质粒比对结果分析

1、DNA测序结果比对实例：从测序公司得到的一份DNA测序结果通常包含.seq格式的测序结果序列文本和.ab1格式的 测序图两个文件，下面是一份测序结果的实例：CYP3A4-E1-1-1(E1B).ab1CYP3A4-E1-1-1（E1B）.seq.seq文件可以用系统自带的记事本程序打开，.ab1文件需要用专门的软件打开。软 件名称：Chromas软件Chromas下载.seq文件打开后如下图：.ab1文件打开后如下图:ExportFt ini通常一份测序结果图由红、黑、绿和蓝色测序峰组成，代表不同的碱基序列。 测序图的两端（下图原图的后半段被剪切掉了）大约50个碱基的测序图部分通 常杂质的干扰

2、较大，无法判读，这是正常现象。这也提醒我们在做引物设计时， 要避免将所研究的位点离PCR序列的两端太近（通常要大于50个碱基距离），以免测序后难以分析比对。我的课题是研究基因多态性的，因此下面要介绍的内容也主要以判读测序图 中的等位基因突变位点为主。实际上，要在一份测序图中找到真正确实的等位基因多态位点并不是一件容 易的事情。一般认为等位基因位点假如在测序图上出现像套叠的两个峰，就是杂 合子位点。实际比对后才知道，情况并非那么简单，下面测序图中标出的两个 套峰均不是杂合子位点，如图并说明如下：100 .110120寸史能导博既 C - T C C T C T T T C C T T C C T

3、从测序公司得到的一份DNA测序结果通常包含.seq格式的测序结果序列文本和.ab1格式 的测序图两个文件，下面是一份测序结果的实例：CYP3A4-E1-1-1(E1B).ab1CYP3A4-E1-1-1(E1B).seq软件.seq文件可以用系统自带的记事本程序打开，.ab1文件需要用专门的软件打开。名称：Chromas软件Chromas下载.seq文件打开后如下图：.ab1文件打开后如下图：通常一份测序结果图由红、黑、绿和蓝色测序峰组成，代表不同的碱基序列。测序图 的两端（下图原图的后半段被剪切掉了）大约50个碱基的测序图部分通常杂质的干扰较大， 无法判读，这是正常现象。这也提醒我们在做引物

4、设计时，要避免将所研究的位点离PCR序 列的两端太近（通常要大于50个碱基距离），以免测序后难以分析比对。我的课题是研究基因多态性的，因此下面要介绍的内容也主要以判读测序图中的等位基因突变位点为主。实际上，要在一份测序图中找到真正确实的等位基因多态位点并不是一件容易的事 情。一般认为等位基因位点假如在测序图上出现像套叠的两个峰，就是杂合子位点。实际 比对后才知道，情况并非那么简单，下面测序图中标出的两个套峰均不是杂合子位点，如图并说明如下:12011010D中无 用与k + gnc C T C CT . C rr T T C C T T C C T说明：第一组套峰，两峰的轴线并不在同一位置，左

5、侧的T峰是干扰峰；第二组套峰，虽 两峰轴线位置相同，但两峰的位置太靠近了，不是杂合子峰，蓝色的C峰是干扰峰。通常 的杂合子峰由一高一略低的两个轴线相同的峰组成，此处的序列被机器误判为“C”，实际 的序列应为“人，通常一个高大碱基峰的前面12个位点很容易产生一个相同碱基的干扰峰， 峰的高度大约是高大碱基峰的1/2，离得越近受干扰越大。一个摸索出来的规律是：主峰通常在干扰峰的右侧，干扰峰并不一定比主峰低。最关键 的一点是一定要拿疑似为杂合子峰的测序图位点与测序结果的文本序列和基因库中的比对 结果相比较；一个位点的多个样本相比较；你得出的该位点的突变率与权威文献或数据库中 的突变率相比较。通常，对于

6、一个疑似突变位点来说，即使是国际上权威组织大样本的测序结果中都没 有报道的话，那么单纯通过测序结果就判定它是突变点，是并不严谨的，因一份PCR产物 中各个碱基的实际含量并不相同，很难避免不产生误差的。对于一个未知突变位点的发现， 通常还需要用到更精确的酶切技术。DNA套峰分析1、测序结果有很多套峰（出现很多N）,为什么？（见图4）答：模板或引物的原因都可能造成套峰的形成，原因如下：A、DNA模板上出现二处以上的测序引物结合位点B、模板不纯，如果是质粒或是菌液，原因是非单克隆，如果是PCR，原因为非特异性条带C、模板序列的特殊结构，如poly结构，发卡结构、严重的重复序列等D、引物降解，引物不纯

7、，或引物的特异性不好2、为什么用PCR产物测序时，经常会出现套峰现象？PCR产物测序出现套峰现象，一般有以下几种原因：（1）PCR用模板不纯或PCR用引物特异性不好，扩增出的产物除了目的片段外，还有与目 的片段长度相近的片段，即使用凝胶电泳也无法分离开，这样的PCR产物测序结果是套峰。（2）结构上的原因，造成了 PCR产物测序出现套峰的现象。PolyA/G/C/T以及原因不明的复 杂结构的存在，都会出现测序结果套峰的情况。3、G/C rich、G/C Cluster：这种情况一般表现为测序信号突然减弱或消失（见图1）；4、A、T的连续结构：这种情况一般表现为A、T连续结构后面的测序结果出现套峰（见图 2）。根据文献记载，原因在于聚合酶进行聚合反应时，由于A或T的连续，聚合酶难以识别 完整的每个A或T，在某个A或T的后面便开始进行A或T连续结构以后序列的聚合反应（打 滑现象），造成测序结果紊乱，出现套峰。出现这样的情况，建议反向测序。 一般来说， PCR片段直接测序时，A或T的连续结构后面的序列测序结果都会出现套峰。原因在于测序 时经历了 PCR反应及测序反应（测序反应本身也是PCR反应）二次聚合酶的打滑现象。3）原因不明的复杂结构，测序结果出现突然信号减弱或消失。从序列上看，DNA碱基排列并 无特别异常。估计是DNA整体出现复