遗传学课件第4章-原生质体培养及融合配色

1、 第四章 原生质体培养及融合名词术语：原生质体(protoplast)：指除去细胞壁的细胞或是一个被质膜所包围的裸露细胞。亚原生质体(subprotoplast)：在原生质体分离过程中，有时会引起细胞中内含物的丢失而形成一些较小的原生质体，称为亚原生质体。 它可以具有细胞核，也可以没有细胞核，或是只有1条或少数几条染色体，具体情况有：小原生质体(miniprotoplast)：也称核质体 (nuclearplast)，具备完整细胞核，但只含有部分细胞质。微小原生质体(microprotoplast)：只有1条或几条染色体的情况。胞质体（cytoplast）：不含细胞核，只有细胞质。原生质体融合

2、：也称为细胞融合或体细胞杂交。是指将植物的不同种、属甚至科间的原生质体，通过人工方法诱导融合，然后进行离体培养，使其再生成为杂种植株的技术。原生质体植物细胞小原生质体（核质体）胞质体细胞膜细胞壁细胞核微小原生质体染色体 第一节 原生质体培养一、原生质体培养的发展历史要进行原生质体培养，首先必须分离原生质体，即去除细胞壁，得到完整的裸露细胞。 植物原生质体培养研究中几个重要的成就：1880年，Hanstein首次提出原生质体(protoplast)一词。1892年，Klercker采用机械法分离原生质体，但效率极低，无法进行培养和再生。甜菜洋葱萝卜黄瓜1960年，英国诺丁汉大学的Cocking教

3、授首次使用纤维素酶酶解法处理番茄的幼根，获得了大量具有高度活性的原生质体。1968年后，由于纤维素酶、离析酶投入了市场，使原生质体分离技术日益发展和成熟，原生质体培养也开始成为热门研究领域。1971年，Takebe 等首次将烟草叶肉原生质体培养成完整植株。1985年，Fujimura 等获得第一例禾谷类作物，即水稻原生质体的再生植株。 1986年，Spangenberg 等由甘蓝型油菜的单个原生质体培养得到再生植株。（白菜型、芥菜型和甘蓝型 ）BACK 随后，其它植物上也逐渐有原生质体再生植株成功的报道，包括粮食作物、油料作物、经济作物和一些药用植物。 据1993统计，已有49个科，146个属

4、的320多种植物，都可经原生质体培养得到再生植株。虽然大体上仍以农作物和经济作物为主，但已从一年植物生向多年生植物、从草本植物向木本植物、从高等植物向低等植物扩展。二、原生质体培养的意义1、为细胞融合提供直接方法2、为遗传转化提供新的途径 原生质体没有细胞壁，可以直接吸收外源DNA，或通过电击穿孔法、PEG法等方法，将基因导入原生质体，实现遗传转化。3、利用原生质体培养中广泛发生的变异，选育新品种。4、用于细胞器的分离与转移 由于原生质体没有细胞壁的障碍，可以进行亚细胞水平的操作研究。如叶绿体、线粒体、细胞核、染色体等的摄取。在摄取细胞器后进行培养，获得再生植株，根据再生植株的表现，即可进行遗

5、传分析，研究某种细胞器的功能或其所控制的性状。 也可以通过细胞器的转移，使物种获得相应的性状。 5、 用于理论研究 如细胞壁的生物合成、原生质膜的结构与功能、激素的作用机理、病毒的侵染机理等。 原生质体研究已在细胞生物学、生物技术、生理学、遗传学、病理学、病毒学、育种学等领域得到广泛应用。6、用于种质资源保存 A scheme of plant protoplast PlantsSuspension cellsPre-treatmentenzymolysisPurification Vigour testCuture and regeneration三、原生质体的分离 1、取材：材料的类别对原

6、生质体培养很重要 可采用离体培养植株、田间或温室植株，利用其叶片、叶柄、茎段等均可分离原生质体，但一定要选用幼嫩部分。 近年来，为了提高原生质体再生的频率，最常用的是以下几类材料：无菌试管苗的叶片上胚轴和子叶处于对数生长期的细胞悬浮系2、酶的种类和作用原生质体分离的效果主要取决于酶的种类和浓度。目前主要使用的酶有： 果胶酶类 纤维素酶类 半纤维素酶类和崩溃酶等 有时还会使用蜗牛酶。 1）果胶酶类 从根霉或黑曲霉中提取，能降解中胶层，使细胞从组织中释放出来。 常用的果胶酶商品制剂：Pectinase SigmaMacerozyme R-10 Japan Pectolyase Y-23 Japan

