DNA复制09Convertor教学资料

1、Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。DNA复制09Convertor-第三篇基因信息的传递BiochemistryDepartmentDepartmentofBasicMedicalSciencesHangzhouNormalUniversityGuyisheng（flowofgeneinformation)基因（gene）：为生物活性产物（蛋白质或各种RNA）编码的DNA功能片段。基因表达（geneexpression）：基因转录与翻译的过程。中心法则：图示基因的信息传递第十章生物化学BiochemistryDNA的生物合成（复制）（D

2、NABiosynthesis，Replication)第一节复制的基本规律(BasicRulesofDNAReplication)复制的方式半保留复制(semi-conservativereplication)复制的高保真性(highfidelity)双向复制(bidirectionalreplication)半不连续复制(semi-discontinuousreplication)一、半保留复制(semiconservativereplication)（一）概念（二）实验依据：密度梯度实验（三）生物学意义：1.保证遗传信息传递的忠实性2.遗传和变异的统一DNA的生物合成（复制）遗传信息从亲代

3、DNA传递到子代DNA分子上，称为复制。DNA复制的最主要特征半保留复制：DNA生物合成时，母链DNA解开为两股单链，各自作为模板(template)按碱基配对规律，合成与模板互补的子链。子代细胞的DNA，一股单链从亲代完整地接受过来，另一股单链则完全从新合成。两个子细胞的DNA都和亲代DNA碱基序列一致。这种复制方式称为半保留复制。半保留复制半保留复制的意义DNA的半保留复制保证了DNA在代谢上的稳定性，经过许多代的复制，DNA多核苷酸链仍可保持完整，存在于后代而不被分解，这种稳定性体现了DNA遗传过程的相对保守性。遗传的保守性是相对的，而不是绝对的。自然界还存在着普遍的变异现象。二、双向复

4、制(bidirectionalreplication)原核生物复制时，DNA从起始点(origin)向两个方向解链，形成两个延伸方向相反的复制叉，称为双向复制。原核生物DNA的双向复制A.环状双链DNA及复制起始点B.复制中的两个复制叉C.复制接近终止点(termination,ter)真核生物DNA的双向复制真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子的复制。习惯上把两个相邻起始点之间的距离定为一个复制子(replicon)。复制子是独立完成复制的功能单位。真核生物的多复制子形式三、半不连续复制(semi-discontinuousreplication)顺着解链方向生成的子链，复制是连续进行

5、的，这股链称为领头链。另一股链因为复制的方向与解链方向相反，不能顺着解链方向连续延长，这股不连续复制的链称为随从链。复制中的不连续片段称为岡崎片段(okazakifragment)。领头链连续复制而随从链不连续复制，就是复制的半不连续性。半不连续复制图解领头链(leadingstrand)随从链(laggingstrand)图示四、需要RNA引物(primer)DNA聚合酶不能直接聚合游离的dNTP，必须由一段核酸片段提供3OH末端。由引物酶催化，由NTP为原料，合成RNA引物。第二节DNA复制的酶学（TheEnzymologyofDNAReplication）复制是在酶催化下的核苷酸聚合过程

6、，需要多种物质参与：底物：dNTP：dATP、dGTP、dCTP、dTTP聚合酶：依赖DNA的DNA聚合酶模板：解开成单链的DNA母链引物：RNA，提供3-OH末端，使dNTP可以依次聚合其他酶和蛋白因子：解螺旋酶、拓朴异构酶、引物酶、DNA连接酶、单链结合蛋白等一、复制的化学反应（形成磷酸二酯键）新链的延长只可沿53方向进行(dNMP)n+dNTP(dNMP)n+1+PPi全称：依赖DNA的DNA聚合酶（DNA-dependentDNApolymerase）（DNA-pol，DDDP）催化活性：53的聚合活性核酸外切酶活性二、DNA聚合酶聚合酶I：对复制中的错误进行校读，对复制和修复中出现的

