G0期淋巴细胞暴露于γ射线DNA损伤应答基因转录谱教学文稿

1、Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。G0期淋巴细胞暴露于射线DNA损伤应答基因转录谱-G0期淋巴细胞暴露于射线DNA损伤应答基因转录谱摘要电离辐射引起人类细胞大量的DNA损伤，这可能改变mRNA表达水平。我们已经分析了全血中参与G0/G1检查点通路的DNA损伤应答基因的mRNA表达谱，从而评估它们的放射适应性反应，如果有射线。血液样本是从25个随机的正常的健康的男性捐赠者收集的，并有书面的知情同意，照射剂量在0.1-2.0Gy(0.7Gy/min)。利用彗星实验研究DNA链断裂，而用H2AX作为生物标志物可以将DNA双链断裂可视化。如果存

2、在剂量反应，研究照射后1h和5h所有剂量组的转录水平。在三个不同的吸收剂量(0.1、0.3和0.6Gy)分别研究转录水平的适应反应，然后是4h后具有挑战性的剂量2.0Gy。对于两个实验，从照射全血获得的PBMCs分离总的RNA，反转录成cDNA。用实时定量PCR研究ATM、ATR、GADD45A、CDKN1A、P53、CDK2、MDM2和CyclinE的mRNA表达水平。利用彗星实验观察到尾部DNA损伤百分比以剂量依赖方式显著增加。在H2AX观察到焦点数量随剂量增加。照射后5h观察到，高达1Gy时，GADD45A、CDKN1A和P53基因在转录水平上调呈明显的剂量依赖方式(P0.05)。在CD

3、K2、CyclinE和P53观察到mRNA表达水平的放射适应反应，而ATM、ATR、GADD45A、MDM2、ATM和ATR表达谱没有显示任何放射适应性改变。参与G0/G1检查点通路的DNA损伤基因对体内放射敏感性有重要意义，转录表达谱的改变可能对适应反应机制的理解提出新的见解。关键词人类外周血单核细胞（PBMC）.mRNA.相对定量.实时定量PCR.射线照射前言众所周知，包括电离辐射在内的环境诱变因素对人类正常的细胞功能具有极大挑战。电离辐射引起DNA损伤的范围包括单链和双链断裂，DNA交联，人类细胞分离和聚集的DNA损伤。双链断裂（DSB）和聚集的DNA损伤高度有害，有时候DNA错配可能导

4、致染色体异常和基因突变。然而，人类细胞高效的DNA修复机制通过调节各种细胞和分子机制维持基因组的完整性。利用生物标志物监测高水平自然背景辐射暴露的人口总数或个人的职业暴露。例如染色体畸变（尤其是双中心粒）或微核。最近几年，努力建立分子生物标志物去确定辐射特征。利用三种生物标志物的适应性研究可能有助于从电离辐射暴露总人群确定辐射敏感性和辐射抵抗性的个体。电离辐射的细胞反应是由大量基因介导的，它们控制复杂的调节通路。这些通路可能导致细胞周期延迟、凋亡和DNA修复。电离辐射应答基因表达改变是DNA损伤的指标之一。虽然一些研究这已经研究了对辐射暴露的应答基因DNA损伤的表达模式，但是大部分研究探索不同

5、种类的细胞系，正常人类的成纤维细胞和皮肤活检。人类外周血单核细胞(PBMCs)是体外研究理性的选择。很少有关静止淋巴细胞（G0）这些DNA损伤应答基因的转录水平模式。在分裂的细胞，电离辐射诱导DNA损伤，通过运动失调血管扩张调节DNA损伤反应，突变（ATM）和ATR(ATM和Rad3相关的)蛋白激酶属于丝氨酸苏氨酸激酶。ATM/ATR激活后，p53发生磷酸化，其活化诱导GADD45A和CDKN1A(p21)导致G1期阻滞。在这个过程中，参与的其它基因有MDM2、CDK2和CyclinE，它们可能在G1期检查点阻滞发挥重要作用。在这篇文章，我们研究静止淋巴细胞这些基因的转录状态。研究的基因的特征

