对MGC803胃癌细胞株癌基因表达及调控的实验研究

1、对MGC-803胃癌细胞株癌基因表达及调控的实行研究孟红子李日镛孙抒金昌范肿瘤分子生物学研究表白，肿瘤的产生、生长是一个多阶段、多基因变异所致的病理历程，包罗原癌基因的激活、抑癌基因的失活以及细胞凋亡相干基因的变异。比年来，创造一些细胞因子作为诱导剂，启动肿瘤细胞分化，某些细胞因子具有改变肿瘤细胞癌基因表达。有学者报道1，滋扰素可淘汰肿瘤细胞ras癌基因的表达，重组人肿瘤坏死因子rTNF低落卵巢癌3A细胞-erbB-2卵白表达2。本文应用原位分子杂交法及免疫构造化学SP法检测了G-803胃癌细胞P53、AP、-Ha-ras、-fs基因，并以其为模子，不雅察rTNF、rIL-2、rIL-6、60

2、放射线对上述基因的表达调控作用，以探究这些生物应答调治剂对癌基因表达的影响及其抗肿瘤机制，为进一步临床应用提供实行根据。1质料与要领1.1重要试剂RPI-1640为LifeTehnlgies公司产物，rIL-2、rIL-6为北京四环医学高技能开拓部产物，rTNF为邦定生物医学公司产物。-fs抗体为Santaruz公司产物，抗为生物素标识表记标帜的抗兔IgG，抗为辣根过氧化物酶标识表记标帜的链霉卵白素。抗及抗均为美国VETR公司产物。原位分子杂交所用的P53、AP、-Ha-ras生物素标识表记标帜探针均购自北京医科大学病理学教研室，BIP/NBT为美国ZYED公司产物。1.2肿瘤细胞G-803胃

3、癌细胞株由中国医科大学肿瘤研究所张荫昌传授提供，由本室传代。1.3rIL-2、rIL-6、rTNF对G-803胃癌细胞的作用将贴壁生长的G-803胃癌细胞株用0.25%胰酶消化，分在差异方瓶中传代造就，细胞进入指数生恒久时别离加rTNF1104U/l，rIL-6500U/l，rIL-25000U/l，比较组不加药，造就6、12、24、48h别离取出制片。1.460放射线照耀传代造就的G-803胃癌细胞进入指数生恒久时照耀60，照耀剂量为100Gy。造就6、12、24、48h别离取出制片。1.5免疫构造化学SP法按通例操纵，DAB显色，每次实行均设阳性和阴性比较，-fs阳性信号漫衍在胞核及胞浆，

4、阳性率确定按文献4，5举行。1.6原位分子杂交用不含探针的杂交缓冲液42孵育12h，然后滴加含探针的杂交液2g/l，覆盖玻片，95共变性15in，随即反响举行，42水浴箱留宿1216。扫除未结合的探针，滴加碱性磷酸酶标识表记标帜的链霉卵白素BIP/NBT显色，阴性比较设显色阳性片子不加探针。P53、-Ha-ras阳性信号均漫衍在胞浆及胞膜内。参照文献3，4确定阳性率。1.7统计学要领两样本率比力的2查验。2效果2.1G-803胃癌细胞癌基因表达P53及AP基因均为阴性。-Ha-ras及-fs基因均高表达。-Ha-rasRNA表达阳性率为99%，-fs卵白表达阳性率为98%。2.2rTNF对G-

5、803胃癌细胞P53、-Ha-ras、-fs基因的影响rTNF同G-803胃癌细胞共育后6hP53重现，以后渐渐消散，而-Ha-ras和-fs-开始表达而渐渐低落。见表1。Table1TheeffetfrTNFntheexpressinfP53-Ha-ras-fsG803ells略注:%:psitiveells/200ells;:paredithntrlP0.013讨论胃癌的产生、生长是多因素、多阶段、多基因变异所致的癌变历程5。据文献报道，与胃癌有关的基因有-et、ras、-erB-2、P53、AP、D等，G-803胃癌细胞株也有多种基因表达非常。3.1检测G-803胃癌细胞株癌基因表达原癌

6、基因的活化和抑癌基因的失活是肿瘤产生、生长的根底缘故原由之一。种种癌都有差异癌基因的表达，G-803胃癌细胞株泉源于人胃低分化粘液腺癌，形态学特性是上皮性肿瘤。经检测创造本细胞株有-Ha-ras与-fs癌基因高表达，说明这些癌基因已被激活。ras基因的编码产物具有GTP酶活性，它的过分表达能启动和加快细胞的增殖，直到引起细胞的恶性转化。fs基因产物是一种脱氧核糖酸结合卵白，有基因转录调控的作用。fs基因的过分表达，可导致细胞恶性转化及肿瘤形成。肿瘤专家们更多地存眷抑癌基因的变革，以为抑癌基因的缺损和失活是肿瘤产生的根底缘故原由。对本细胞株基因检测创造，P53及AP基因均无表达。张青云等6用PR