7、空隙进行填补。聚合酶II：在无聚合酶I、III时起作用，功能未完全搞清楚。参与DNA损伤的应急状态修复。聚合酶III*：复制延长时真正催化新链核苷酸聚合的酶。（一）原核生物的DNA聚合酶比较酶图聚合酶*：在复制过程中起重要作用。具有引物酶活性。聚合酶：参与低保真度复制（相当于原核生物DNA-polII）。聚合酶：存在于线粒体，参与线粒体DNA复制。聚合酶*：在复制中起主要作用，延长子链（相当于原核生物的DNA-polIII）。有解螺旋酶活性。聚合酶：在复制中起校读、修复和填补缺口的作用（相当于原核生物DNA-polI）。（二）真核生物的DNA聚合酶比较DNA聚合酶除了有催化53核苷酸聚合的作用

8、外，还有核酸外切酶活性。外切酶有方向性：从5-端或3-端把核苷酸从核酸链上水解下来。DNA聚合酶I有两种方向的外切酶活性。DNA聚合酶I活性较强，在复制过程中能辨认错配的碱基并加以切除。DNA聚合酶III只有35外切酶活性。（三）核酸外切酶活性图示DNA复制的保真性主要依赖三种机制：1、遵守严格的碱基配对规律AT、CG2、聚合酶在复制延长中对碱基的选择功能3、复制出错时有即时的校读功能聚合酶III有35核酸外切酶活性三、DNA复制的保真性外切酶教读碱基四、复制中的解链及DNA分子拓扑学变化与DNA解旋和解链有关的酶和蛋白质：解螺旋酶（helicase）等DNA拓扑异构酶（DNAtopoisom

9、erase）单链DNA结合蛋白（singlestrandedDNAbindingprotein，SSB）引物酶（primase）解螺旋酶的作用是利用ATP供能来解开DNA双链。DnaB蛋白-解螺旋酶DnaA蛋白-识别复制起始点DnaC蛋白-辅助解螺旋酶，使其（DnaB）在起始点上结合并打开双链（一）DNA的解链图示DNA双螺旋链在复制过程中旋转速度很快，易造成DNA分子打结、缠绕、连环现象。复制末期，母链DNA与新合成链也会相互缠绕，形成打结或连环。拓扑异构酶分为I型和II型两种。拓扑异构酶对DNA的作用是既能水解，又能连接磷酸二酯键。使复制中的DNA能解结，达到适度盘绕。（二）DNA拓扑异构

10、酶图示作用机制：拓扑异构酶切断DNA双链中一股链，使DNA解链旋转不致打结；适当时候封闭切口，DNA变为松弛状态。反应不需ATP。拓扑异构酶切断DNA分子两股链，断端通过切口旋转使超螺旋松弛。利用ATP供能，连接断端，DNA分子进入负超螺旋状态。SSB的作用是在复制中维持模板处于单链状态并保护单链的完整（免受核酸酶降解）。SSB与DNA的结合具有协同效应（三）单链DNA结合蛋白（SSB）DNA聚合酶没有催化两个游离dNTP聚合的能力。因此，复制是在RNA引物的基础上加进脱氧核苷酸的。催化引物合成的是一种RNA聚合酶，它不同于转录过程的RNA聚合酶，所以称为引物酶（DnaG蛋白）。复制起始时，D

11、naA、DnaB、DnaC蛋白，还有其他复制因子，一起形成复合体，结合引物酶，形成较大的聚合体，再结合到模板DNA上，这种复合物称为引发体。（四）引物酶和引发体DNA连接酶连接DNA链3-OH末端和相邻DNA链的5-P末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的DNA链连成完整的链。复制中模板链是连续的，新链分段合成，是不连续的，最后留有缺口，要靠连接酶接合。连接酶的催化作用需要消耗ATP。五、DNA连接酶图示连接酶的功能DNA连接酶在复制中起最后接合缺口的作用。在DNA修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用。也是基因工程的重要工具酶之一。DNA聚合酶，拓扑酶和连接酶催化3,5-磷酸二酯键生成的比