6、如下：细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1a(CDKN1A)也被称为p21，它抑制细胞周期蛋白激酶活性，这是通过p53在转录水平严格调控的。生长阻滞和DNA损伤诱导基因（GADD45A）是GADD家族中电离辐射频繁诱导的唯一成员，它参与DNA修复、染色体完整性的维持、细胞周期调控和凋亡。P53（也称为TP53）调节细胞周期、DNA修复和凋亡。虽然在正常细胞，p53蛋白水平低，但是DNA损伤反应可能增加p53蛋白水平。ATM和ATR是两个信号分子，它们通过含有丝氨酸或苏氨酸残基磷酸化在DNA损伤位点招募响应电离辐射。细胞周期蛋白依赖性激酶是丝氨酸/苏氨酸激酶的同分异构体，它通过细胞周期蛋白的帮助调控细

7、胞周期进程。细胞周期蛋白E/CDK2复合体使p27（细胞周期蛋白D的抑制剂）磷酸化，标记它的降解。MDM2是p53重要的负向调节者。DNA损伤后，紧接着MDM磷酸化导致p53稳定。这项研究的目的是评估参与G0/G1检查点通路的DNA损伤应答基因的mRNA表达水平是否存在剂量反应。此外，我们试图评估人类血在静止期（G0）对电离辐射反应的这些基因的转录模型是否存在适应反应。针对这些疑问，利用碱性的彗星实验研究PBMCsDNA链断裂的DNA损伤量。由于一些组织蛋白转录后修饰，特别是DNA损伤反应中Ser139残基H2AX的磷酸化，我么也尝试利用H2AX作为生物标志物研究PBMCs中DNADSB是否形

8、成或可视化。最后，研究PBMCs暴露于不同剂量的射线照射的剂量反应和适应反应。材料和方法血液样本收集和伦理声明静脉血液样本使用含有EDTA无菌的采血管从25个随机的健康男性捐赠者（不吸烟）收集，年龄在25-40岁。所有捐赠者都给予了知情同意，这项实验得到医学伦理委员会、巴巴原子能研究中心（BARC）、Trombay和Mumbai的允许。剂量反应和适应反应实验都进行。样本照射和从血中分离PBMCs对于DNA损伤实验，利用血液照射机2000(BoardofRadiationandIsotopeTechnology,Mumbai,India)使用60CO源以70cGy/min分5个剂量组0.1,0.

9、3,0.6,1.0,and2.0Gy照射血液样本，设立阴性照射对照。根据生厂商的说明，利用Histopaque1077(SigmaAldrich,StLouis,USA)根据梯度离心法从照射的全血分离PBMCs。DNA损伤定量我们进行碱性彗星实验定量上面提到剂量组的DNA链断裂。H2AX是DSB特定的生物标志物，利用它也进行剂量反应实验。用彗星实验测量DNA链断裂碱性彗星实验被用于定量DNA链断裂。此法的要求如下：融化的琼脂糖（1%）堆积到磨砂的玻片作为基础层。使用盖玻片盖住，保持在4直到它凝固。PBMCs(1105/mlcells/ml)和0.5%融化的琼脂糖(lowmelting,Sigm

10、aAldrich,USA)以1:10(v/v)在37轻轻混匀。基础层凝固后，融化的琼脂糖中的细胞混合物(250ul)在玻边上扩散。注意玻片上琼脂糖区域基础层样本的扩散。玻片放在平面上在黑暗中保持30min以促进样本的凝固。含有细胞层的琼脂糖凝固不久后，移除盖玻片，进行裂解步骤。玻片进入新鲜制备的预冷的裂解液中(2.5MNaCl,100mMEDTA,10mMTrizmabase,10%DMSO,and1%Triton-X-100,pH10.0)，在4保存20min。裂解步骤结束后，去除玻片多余的缓冲液，浸入新鲜制备的碱性溶液，pH13.0，含有0.6gNaOH和20mMEDTA，在黑暗中室温保存

11、30min。最后玻片从碱性溶液转移到水平电泳仪，玻片平放在凝胶盘上，和电极等距离。碱性电泳液含有12gNaOH和500mMEDTA(pH8.0)，小心将它倾倒进电泳缓冲槽中直到溶液的水平面淹没样本玻片。电泳在20V300mA进行20min。电泳结束后，玻片在中性缓冲液(0.4MTrisHCl,pH7.5)中冲洗5min。将玻片用70%酒精固定，在空气中干燥，使用1SyBr绿色染料染色。使用荧光显微镜(NikonEclipseTi-Uinvertedmicroscope,Japan).放大20倍在黑暗中观察。随机选择100个细胞（每个玻片50个）使用TriTekCometScoreTMVersi