7、 (价格昂贵) 2）纤维素酶类 从绿色木霉中提取的一种复合酶制剂，其作用是降解细胞壁中的纤维素，使原生质体释放出来。常用的商品酶制剂：EA-867 中科院上海植生所Cellulase Onzuka R-10 JapanCellulase Onzuka RS Japan（价格昂贵）Meicelase P JapanCellulase USADriselase（崩溃酶，具多种活性） Japan 3）半纤维素酶用于降解细胞壁中的半纤维素，主要商品制剂有： Hemicellulase H-2125 Sigma Rhozyme HP-150 USA4）蜗牛酶：分离孢粉素、胼胝质 各公司生产的酶的效果不尽

8、相同，使用时应予以注意。必须控制好浓度、温度和处理时间，例如： Cellulase Onzuka R-10 Japan 22h Cellulase Onzuka RS Japan 3-5h（两种纤维素酶的活性大约差10倍） 3、酶液的渗透压 原生质体的一个基本属性是渗透破损性。因此，酶液、原生质体洗涤液及培养基中都要加入适量的渗透压稳定剂。常用的稳定剂分为两类： 1）糖溶液系统 2）盐溶液系统 1）糖溶液系统 多用甘露醇、山梨醇、葡萄糖、蔗糖等，目前广泛使用的是甘露醇和山梨醇。蔗糖因对原生质体培养不利，很少使用。 2）盐溶液系统 主要使用：KCl、MgSO47H2O 4、细胞质膜稳定剂 细胞质

9、膜稳定剂，能防止质膜破坏，提高原生质体的稳定性，保持原生质体的活性，促进细胞壁再生及细胞分裂等。 常用的质膜稳定剂有：葡聚糖硫酸钾、CaCl2H2O、KH2PO4等。 MES：2-( N-morpholino) ethanesulfonic acid，即2- 氮吗啉乙烷磺酸 ，可稳定酶液的pH值。 牛血清蛋白：可减少酶解过程中对细胞器的损伤，有利于原生质体的存活。 5、酶（混合）液的组成: 强活性的酶液配方，处理时间为3-5h： Pectolyase Y-23 0.1% Cellulase Onzuka RS 2.0% 甘露醇 0.6 M CaCl2H2O 0.5% MES 5.0 mM pH

10、 5.6-5.8 弱活性的酶液配方，处理时间为20h： Macerozyme R-10 0.2% Cellulase Onzuka R-10 0.4% 甘露醇 0.6 M CaCl2H2O 0.5% MES 5.0 mM pH 5.6-5.8酶混合液的灭菌： 采用微孔过滤器除菌，其滤膜的孔径有0.45m和0.22m两种型号，一般采用两级过滤法，彻底除去酶液中的微生物 6、原生质体的游离（分离）与纯化 1）原生质体的游离 经酶液处理后，细胞壁被降解，释放出球状原生质体。为使原生质体从组织上解离下来，酶解的最后2小时需轻度振荡，速度为45转/分（rpm）。酶解液酶及其它不利于原生质体培养的试剂。破

11、碎的原生质体、未去壁的细胞（团）、细胞器及碎片酶解后的产物包括：完整原生质体2）纯化具体方法为：先用不锈钢网过滤，孔径分别为400目和200目，过滤时要加入一些培养基清洗，常用CPW盐溶液。CPW盐成分为： KH2PO4 27.2mg/L KNO3 101.0mg/L CaCl2.2H2O 1480.0mg/L MgSO4.7H2O 246.0mg/L KI 0.16mg/L CuSO4.5H2O 0.025mg/L pH 5.8 然后，滤液中主要是原生质体，可以采用三种方法进行进一步的纯化：A、飘浮法B、沉降法C、界面法具体介绍如下：A、漂浮法：使用的飘浮剂有蔗糖、Percoll（珀可，是由

12、聚乙烯吡咯烷酮包被的SIO2颗粒的无菌胶体悬液）、Ficoll（菲可，水溶性聚蔗糖）。原理：采用比原生质体比重高的渗透溶液，使原生质体漂浮在溶液表面，具体方法为：1、将酶解后的原生质体悬液混匀，通过孔径44-169 m的筛网过滤（孔径大小因植物种类而异），除去大的组织碎片和残渣。2、将滤液与高渗溶液混合，在900-4500r/min下离心，小心吸取上层的原生质体。重复洗2-3次。优点：可得到较为纯净、完整的原生质体。缺点：由于高渗溶液对原生质体有伤害，因而活力高的原生质体较少。B、离心沉淀法利用比重差别原理，在甘露醇溶液中低速离心，使原生质体沉积在试管底部，然后再用Percoll飘浮一次。 优