12、较琰茞提供核糖3-OH提供5-P结果DNA聚合酶引物或延长中的新链游离dNTP去PPi(dNTP)n+1连接酶复制中不连续的两条单链不连续连续链拓扑酶切断、整理后的两链改变拓扑状态DNA合成从固定的起始点开始，同时向两个方向进行复制。（双向复制）真核生物的染色体庞大、复制，有多个复制起始点，同时形成许多复制的单位，两个起始点之间的DNA片段，称为一个复制子。复制是连续的过程，为描述方便，把它分为起始、延长、终止三个阶段。第三节DNA生物合成过程TheProcessofDNAReplication（一）复制的起始：1、DNA解链形成复制叉DnaA、DnaB、DnaC蛋白、SSB等参与。2、形成引

13、发体，合成引物引发体的蛋白质部分在DNA链上可以移动，并需要ATP供给能量。引发体到达适当位置就可按照模板的配对序列，催化NTP的聚合，生成引物。提供3-OH末端。一、原核生物DNA的合成过程DNA解链E.coli复制起始点oriC引发体和引物含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA复制起始区域的复合结构称为引发体。DnaADnaB、DnaCDNA拓扑异构酶引物酶SSB3535引物生成引物是由引物酶催化合成的短链RNA分子。3535引物引物酶1、脱氧单核苷酸（dNTP）逐个加入而延长DNA新链，其化学反应本质是生成磷酸二酯键。催化此反应的酶，在原核生物为DNA-polIII，真核生物为DNA

14、-pol和。新链延长的方向：53（二）复制的延长2、复制的半不连续性和冈崎片段DNA双链走向相反，而复制只能从53进行。因此，顺着解链方向而生成的子链，复制是连续进行的，称为领头链；另一股链的复制方向与解链方向相反，复制不连续进行，称为随从链。不连续复制的片段称为冈崎片段。领头链的合成领头链的子链沿着53方向可以连续地延长。随从链的合成全图同一复制叉上领头链和随从链由相同的DNA-pol催化延长阶段一阶段二阶段三阶段四DNA复制过程简图（三）复制的终止原核生物是环状DNA。双向复制的两子链在复制终止点处汇合。切除引物、填补空缺、连接切口复制中的不连续片段需连接成连续的子链先由RNA酶水解引物。

15、引物留下的空隙由DNA聚合酶I催化dNTP逐一自5向3端聚合而填补。最后，两不连续片段相邻的5-P和3-OH还有一个缺口，则由DNA连接酶加以连接。随从链不连续性片段的连接图示二、真核生物的DNA生物合成特点：DNA的复制只发生在S期多复制子真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子复制。复制有时序性，即复制子以分组方式激活而不是同步起动真核细胞含有5种DNA聚合酶端粒复制DNA合成期细胞能否分裂，决定于进入S期及M期这两个关键点。G1S及G2M的调节，与蛋白激酶活性有关。蛋白激酶通过磷酸化激活或抑制各种复制因子而实施调控作用。哺乳动物的细胞周期G1G2SM（一）复制的起始复制的起始需要DNA

16、-pol（引物酶活性）和pol（解螺旋酶活性）参与。还需拓扑酶和复制因子(replicationfactor,RF)。增殖细胞核抗原细胞周期蛋白(cyclin)，细胞周期蛋白依赖激酶(CDK)等。与原核基本相似增殖细胞核抗原（proliferationcellnuclearantigen，PCNA）在复制起始和延长中起关键作用。PCNA为同源三聚体，具有与E.coliDNA聚合酶的亚基相同的功能和相似的构象，即形成闭合环形的可滑动DNA夹子，在RFC的作用下PCNA结合于引物模板链；并且PCNA使pol获得持续合成能力。PCNA水平也是检验细胞增殖的重要指标。细胞能否分裂，决定于进入S期及M期

17、这两个关键点。G1S及G2M的调节，与蛋白激酶活性有关。蛋白激酶通过磷酸化激活或抑制各种复制因子而实施调控作用。相关的激酶都有调节亚基即细胞周期蛋白(cyclin)，和催化亚基即细胞周期蛋白依赖激酶(cyclindependentkinase，CDK)。CDK相匹配的周期蛋白作用点CDK2CyclinD1,D2,D3G1期CyclinEG1S期CyclinAS期CDK3和CDK4CyclinD1,D2,D3G2期CDK1（CDC2）CyclinA,BG2M期哺乳类动物的周期蛋白和CDK哺乳类动物细胞内还发现天然抑制CDK的蛋白质，例如锚蛋白(ankynin)是CDK4的特异性抑制物，P21蛋白