12、on1.5定量。图1显示了各种剂量组的图像。不同剂量组DNA损伤尾部定量用图2的柱状图显示。使用磷酸化H2AX检测DNA损伤我们把磷酸化的作为生物标志物，使用共焦显微镜检查DNADSB。检测H2AX焦点的方法如前面描述的要求。静脉血液样本从随机的健康的个体收集，用0.1、0.3、0.6、1.0和2.0Gy照射，设立阴性照射对照。简单地说，要求如下：从照射的全血分离PBMCs，照射后在37培养30min，然后在冰上用1%甲醛固定15min，随后在70%的酒精中培养2h。关于通透性，也在1%BSATriton-X-100PBS溶液（牛蛋白血清和Triton-X-100的磷酸缓冲盐的混合物）中培养细

13、胞。在4含有Anti-phospho-HistoneH2AX(Ser139)和05-636(Millipore,Temecula,CA,USA)10g/ml的1%BSATri-ton-X-100PBSsolution(BSATPBS)中培养细胞过夜。过夜培养后，使用含有0.05%Tween20的1%BSATPBS溶液冲洗细胞，使用AlexaFluor488标记的RabbitAnti-mouseantibodyA-11059Molecularprobes(Invitrogen,Eugene,Oregon,USA)培养。标记的细胞稀释成浓度为1(106cells/ml)，100l悬浮液倾倒在涂有P

14、oly-L-Lysine的盖玻片(BioCoatTM354085,BDBiosciences,India)上，在黑暗中室温保存30min。经过细胞的适当粘附性，BSATPBSTween20溶液冲洗盖玻片2次。利用ProlongGoldAntifadeDAPI试剂和DAPI,P-36935,分子探针(Invitrogen,Eugene,Oregon,USA)将盖玻片盖在玻璃片上，在共焦显微镜(CarlZeiss,Model-LSM510Meta,Germany)下观察。图2显示了剂量和H2AX焦点增加相关的信息。总RNA的提取和cDNA的制备以及mRNA表达的分析从PBMCs提取总的RNA研究了

15、0.1、0.3、0.6、1.0和2.0Gy(剂量率70cGy/min)剂量组的DNA损伤应答基因的基因表达谱。在1和5h从照射的全血分离PBMCs，使用HipuraRNA提取试剂盒(HimediaLaboratoryPvt.Ltd.Mumbai,India)从PBMCs提取总的RNA。（因为从全血分离PBMCs需要1h，培养0和4h观察基因表达谱，因此表达视为1和5h。）此外，对这些基因进行适应反应研究。分别用3个不同的吸收剂量(0.1、0.3和0.6Gy)照射全血，其次是4h后2.0Gy的攻击剂量。分别从每个血液样本提取总的RNA，给予吸收剂量，其次是4h后2.0Gy的攻击剂量。使用pico

16、dropMicrolitre分光光度计定量RNA，在260/280nm检查纯度。RNA的完整性用0.8%的琼脂糖凝胶和溴化乙锭染色检查。轮廓清楚的28S和18S条带的RNA样本作为合成cDNA。cDNA合成和实时定量PCR（RT-qPCR）对于每一个等份样本，利用转录子高保真cDNA合成试剂盒(RocheDiagnostics,GmbH,Germany)将总RNA(250ng)反转录成cDNA。进行RT-qPCR定量选择基因(ATM,ATR,CDKN1A,GADD45A,P53,MDM2,CDK2,andCyclinE)mRNA的表达水平。利用LC480实时定量PCR仪(RocheDiagno

17、stics,GmbH,Germany)在96多孔板上进行RT-qPCR。重复进行所有的反应，使B-Actin和B2M正常化。在基线表达没有观察到显著的变化。因此，利用肌动蛋白作为所有基因的相对量。所有的引物设置从美国的Sigma-Aldrich获得。表1列出了本研究的引物序列。每一个RT-qPCR反应都在在总体积为0.25mMofeachdNTPs(RochediagnosticsPvt.Ltd.GmbH,Germany),0.5UofFastTaqDNApolymer-ase(RocheDiagnosticsPvt.Ltd.GmbH,Germany),5.0pmolsofbothforwar