7、要领，对4种人胃癌细胞系举行P53基因变异的检测创造，两种细胞系无P53基因序列的非常。本实行检测P53基因RNA为阴性，说明它虽以野生型情势存在，但大概因某种缘故原由处于封闭状态，不起细胞生长的负调治作用，从而肿瘤细胞得以生长。别的，与胃癌产生有关的抑癌基因有AP基因。崔建涛等7用PR要领对4株胃癌细胞系基因检测创造，均有5号染色体长臂缺失。AP基因定位于5号染色体长臂上，说明本细胞株有AP基因缺失，本实行效果与之符合。G-803胃癌细胞株是80年代建起的细胞系，重复冻存，清醒屡次，在造就体系中生长活泼，恶性度高，有浩繁基因非常表达。除上述4种基因以外，还大概存在更多的基因改变，相识所造就癌

8、细胞株的特定基因表达或变异，在抗肿瘤药物的开拓及其作用机理的研究中具有紧张意义。3.2rTNF、rIL-6、rIL-2、60放射线对G-803胃癌细胞基因表达的调控肿瘤坏死因子Turnersisfatr，TNF是具有多种生物学活性的细胞因子。TNF的生物学活性比当初想象要普及得多8，在体内、体外均可杀伤或按捺某些肿瘤，还能分化诱导某些肿瘤细胞，对癌基因表达起调控作用9，10，并可诱导细胞凋亡。有学者11在研究TNF对E-180人宫颈癌细胞株的影响时创造，TNF对E-180有细胞毒性作用，同时他们还检测到了DNA的裂解片断，从而以为TNF的细胞毒性是通过凋亡来实现的。1994年，Gtlieb等1

9、2在TNF-r对卵巢癌细胞作用的研究中创造其能诱导细胞凋亡，同时还检测出有P53的加强表达，两者有显着的剂量相干干系。本实行也创造TNF具有诱导P53基因表达的作用，支持TNF的细胞毒性及诱导凋亡与P53有关的不雅点。TNF与细胞打仗后并不直接损伤细胞膜，而大概通过受体机制发挥作用。不通过细胞膜把TNF注入细胞浆内无杀伤作用。本实行表白，TNF直接作用于肿瘤细胞可诱导P53基因，按捺已被激活的原癌基因表达，大概也是通过与肿瘤细胞外貌的TNF受体结合而发挥作用。野生型P53是抑癌基因，到场DNA复制的负调治。约有半数肿瘤构造未创造P53基因，多种抗癌剂可诱导P53基因，同时按捺一些与细胞增殖、转

10、化有关的癌基因表达13。本实行创造rTNF显着诱导G-803胃癌细胞P53基因，按捺与细胞恶性转化及增殖有关的-Ha-ras、-fs基因表达。野生型P53基因导入膀胱癌细胞的研究效果提示，细胞内有足量的野生型P53基因表达，能在转录程度上按捺ras基因表达，通过调控突变的ras基因表达，按捺膀胱癌细胞的恶性增殖14。据报道，TNF按捺K562细胞原癌基因-fs转录。由此推理，TNF大概与肿瘤细胞外貌的TNF受体结合后诱导野生型P53，一方面诱导和促进细胞凋亡，另一方面按捺一些与细胞恶性转化及增殖有关的癌基因的表达来起抗肿瘤作用。白细胞介素6IL-6是一种具有多种成效的细胞因子，除到场免疫调治和

11、造血调控处，还到场机体的抗肿瘤免疫。比年来创造IL-6对多种肿瘤细胞有显着的按捺或杀伤用用，在抗肿瘤免疫方面表示出很大的潜力。本实行创造rIL-6按捺-Ha-ras转录及-fs卵白的表达，大概对G-803胃癌细胞的生长及增殖具有按捺作用。白细胞介素2IL-2是最紧张的细胞因子之一，其抗肿瘤作用的研究，不停引导着肿瘤生物免疫治疗的标的目的。据报道，IL-2险些不直接作用于肿瘤细胞，与T细胞和NK细胞的受体结合，促进这些细胞增殖，而表示出抗肿瘤活性，本实行创造rIL-2直接作用于G-803胃癌细胞，低落-fs卵白的表达。关于IL-2和IL-6对癌基因表达调控的研究，尚未深化，有待于进一步研究。本实

12、行创造60放射线照耀的肿瘤细胞，在被照耀初期不表达任何基因，大概是射线直接作用于细胞核，粉碎和裂解DNA而杀伤肿瘤细胞有关。射线照耀后造就一按时间，部门存活的癌细胞重新表达ras和fs基因，说明肿瘤细胞有相干强的DNA修复本领，这大概是临床上放疗后每每复发的机理之一。4吴克复，宋玉华，郑国光，等.人白血病细胞系J6-1基因表达的调控.中华血液病杂志，1993，142:76.8ShalabyR，aggaralBB，rinderknehtE，etal.ativatinfhuanplyrphnulearneutrphilfuntinsbyinterfern-randturnersisfatr.JIu

13、nl，1985，135:2069.9袁跃传，沈素云.rh-TNF-对HL-60细胞分化诱导与-y基因转化的研究.中华血液病杂志，1994，151:25.10李兴富.肿瘤坏死因子按捺K562细胞原癌基因-y，-fs的转化.山东医科大学学报，1990，282:31.11anhesterK，Hestn-D，Dnner-DB.Turnersisfatr-induedyttxiityisapaniedbyintraellularitgenisignalsinE-280huanervialarinaells.BiheJ，1993Feb15:290:185-190.12GtliebH，atsnJ，RezaiBA.ytkineindueddulatinftursuppressrgeneexpressininvariananerells:up-regulatinfP5