时检验，若不能及时检验，应置于4冰箱保存，在24 h内检验。 无菌取样品25 g(mL)放人灭菌均质杯或均质袋中加225 ml. BLEB增菌液，充分均质。3.3.2增菌培养(piyng) 与样品均质混合(hnh)的BLEB增菌液（添加了丙酮酸钠）置于30士1预增菌4h，再加入选择性试剂(shj)放线菌酮溶液1.15 mL、吖啶黄溶液0.455 mL、萘啶酮酸溶液1.8 mL30士l继续增菌培养。3.3.3分离培养选择性培养基的分离培养: 分别取30C+l培养24 h和30 h增菌液一环，划线分离于选择性

30、培养基OXA、PALCAM琼脂平板上，37l培养24 h-48 h。黑色菌落观察: 李斯特氏菌在OXA琼脂平板上生长24 h后菌落呈现黑色，直径为1 mm左右，在其周围形成一个黑色环，培养48 h，菌落仍呈黑色，直径2 mm3 mm，除在菌落周围有一环外，在菌落中心部位的深层也形成黑点。李斯特氏菌在PALCAM琼脂平板上与在OXA琼脂平板上的菌落相似。在OXA琼脂平板和PALCAM琼脂平板上挑取5十或更多可疑菌落，接种于TSAYE琼脂平板上，纯培养后进行PCR鉴定。3.3.4 PCR鉴定1、细菌的培养：挑取可疑李斯特菌菌落接种于6 mL TSB-YE肉汤，37过夜培养。2、细菌DNA抽提：离心

31、培养液收集细菌(4 000 r/min，10 min)，用1 mL灭菌水洗1次后离心(8 000 r/min，5 min)，加入等体积的灭菌水和TZ缓冲液重悬，使细菌浓度约为104 cfu/mL_108 cfu/mL（肉眼可见明显浑浊），沸水浴处理8 min，冰水中冷浴10 min,8 000 r/min离心5 min，收集上清液即可用于PCR扩增。3、PCR扩增体系： 50 L反应体系中：10PCR buffer 5L.、Taq酶(5 U/L) 1 L、MgCl2 (25 mmol/L)3L.dNTP(5 mmol/L)2 L、引物MonoA(20 mmol/L)和LisB(20 mmol/

32、L)各2.5L、HAl (20 mmol/L)和HA2 (20 mmol/L)各1.5L、模板DNA(5 L)，加双蒸水26 L。4、PCR扩增条件： 95预变性3 min，95变性45 s，62复性30 s，72延伸45 s，30次循环，72延伸3 min。5、反应体系对照的设置 进行PCR检测时反应体系应设置阳性对照、阴性对照和空白对照。 阳性对照；用单核细胞增生李斯特氏菌标准菌株(54007)提取的DNA作为模板。 阴性对照：用腊样芽孢杆菌标准菌株（63301）提取的DNA和英诺克李斯特氏菌标准菌株(ATCC 33090)提取的DNA作为模板(DNA捉取方法同单核细胞增生李斯特氏菌)。

33、空白对照：用配置反应体系的实验室用水代替模板。 6、凝胶电泳检测PCR产物： 用1TAE电泳缓冲液制备1.2%的琼脂糖凝胶（凝胶融化后冷却至60左右加入含量为0.5g/mL的溴化乙锭，或者在电泳后用0.5 g/mL溴化乙锭溶液进行染色），将5L10L PCR产物与上样缓冲液混合，分别加入到对应的凝胶孔中，另在一孔加入适量的DNA分子量标记物，选择合适的电压进行电泳(一般控制在3 V/cm5 V/cm)，最后用凝胶成像系统进行观察分析并记录。 7、结果(ji gu)分析与判定 SN/T 0184.2-2006, 食品中单核细胞增生李斯特氏菌检测方法.第2部分:多重PCR方法S. 传统的PCR检测

34、技术和常规检测方法相比，由于特异性引物序列存在，大大增加了检测的特异性和敏感性，同时也缩短了检测时间，但尚存在着诸如同位素标记探针的放射性污染、检测步骤复杂、耗时长等许多不足，因此使其在实际检测工作中的使用受到很大的限制，实时荧光定量PCR检测技术，利用了PCR技术核酸扩增的高效性、探针技术的高特异性和光谱技术的高敏感性以及计量高准确性等优点可精确定量、反应迅速、信号重复性好、灵敏度和特异性高，大大提高了定量的准确性。此外，由于是在封闭的体系中完成整个扩增和实时检测过程，不需要凝胶电泳过程，从而缩短了检验时间，避免了扩增产物对环境造成的污染问题。因此，利用传统的分离培养(piyng)结合分子生