18、dandreverseprimers,and0.39ofSYBRgreen(SigmaAldrich,USA)中进行。所有基因进行实时定量q-PCR共40个循环，步骤如下:在95预培养5min，然后95变性10s，59退火30s，72延伸30s。熔解曲线分析分三步完成：95熔化5min，然后59退火1min，72延伸，最后一步在4010s。进行溶解曲线分析也确保扩增的DNA是感兴趣的产物。利用LC480软件1.1进行相对定量。结果用Pfaffle表述的标准化率表示。Normalizedratioconc:target=（conc:reference）sample:（conc:target=co

19、nc:reference）calibrator.统计分析对对照和照射样本的平均表达水平进行配对t检验。对1和5h照射血液样本的所有8个基因的mRNA表达水平进行回归分析研究相关性。利用SigmaStat软件进行统计分析。结果研究照射全血的DNA损伤和mRNA表达模式的水平，它们暴露的剂量组是0.1和2.0Gy，设立阴性照射对照。利用单细胞凝胶电泳（彗星实验）对这些个体进行DNA链断裂定量，特别是尾部DNA百分数。如图2显示，在DNA损伤尾部观察到随剂量点有明确的剂量反应。它很好地补充了图3显示H2AX焦点信息随剂量增加。研究了在1和5h同一剂量组照射全血8个DNA损伤应答基因的转录表达模式。A

20、TM、ATR、CDKN1A、GADD45A、P53、MDM2、CDK2和CyclinE的相对量利用肌动蛋白基因标准化。比较照射后1和5h这些基因的平均相对表达，用直方图表示（图4a-h）。我们的结果显示，达到1.0Gy，当5h时，GADD45、CDKN1A和P53有明确的照射剂量反应，与1h相比，2.0Gy时的表达水平下降。进行配对t检验研究1和5h时表达水平的显著性。ATM显示表达谱在0.3、0.6和1.0Gy(P=0.04）有轻微增加，但是在2.0Gy没有观察到表达水平的显著变化。达到1.0Gy时，ATR转录谱没有显示任何增加反应，当2.0Gy5h显著上调。至于MDM2，在0.32.0Gy

21、5h(P=0.03)观察到显著的转录变化。关于CDK2，所有剂量组的表达水平都有轻微增加，但是不显著。在5h，CyclinE在所有剂量组(P=0.02)都显示显著上调，与1h相比，并没有观察到显著性。达到1.0Gy，8个基因中的3个基因(GADD45A,CDKN1A,andP53)表达水平显示显著增加趋势(P0.05)。我们进行回归分析找出在1和5h观察表达模式的关联。ATR(R=0.956,P=0.03)、CDK2(R=0.953,P=0.03),和CDKN1A(R=0.995,P=0.001)表达谱的趋势检验显示显著差异。适应反应研究对样本进行基因表达分析，使用吸收剂量处理样本：0.1、0

22、.3和0.6Gy，然后利用攻击剂量2.0Gy评估适应反应，如果存在在图5a，b显示在本研究中，认为吸收剂量是0.1、0.3和0.6Gy，在ATM、ATR、MDM2、GADD45A和CDKN1A没有观察到适应反应。然而，CyclinE、CDK2和P53显示适应反应(P0.05)。ATM显示适应反应，但是在吸收剂量0.1和0.3Gy不显著，其次是攻击剂量2.0Gy。在0.3Gy吸收剂量，ATR显示和2.0Gy观察到的表达相似的表达。有趣的是，虽然CDKN1A表达谱显示依赖剂量增加，但是在3个吸收剂量的一个都没有观察到适应反应。类似地，在0.1和2.0Gy时，GADD45A表达谱显示上调增加。但是在