13、点：方法简单。缺点：原生质体沉积在试管底部，造成相互间挤压，引起原生质体破裂。酶解产物+原生质体培养基400g，5min0.45mol/L甘露醇碎片带原生体C、界面法：原理：采用两种比重不同的溶液，其中一种比原生质体大，一种更小，使原生质体处于两相的界面中。界面法（甘露醇182.17，蔗糖342.3 ）优点：可以收到数量较大的纯净原生质体，避免收集过程中原生质体相互挤压而破碎。酶解产物+原生质体培养基(0.45mol/L甘露醇)0.45mol/L蔗糖400g，离心5min碎片带（轻）原生体带0.45mol/L蔗糖采界面法分离形成的原生质体带四.原生质体活力测定目测法：在显微镜下观察，根据细胞形

14、态、胞质环流现象确定原生质体活力。FDA法：FDA（荧光素双醋酸酯）是一种非极性物质，本身无荧光，能够自由穿越细胞质膜，在活细胞内，FDA被酯酶分解为荧光素而发出荧光，而且荧光素不能自由出入质膜，因而可在细胞内积累，通过荧光显微镜即可观察细胞是否具有活性。伊文斯蓝（Evans blue）法：伊文斯蓝不能穿过质膜，只有当质膜受到严重损坏时，细胞才会被染色，故能通过细胞染色与否确定原生质体的活力。 影响原生质体活力的因素所用材料的基因型和生理状态酶解条件：酶的质量和浓度、抗氧化剂、酶解温度、酶解时间长短、酶溶液系统的渗透压分离操作条件：离心次数、离心速度、纯化方法、分离持续时间环境条件：操作时的温

15、度、分离器具的影响等 以烟草为例（漂浮法）：材料1g切碎 黑暗条件下用酶液处理，震荡，使原生质体游离 50m过滤 在20%-30%蔗糖溶液上方轻轻加入过滤后的解离液 350g离心 收集漂浮的原生质体 加洗涤液悬浮，150g离心洗涤2次 用液体培养基洗涤1次 培养 五、原生质体培养 培养密度很重要（原因）：一般以104-105个/ml为宜。 一般采用的培养方法：液体培养基 固体增殖培养基 再分化培养基 器官、胚胎或植株分化。培养方式详见第二节。 1）液体培养 分成三个阶段 培养基：1/2无机盐、正常有机成分、适量的水解酪蛋白、适量的激素、1% 蔗糖、0.4-0.6 M甘露醇，pH 5.8 培养基

16、：1/2无机盐、正常有机成分、适量的水解酪蛋白、适量的激素、2% 蔗糖、0.2-0.3 M甘露醇, pH 5.8 培养基：正常培养基，适量的激素、3% 蔗糖, pH 5.8 2）固体增殖培养 液体培养中，待小愈伤组织生长至1-2 mm后，转移到固体培养基上。 固体增殖培养基：MS或其他基本培养基，添加适量的激素，使愈伤组织迅速增殖。 3）再分化培养基 以分裂素为主，也可不添加激素，目的是促使愈伤组织再生植株。 根据植物不同，培养方法及再生途径往往也不相同。有的植物，在液体培养基中就可以形成胚状体，有的植物则需要在固体培养基上才能形成不定芽。 原生质体培养过程原生质体固体培养基上小愈伤组织细胞团

17、再生植株再分化 第二节 原生质体融合 一、细胞融合的概念 细胞融合，也称原生质体融合或体细胞杂交。是指两种异缘（种间、属间）原生质体，在诱导剂诱发下或电冲击下，发生膜融合、胞质融合和核融合，形成杂种细胞，并进一步发育成杂种植株。 二、原生质体融合的发展历史 1909年，Kuster用低渗NaNO3溶液引起原生质体的融合。 1972年，Carlson等用NaNO3融合方法获得了第一株体细胞杂种，即烟草与其野生种间体细胞杂种。 但NaNO3法异核体形成率低，且对细胞有毒害。 1973年，Keller和Melchers用高pH和高钙离子浓度（50mM CaCl22H2O，pH 10.5）溶液诱导烟草

18、叶肉原质体融合，获得种内及种间的体细胞杂种。 但该方法异核体形成率低，而且对细胞有毒害。 1974年，Kao和Michaylub用聚乙二醇（polyethylene glycol， PEG ）作融合剂，明显提高了异核体的形成率，且对细胞的毒性很低。因此，该方法迅速推广开来。 1978年，Melchers等用PEG法，成功获得了西红柿与马铃薯体细胞杂种。 1979年，Senda发明电融合方法。对原生质体无毒害，也得到广泛应用。 目前，种内、种间、属间体细胞杂种已在许多植物上成功。 三、细胞融合的意义1、克服远缘杂交不亲和性，为广泛重组遗传物质开辟新途径(如利用野生种资源）2、可缩短育种年限3、利

