第八章第一节细胞病理学基本检验技术

1、第一节细胞病理学基本检验技术概述脱落细胞: 是指从人体各组织、器官，特别是管腔器官内表面脱落的上皮细胞。根据细胞标本来源的不同又可分为两大类: 脱落细胞学 针吸细胞学 脱落细胞学和针吸细胞学属于细胞病理学的一个分支，是采集人体各部位的上皮细胞，经染色后用显微镜观察其形态，协助临床诊断疾病的一门学科，即对无症状个体进行癌前病变的筛查，对有症状或体征患者进行诊断和鉴别诊断。脱落细胞检验评价 优势: 1方法简便易行，容易掌握。 2对设备要求不高，费用低，易推广。 3患者痛苦少或无痛苦，乐于接受。 4取材方便，可反复取材，不影响治疗。 5诊断迅速，检出率高。特别适用于大 规模防癌普查和高危人群的随访观

2、察。 不足: 1检查属抽样性取材，因此取材不准或制片过厚或过薄均可影响诊断。 2脱落细胞常有退变、易受人为因素的影响。 3涂片中看不到组织结构的改变，故诊断准确性受一定影响，有一定的误诊率；往往不能确定肿瘤的具体部位；不易对癌细胞做出明确的分型。一、标本采集（一）脱落细胞标本的采集1.直视采集法：即在肉眼观察下直接采集，如阴道、宫颈、口腔、鼻咽部等部位，采用刮取、吸取或刷取等方式采集标本，对食管、胃、肠道、气管、支气管可借助于内窥镜在病灶处直接刷取标本。2.自然泌液采集法：如尿液、痰液、乳头溢液等可直接留取。3.灌洗法：向空腔器官或腹腔、盆腔灌注一定量生理盐水冲洗，使其细胞成分脱落于液体中，收

3、集灌洗液离心制片，作细胞学检查4.摩擦法：用特制的器具与病变部位接触摩擦来采集标本。如食管、胃部、鼻咽部等。5.穿刺吸取法：浆膜腔积液可用穿刺吸取标本；浅表及深部组织器官，如淋巴结、乳腺、甲状腺、肝等则用细针穿刺吸取。 自然脱落细胞的主要特点有： 易从病变器官采集标本。 标本内常含有大量不同来源、不同类型的上皮细胞，亦可含有炎性细胞、巨噬细胞、微生物和外源性污染物。 细胞成分保存较差。 能进行多次标本采集。非自然脱落细胞主要特点有： 能直接从病变器官表面采集标本，如子宫颈和支气管。 能借助纤维镜直接从病变器官内部采集标本。 能获得上皮下病变的标本。 细胞成分保存良好，在解释结果时不能采用与脱落

4、细胞相同的标准。（二）细针穿刺细胞标本的采集 通过穿刺吸取或非吸取法，可从充满液体的器官或实体性器官中采集细胞标本，如肿瘤、心包膜腔积液、胸膜腔积液、腹膜腔积液和脑脊液等。 影像学技术能对小而深、移动且难以触摸的病变部位进行定位，有助于穿刺采集标本。 细针穿刺细胞标本采集的主要特点有： 通过触摸或导引法，可从体内任何实体器官采集标本。 方法简捷、费用低、创伤小、并发症少、禁忌证少，经皮肤穿刺无需麻醉。 需要借助病理学知识解释结果。 良好的标本采集和制片技术可获得最佳的结果，但对结缔组织、透明变性、血管性病变、大量坏死物、囊性变或出血性病变等可导致标本采集不足。二、涂片制备（一）涂片要求 在标本

5、制作时，对粘性小的标本如尿液，可在玻片上先涂上粘附剂如蛋清甘油后再涂片。涂片要求标本新鲜,操作轻柔,以减少对细胞机械性损伤。玻片清洁,涂片均匀、厚薄适宜、涂片牢固。每位患者的标本至少涂两张涂片，以避免漏诊。涂片后立即在玻片一端标上编号。（二）涂片制备方法1.推片法：适用于较稀薄的液体标本，如尿液、浆膜腔积液。通常将标本低速离心或自然沉淀后，取沉淀物推片，方法同血液制片。2.涂抹法：适用于较粘稠的标本，如食管和宫颈粘液及痰液。用竹签将标本顺向涂抹，不宜重复。3.压拉涂片法：将标本加在载玻片上，将另一张载玻片盖在上面，并施加压力，将2张载玻片水平分开。适用于黏液性标本。4.喷射法：用配有细针头的注

6、射器将标本从左至右反复均匀地喷射在玻片上。此法适用于各种细针吸取的液体标本。5.印片法：将小块病变组织轻轻在玻片上印按一下后拿开。此法为活体组织检查的辅助方法。图8-1 涂片制备方法（用于黏液性标本）图8-2 涂片制备方法（用于非黏液性标本）三、标本固定固定的目的：是保持细胞的自然形态,以防细胞自溶和细菌腐败；固定能沉淀和凝固细胞内的蛋白质，并能破坏细胞内的溶酶体，而使细胞结构清晰并易于着色，所以固定愈快，细胞愈新鲜，染色效果愈好。 1.常用固定液：（1）乙醚乙醇固定液：由乙醚、乙醇、冰乙酸三者混合配制而成。此液渗透性强，固定效果好，适用于H-E染色和巴氏染色。（2）95%乙醇固定液：适用于大