18、能抑制多种CDK。锚蛋白和P21蛋白的抑制/活化可使细胞周期开放/关闭，因此被形容为细胞周期的检查点(checkpoint)蛋白。（二）复制的延长发生DNA聚合酶/转换DNA-pol和pol分别兼有解螺旋酶和引物酶活性。在复制叉及引物生成后，DNA-pol通过PCNA的协同作用，逐步取代pol，在RNA引物的3-OH基础上连续合成领头链。随从链引物也由pol催化合成。然后由PCNA协同，pol置换pol，继续合成DNA子链。复制叉的延长图示（三）复制的终止和端粒酶染色体DNA呈线状，复制在末端停止。复制中岡崎片段的连接，复制子之间的连接。染色体两端DNA子链上最后复制的RNA引物，去除后留下空

19、隙。染色体两端DNA子链上最后复制的RNA引物，去除后留下空隙：切除引物的两种机制端粒是真核生物染色体线性DNA分子末端的结构。染色体DNA与它的结合蛋白紧密结合因而末端膨大成粒状。末端DNA序列是多次重复的富含G、C碱基的短序列。TTTTGGGGTTTTGGGG端粒在维持染色体的稳定性和DNA复制的完整性有重要作用。真核生物的端粒和端粒酶三种成分端粒酶RNA(humantelomeraseRNA,hTR)端粒酶协同蛋白(humantelomeraseassociatedprotein1,hTP1)端粒酶逆转录酶(humantelomerasereversetranscriptase,hTRT

20、)在端粒DNA复制上，端粒酶既有模板，又有逆转录酶这两方面的作用。端粒酶的组成：一种RNA-蛋白质复合物端粒酶的催化延长作用爬行模型DNA聚合酶复制子链进一步加工一、逆转录现象和逆转录酶逆转录是依赖RNA的DNA合成作用，即以RNA为模板由dNTP聚合成DNA分子。催化此反应的酶称为逆转录酶。第四节逆转录和其他复制方式（ReverseTranscriptionandOtherDNAReplicationWays）逆转录（reversetranscription）逆转录酶（reversetranscriptase）逆转录酶(reversetranscriptase)催化逆转录过程的酶称逆转录酶，

21、RNA病毒中都含有此酶。具有三种酶活性：RNA指导的DNA聚合酶RNA酶DNA指导的DNA聚合酶反应过程：先以单链RNA为模板，催化合成一条单链DNA，形成DNA-RNA杂化双链其中的RNA被RNA酶水解后再以新合成的单链DNA为模板，催化合成第二链的DNA。RNA病毒在细胞内复制成双链DNA的前病毒(provirus)。前病毒保留了RNA病毒全部遗传信息，并可在细胞内独立繁殖。在某些情况下，前病毒基因组通过基因重组(recombination)，参加到细胞基因组内，并随宿主基因一起复制和表达。这种重组方式称为整合(integration)。前病毒独立繁殖或整合，都可成为致病原因。分子生物学研

22、究可应用逆转录酶，作为获取基因工程目的基因的重要方法之一，此法称为cDNA法。以mRNA为模板，经逆转录合成的与mRNA碱基序列互补的DNA链。试管内合成cDNA:cDNAcomplementaryDNA逆转录研究的意义逆转录酶和逆转录现象，是分子生物学研究中的重大发现。逆转录现象说明：至少在某些生物，RNA同样兼有遗传信息传代与表达功能。对逆转录病毒的研究，拓宽了20世纪初已注意到的病毒致癌理论。逆转录酶基因工程中目的基因的获取滚环D环突变是指一个或多个脱氧核糖核苷酸的构成、复制或表型功能的异常变化，即遗传物质结构改变引起遗传信息的改变。从分子水平来看，突变就是DNA分子上碱基的改变在复制过