19、用细胞融合技术转移细胞器（如叶绿体、线粒体等）及目的基因等。4、利用非对称融合创造核质杂种非对称细胞融合技术，是利用物理因素(如X、或UV射线)辐射某一种原生质体，使其细胞核或染色体失活；同时利用碘乙酰胺、碘乙酸或罗丹明 6-G 处理另一种原生质体，使其细胞质失活，然后融合这两类原生质体，即可实现细胞质和细胞核基因的组合，或使前者中被打碎的部分染色体片段渗入到后者原生质体内，实现个别基因的转移，用以改良个别性状。四、融合方式： 根据融合时细胞的完整程度，原生质体融合可分为：（一）、对称融合（asymmetric fusion）即两个完整的细胞原生质体融合。（二）、非对称融合（symmetric

20、 fusion）利用物理或化学方法使某亲本的核或细胞质失活后再进行融合， （三）、体-配融合（gameto-somatic fusion）用亲本之一的四分体小孢子原生质体与另一亲本的体细胞原生质体进行融合的过程。融合后的杂种细胞经培养可获得三倍体植株。与有性杂交培育三倍体相比它省去培育四倍体的程序，提高了效率； 另一方面，亲本之一为体细胞，没有发生基因分离重组，融合产生的三倍体杂种有希望保持原来亲本的优良性状(稳定)而四分体小孢子是减数分裂的产物，其原生质体之间存在差异，两者融合后为变异杂种的选择提供了可能（变异）。邓秀新等已获得柚子四分体小孢子原生质体与伏令夏甜橙胚性愈伤组织原生质体的三倍体

21、胚状体。 （四）、亚原生质体-原生质体融合即用射线照射亲本之一的原生质体，使其细胞核失活对另一亲本原生质体用代谢抑制剂处理，抑制其细胞质分裂杂合体具有亲本之一的细胞质与另一亲本的细胞质和细胞核，但染色体的倍性不增加。 用于细胞核或细胞质失活的方法分为物理和化学两大类：物理方法常采用射线处理，如X射线、射线等，它们能使细胞核失活；化学处理目前常用的试剂有，核失活碘乙酰胺（IOA）、碘乙酸(Iodoacetate)；质失活罗丹明（R6G，它是一种亲脂染料，能够抑制线粒体的氧化磷酸化过程而达到失活作用。 五、细胞融合的方法 （一）自发融合 在酶解细胞壁的过程中，有些相邻的原生质体能彼此融合形成同核体

22、（可包括240个核）。这种融合称为自发融合，或自体融合，是由于细胞间胞间连丝的收缩和粘连造成的。不是我们的实验目的。 （二）诱发融合 1、 盐类诱导融合法 是应用最早的融合法，但由于其异核体形成率低，而且对细胞有毒害，目前已不大采用。 如NaNO3、KNO3、Ca(NO3)2、NaCl、CaCl2、葡聚糖硫酸钠、葡聚糖硫酸钾等。 2、高pH高钙诱导融合法 CaCl22H2O 0.05mol/L，pH9.5-10.5，可使质膜表面特性发生改变，促进融合发生。 但由于异核体形成率低，而且对细胞有毒害，目前也已不大采用。 3、PEG诱导融合法PEG （聚乙二醇）诱导融合的优点是融合成本低（不需要特殊

23、设备）；融合子的异核率较高；融合过程不受物种限制。但缺点是融合过程繁琐，且PEG对细胞也有一定的毒害。PEG的作用机理： Kao等认为，由于PEG分子具有轻微的负极性，故可以与具有正极性基团的水、蛋白质和碳水化合物等形成氢键，从而在原生质体之间形成分子桥，有助于原生质体发生相互粘连，进而促使原生质体的融合；另外，PEG还能增加类脂膜的流动性，也可使原生质体的核、细胞器等发生融合。 ,P1P2P1 P2混合静止1min.融 合融合液加入PEG稀 释洗 涤加入稀释液加入培养液培 养选 择聚乙二醇（PEG）融合法操作程序PEG法原诱导生质体融合过程融合过程：图：A B C D E F融合原生质体的位