23、3个吸收剂量的一个都没有观察到适应反应。P53在所有剂量组也显示上调增加，但是只有在吸收剂量0.1Gy时显示适应反应。CDK2在0.3和0.6Gy显示适应反应。但是在吸收剂量0.1Gy时显示和2.0Gy相似的表达。CyclinE在所有的三个剂量组都显示稳定的适应反应。MDM2完全不显示适应反应。讨论哺乳动物细胞具有对包括电离辐射的生理和基因毒性应激的复杂分子反应。许多这样的反应是通过基因表达改变介导的。大部分对电离辐射基因表达调节的先前研究是利用高剂量暴露进行的，但是从治疗或环境剂量的角度来看，这与来自低剂量暴露的数据相关。利用DNA损伤相关mRNA水平表达谱评估个体对电离辐射的敏感性，这对人

24、群监测、职业的和放疗接触人群非常重要。研究已经证明，正常人群辐射应答基因的基线表达水平广泛变化。人群中的辐射敏感性和辐射耐受性个体可能易于有这种变化。电离辐射导致人类细胞DNA损伤谱。低和高LET照射都导致独立和集群的DNA损伤，后者更复杂。集群损伤可能是DSB或没有DSB的氧化集群DNA损伤，这在非常低的剂量时可能引起。然而，这些复杂的损伤很难修复。此外，在这种暴露下，集群DNA损伤的过程可能产生DSBs。并不知道这些结果表达水平的结果。通过碱性彗星实验可以测量非DSB损伤；而DSBs损伤可以通脉冲场电泳和中性彗星实验检测。PBMCs可用的资料有限，因此，我们曾经努力研究在这样的暴露下是否可

25、以检测和诱发链断裂和DSBs。利用彗星实验和H2AX生物标志物，我们观察到DNA链断裂中DNA尾部的百分比随剂量增加而增加。类似地，我们观察到H2AX焦点形成随剂量增加而增加。在DNA损伤反应中，我们观察到，急性射线照射的正常个体，在照射后5h，其mRNA表达水平增加。我们已经证明CDK2和CyclinE有放射敏感性反应，p53与它们的mRNA表达水平无关。电离辐射的细胞反应由基因介导的，它们控制多方面的调节通路，包括细胞周期、凋亡和DNA修复。报道人类PBMCsp53、p21、DDB2、cyclinG1和GADD45等重要基因和一些凋亡基因如BAX和Bcl-2等有辐射转录反应。细胞周期调节基

26、因的转录调节与DNA损伤检查点的功能密切相关，基因表达的改变可能是诱发细胞周期阻滞的机制。在这项研究，我们发现，0.1和1.0Gy射线暴露后，P53、CDKN1A(p21)、GADD45A、CDK2和CyclinEmRNA表达水平显著上调。在此指出的是，这里使用的PBMCs不是增殖细胞。一些报告利用重点显示哺乳动物细胞辐射暴露的适应反应，例如突变、存活和染色体损伤。Olivieri等报道了体外低剂量电离辐射暴露时，人类淋巴细胞的适应反应。然而，这些基因转录水平的适应反应并不知道。血液细胞适应反应的体外研究对人类健康有重要意义。它产生强大的分子防御机制从而激活或增强DNA修复机制。虽然辐射适应反

27、应发现后，在体外对人类细胞系进行了大量的分子研究，但是PBMCs的可用资料有限。在这项研究中，我们研究了三个单独吸收剂量组的剂量反应关系和辐射适应性质，例如0.1、0.3和0.6Gy。一般来说，ATM和ATR是DNA损伤传感器，它们通过DNA损伤激活，参与与细胞周期检查点相关的信号通路并通过激活包括TP53的大量转录因子参与DNA修复。类似地，也显示射线也和诱发GADD45，证明X射线的五个基因存在剂量关系，换言之，CDKN1A、GADD45、MDM2、ATF3和BAX对2和50cGy的急性射线暴露有反应，他们发现，在剂量率较低时，GADD45A和CDKN1A被诱导的水平较低。有趣的是，ATM和ATR的表达水平没有显示任何变化。这个原因尚不清楚。这需要进一步探讨增值的淋巴细胞。我们已经证明人类血细胞0.1-2.0Gy体外辐射暴露可以诱发参与G0/G1检查点通路的DNA损伤应答基因的mRNA表达水平。利用单细胞电泳和H2AX的DNA损伤研究补充了我们的数据。图2显示尾部DNA损伤呈剂量依赖性增加。在这项