23、程中发生的DNA突变称为DNA损伤(DNAdamage)。第五节DNA损伤（突变）与修复DNADamage(Mutation)andRepair一、突变在生物界普遍存在突变是进化、分化的分子基础突变导致基因型改变突变导致死亡突变是某些疾病的发病基础二、引发突变的因素物理因素：紫外线、各种辐射化学因素：5-BU、羟胺类、亚硝酸盐、烷化剂如；嘧啶二聚体TT光修复三、突变的类型错配(mismatch)又称点突变（pointmutation）缺失（deletion）插入（insertion）重排（rearrangement）（一）错配转换：发生在同型碱基之间，即嘌呤代替另一嘌呤，或嘧啶代替另一嘧啶。颠

24、换：发生在异型碱基之间，即嘌呤变嘧啶或嘧啶变嘌呤。DNA分子上的碱基错配又称点突变。(pointmutation)图示（二）缺失(deletion)、插入(insertion)缺失：一个碱基或一段核苷酸链从DNA大分子上消失。插入：原来没有的一个碱基或一段核苷酸链插入到DNA大分子中间。缺失或插入都可导致框移(frame-shift)突变。框移突变是指缺失或插入（核苷酸）的突变，引起三联密码的阅读方式改变，造成蛋白质氨基酸排列顺序发生改变，其后果是翻译出一级结构完全不同的另一种蛋白质。图示（三）重组(recombination)DNA分子内较大片段的交换，称为重组或重排。移位的DNA可以在新位

25、点上颠倒方向反置（倒位），也可以在染色体之间发生交换重组。图示DNA损伤（突变）可能造成两种结果：其一是导致复制或转录障碍（如胸腺嘧啶二聚体，DNA骨架中产生切口或断裂）；其二是导致复制后基因突变（如胞嘧啶自发脱氨基转变为尿嘧啶），使DNA序列发生永久性改变。所以，必须通过进化使细胞拥有灵敏的机制，以识别和修复这些损伤，否则细胞无法维持正常代谢。体内DNA的损伤修复机制主要有：1、光修复2、切除修复3、重组修复4、SOS修复四、DNA损伤的修复（一）直接修复如：光修复(lightrepairing)可见光（最有效波长400nm）激活生物界广泛分布（高等哺乳动物除外）的光复活酶，该酶分解嘧啶二聚

26、体。是一种高度专一的修复形式，只分解由于UV照射而形成的嘧啶二聚体。图示（二）切除修复(excisionrepairing)是细胞内最重要和有效的修复机制，主要由DNA-pol和连接酶完成。通过切除损伤部位，剩下的空隙由DNA-polI催化dNTP聚合而填补，最后由DNA连接酶连接缺口。切除损伤在原核生物需Uvr蛋白类，真核生物需XP蛋白类。图示核苷酸切除修复不仅能够修复整个基因组中的损伤，而且能拯救因转录模板链损伤而暂停转录的RNA聚合酶，即参与转录偶联修复(transcription-coupledrepair)。转录偶联修复的意义在于，将修复酶集中于正在转录的DNA，使该区域的损伤尽快得

27、以修复。（三）重组修复(recombinationrepairing)又称复制后修复（postreplicationrepair）这种情况出现在DNA损伤面积较大，来不及修复就进行复制。受损伤的DNA在进行复制时，跳过损伤部位，在子代DNA链与损伤相对应部位出现缺口。通过分子间重组（链间的交换），从完整的母链上将相应的碱基顺序片段移至子链的缺口处，然后再通过DNA-polI、DNA连接酶进行修补上母链的空缺，此过程即重复修复。并非完全校正。这种修复的不足之处在于原损伤部位仍然存在，但随着多次复制，损伤链所占比例越来越少。图示SOS修复又称倾错性修复（Error-ProneRepair）当DNA损伤广泛难以继续复制时，由此而诱发出一系列复杂的反应。在E.coli，各种与修复有关的基因，组成一个称为调节子(regulon)的网络式调控系统。这种修复特异性低，对碱基的识别、选择能力差。通过SOS修复，复制如能继续，细胞是可存活的。然而DNA保留的错误较多，导致较广泛、长期的突变。中心法则图冈崎片段与半不连续复制大肠杆菌DNA聚合酶I、II和III的性质比较DNA-pol分子量：109kD功能：对复制中的错误进行校读