24、置：BI CI DI EI FIB C D E F B C D E F 融合过程可分为三个阶段： 1） 凝聚作用阶段，在此期间两个或两个以上的原生质体的质膜彼此靠近。 2） 在局部区域质膜紧密粘连并融合，形成细胞质桥。 3） 细胞质桥进一步扩展，融合完成，形成异核体或同核体。4电融合法原理：当原生质体以适当的密度悬浮混合后，插上电极，接通一定的交变电场，原生质体发生极化后顺着电场紧密接触成串状，再施以瞬间高强度的电脉冲，可使原生质膜发生可逆性击穿而实现融合。与PEG融合比较起来，电融合有三大优点： 不使用有毒试剂，作用条件温和，对细胞较安全； 融合基本上是同步发生的，融合效率高； 融合技术操作

25、简便。电融合法开发较晚，但目前的应用比较广泛。电融合仪的结构特点： 交变电场部分 高频直流电击部分电融合的基本过程：质膜的接触：当原生质体置于低电导率的溶液中，电场通电（2-4V/mm）后，电流即通过原生质体而不是通过溶液，使原生质体极化而产生偶极子，从而使原生质体紧密接触排列成串珠状；膜的击穿：原生质体成串排列后，立即给予高频直流脉冲(强度50-200V/mm，脉冲期为20-50微秒)，即可使原生质膜击穿，导致两个紧密接触的细胞融合在一起。通常一次融合处理可给予几个脉冲，脉冲间隔为1-2秒。a.未通电时，b. 通电后；c.高频直流脉冲六、融合细胞的培养（4种方法）液体浅层培养将含有原生质体的

26、培养液在培养皿底部铺一薄层，封口后进行培养。 优点：操作简单，对原生质体的损伤小，且易于添加新鲜培养基和转移培养物。 缺点：原生质体分布不均匀，常常发生原生质体之间的粘连现象而影响其进一步的生长和发育。此外，难以跟踪观察某一个细胞的发育情况。 原生质体悬浮液（原生质体+培养基）固体平板培养固体培养也就是琼脂糖包埋培养。低融点的琼脂糖可在30C左右融化并与原生质体混合而不影响其活力。混合后的含有原生质体的培养基铺于培养皿底部，封口后进行培养。 优点：可以跟踪观察单个原生质体的发育情况，易于统计原生质体分裂频率。 缺点：操作要求严格，尤其是混合时的温度掌握必需合适，温度偏高影响原生质体的活力，偏低

27、则琼脂糖凝固太快导致与原生质体混合不均匀。液体固体双层培养在培养皿的底部铺一层琼脂糖固体培养基，再将原生质体悬浮液滴于固体培养基表面。 优点：固体培养基中的营养物质可以缓慢释放到液体培养基中，如果在下层固体培养基中添加一定量的活性炭，则还可以吸附培养物产生的一些有害物质，促进原生质体的分裂和细胞团的形成。 缺点：不易观察细胞的发育过程。 琼脂糖固体培养基原生质体悬浮液琼脂糖珠培养将含有原生质体的液态琼脂糖培养基用吸管以大约50l一滴的量滴于直径6cm的培养皿，待其固化后向其中添加3ml液体培养基并于摇床上低速旋转培养(Thompson等,1986)。培养过程中，通过调整液体培养基的渗透压来调节

28、培养物的渗透压以利于其进一步的生长和发育。这种方法由于改善了培养物的通气和营养环境，从而促进了原生质体的分裂和细胞团的形成。 琼脂糖珠培养液第三节 杂种细胞的选择及体细胞杂种植株的鉴定杂种细胞的选择体细胞杂种植株的鉴定 一、融合体的类型 1、未融合细胞 再生植株与双亲之一相同 2、自体融合 得到“同核体”或同源多倍体 3、 异体融合 得到“异核体”，但由于融合形式不同，又可得到以下的不同结果： （1）完全和谐的细胞杂种 细胞完全融合，具有双亲各自的全套遗传信息（包括细胞核、细胞质）。再生植株为异源双二倍体。这是最理想的融合。 （2）部分和谐的细胞杂种 细胞完全融合，但由于染色体排斥，在细胞分裂过程中，部分染色体被排斥掉。 如甘薯+野生种的体细胞杂种 （3）核质杂种 细胞质来自于双亲或双亲之一，核只来自于一个亲本，另一个亲本的核被完全排斥。 （4）嵌合细胞杂种 细胞质发生融合，但细胞核未融合，细胞核各自分裂，形成嵌合体，再生植株为嵌合体植株。 二、杂种细胞的选择 融合处理后，会产生各种各样的细胞。异核体的分裂和分化，往往受到抑制，因此，必要时，应在培养早期对杂种细胞进行选择和单独培养。 但并非所有的融合都需要进行杂种细胞选择，许多情况下也可在植株再生后再进行