35、物学检测，将是未来分析检测发展的一个主要趋势 刘书花,魏云波,林小静,李景超. 食品中单核细胞增生李斯特氏菌的检测方法研究进展J. 现代农业科技,2010,19:327-328.。3.4免疫(miny)磁珠法免疫磁珠法的基本原理是抗原抗体反应。样品制备后, 在室温下(1822)将载有抗体的磁珠加至样品中, 振荡2h。此间, 李斯特氏菌被吸附在磁珠的抗体上。在磁场的作用下, 与其它微生物和样品残渣分离开来, 从而将李斯特菌从样品中直接分离出来, 不需要进行富集。将捕集的磁珠进行清洗, 在平板上展开, 于37培养22h。将可疑菌落进行免疫学确认,判定是否为李斯特菌。通过溶血反应和鼠李糖反应确认是否

36、为单增李氏菌。其具体流程如下：1、样品制备在均质袋中加入25样品，再加入225FB1增菌肉汤，30培养241。2、增菌取mL 1中制备好的样品，加到10L FB2增菌液中，35培养241后，进行免疫磁珠分离。3、免疫磁珠分离（IMS）免疫捕获：混合2中的增菌培养液，沉淀所有的粗糙食物残渣，从增菌培养液中移取上层液体（要尽可能避免移取到食物颗粒和脂肪颗粒）加入Eppendorf管中，加20准备好的免疫磁珠。在旋涡混合器上混合该悬液。分离:将Eppendorf管固定在磁架的管孔中，180轻缓摆动磁架次次，使免疫磁珠聚集到磁极。小心地打开磁架上的Eppendorf管管盖，从磁极对面一侧慢慢吸出液体，

37、注意不要接触管壁上的磁珠，每一个样品换一次枪头；加灭菌的，并重新盖好盖子，将磁极从支架上移走，180轻缓摆动磁架次次，使管内各成分混合，然后重新将磁极放回到支架上。重复该清洗步骤几次。将离心管从磁性分离器上移开，并加100灭菌的PBS到管中，重悬磁珠。如果实验室没有磁性分离器，也可以用手摇代替。4、分离培养分离(fnl)培养：吸取50免疫磁珠悬液，加到显色培养基及任一选择性培养基OXA、PALCAM琼脂(qingzh)平板上，用无菌接种环划线，35培养(piyng)2448。筛选：李斯特氏菌在CHROMarar显色培养基上菌落为蓝色，且在其周围形成一个晕环。李斯特氏菌在琼脂平板上生长后菌落呈现

38、黑色，直径为，在其周围形成一个黑色环，培养，菌落仍呈黑色，直径，除在菌落周围有一环外，在菌落中心部位的深层也形成黑点。李斯特氏菌在琼脂平板上与在琼脂平板上菌落相似。在CHROMarar显色培养基及或PALCAM琼脂平板上挑取个或更多可疑菌落，接种于-琼脂平板上，纯培养后进行鉴定。鉴定与结果判定 SN/T 0184.3-2008, 进出口食品中单核细胞增生李斯特氏菌检测方法.第3部分:免疫磁珠法S.这一方法的优点在于在较低的菌液浓度时也可通过免疫磁珠的富集作用进行检测，缩短前增菌时间，并进一步降低了单增李斯特氏菌的检测限。该方法也存在缺点，当磁珠用单抗包被时无法识别所有的李斯特氏菌菌株，而用多抗

39、包被时又不能区分致病性和非致病性李斯特氏菌，因此，免疫磁性分析缺乏种间的特异性，不能消除交叉反应，与其他杂菌可能发生非特异性结合，仍需用溶血实验等生化实验进行进一步的验证。3.5环介导恒温扩增（LAMP)检测方法环介导恒温扩增（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是 NotomiT 等（2000）在 2000 年提出来的一种新的高效的核酸扩增技术，该技术的问世解决了基于核酸的分子生物学检测技术的诸多难题，使快速、灵敏、特异检测方法成为可能。该方法是根据单核细胞增生李斯特氏菌特有的靶序列vir 基因设计的两对特殊的内、外引物，特异性识别靶序列上的六个独立区域，利用Bst酶启动循环链置换反应，在vir 基因序列启动互补链合成，在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎-环DNA混合物；从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2+结合，产生副产物（焦磷酸镁）形成乳白色沉淀，加入显色液，即可通过颜色变化观察判定结果。