7、规模防癌普查。制备简单，但渗透能力较差。2.固定方法：(1)带湿固定：即涂片尚未干燥即行固定。适用于痰液、宫颈刮片及食管刷片等较粘稠的标本。此法固定细胞结构清晰，染色鲜艳。(2)干燥固定：即涂片自然干燥后，再行固定。适用于较稀薄的标本，如尿液、浆膜腔积液等。滴加法： 将涂片置于染色支架上，任其自然干燥后，直接滴加固定液数滴，盖满整个涂片膜。因固定液量少，效果较差。浸入法：把即将干燥的涂片直接浸入固定液内，因固定液充足，固定效果较好。但细胞易脱落而发生交叉污染，因此应该分瓶固定，固定液回收时应过滤。此法适用于大量标本的检查。3.固定时间： 一般为1530min。含粘液较多的标本如痰液、宫颈刷片等

8、，固定的时间要适当延长；不含粘液的标本，如尿液、胸腹水等，固定时间可酌情缩短。 四、标本浓缩技术（一）离心法和细胞离心法 离心法适用于大量液体标本，如浆液性积液、尿液、灌洗液等。 细胞离心法适用于少量液体、中等量细胞的标本，是将细胞直接离心到载玻片上，制成单层细胞涂片，但部分物质会被滤纸吸收而损失，不适用于富含黏液或细胞的标本。（二）滤膜过滤法： 适用于大量液体、少量细胞的标本。（三）细胞块法： 适用于大多数悬液标本。（四）液基细胞学技术： 是一种半自动或全自动标本处理新技术，是将刷取或灌洗法采集的标本，放在特殊的运送液或保存液中，制成细胞悬液，经过处理，除去血液、蛋白和炎性渗出物，制成分布均

9、匀薄片。 液基细胞学（LBC）技术是一种半自动或全自动标本处理技术，其优点是： 涂片上细胞分布均匀、分布范围小、背景清晰。 筛检简便、快速。 能提高诊断的灵敏度和特异度。 能显著降低标本的不满意率。 可用于原位杂交和免疫细胞化学染色。 LBC技术是对传统技术的有效补充，但对某些非妇科标本，因LBC涂片缺乏背景成分，会影响细胞学的诊断。目前，常用的LBC技术有ThinPrep法和SurePath Prep法。LBC技术与传统技术比较见表8-3。五、染色方法1.染色的目的和原理： 染色是利用细胞中各种结构的生化组成不同，对染料的亲和力不同，而显示不同的颜色，使细胞的形态和结构易于辨认。常用的染色有

10、H-E、巴氏及瑞吉氏染色。2.常用染色方法（1）巴氏染色法: 特点是细胞具有多色性，色彩丰富鲜艳，胞内结构清晰，染色效果好，是细胞病理学检查常用方法，尤其是观察女性雌激素水平对阴道上皮的影响。但操作程序复杂。原理核酸等电点为pH1.52.0，当pH2.0时，核酸带有负电荷，可与染液中带正荷的碱性染料氧化苏木素矾结合，染成蓝紫色。染液中的伊红、亮绿、橘黄G6为酸性染料，俾斯麦棕为碱性染料，分别能与胞质中带相反电荷的蛋白质结合而染出不同的颜色。由于染核的苏木素为水溶液，染胞质的为乙醇溶液，故染核时应先进行加水处理（即将涂片从高浓度乙醇到低浓度乙醇），染胞质时需先进行脱水处理（从低浓度乙醇到高浓度乙

11、醇）。染色步骤1.加水：将固定的涂片依次放入80%、70%、50%乙醇溶液和蒸馏水中各1分钟取出。2.染核：将涂片置苏木素染液中染色510分钟取出，用水冲洗两次。3.分色：将涂片浸入稀盐酸中分色两次，每次35秒，立即用水冲洗，再将涂片置稀碳酸锂溶液中蓝化细胞核1分钟，使涂片转为灰蓝色。4.脱水：将涂片分别放入50%、70%、80%和95%乙醇溶液中各1分钟取出。5.染胞质：将涂片放橘黄G6染液中染色25分钟，再用95%乙醇溶液冲洗5次，待干后加石蜡1滴，加盖片于镜下观察。染色结果 各种细胞的核染成深蓝紫色或紫红色，上皮细胞的胞质根据细胞的种类和分化程度不同可染成各种不同的颜色。底层细胞染蓝绿色

12、，中层细胞染蓝色，表层角化前细胞染淡蓝色，角化细胞染浅红色或浅黄色。柱状上皮胞质常染淡蓝色。（2）苏木素-伊红（HE）染色法: 操作简易，试剂易配制，染色透明度好，核与胞质对比鲜明，染色效果也好。多用于组织病理学检查及痰涂片细胞学检查等。但胞质色彩不丰富，不能用于观察阴道涂片对雌激素水平测定。原理 同巴氏染色法，只是单用伊红染细胞质。试剂 除伊红染液外，其他试剂同巴氏染色法。染色方法 (1) 按巴氏染色法进行加水、染核、分色、蓝化，然后放50%乙醇中lmin。 (2) 置伊红染液中24min，取出用水冲洗，干燥后加石蜡油镜检。染色结果 细胞核呈紫蓝色，胞质淡玫瑰红色，红细胞呈淡朱红色。 苏木素

13、-伊红染色的特点：透明度好，核与胞质对比鲜明。染色步骤简便，效果稳定。 （3）瑞-吉氏染色法: 适用于血片、淋巴穿刺液和胸腹水涂片。*涂片观察及报告方式：（一）显微镜观察方法： 1、阅片前严格核对涂片和送检单,了解临床 基本情况,结合细胞形态分析。2、阅片时：1）工作责任心要强：2）初筛涂片原则：低倍镜观察，高倍镜辨认。3）全面观察：将玻片从上到下、从左到右按 顺序移动。4）有效的标记：如发现异常细胞，应作标记。A 错误的玻片移动方法 B 正确的玻片移动方法涂片的观察方法示意图 （二）诊断报告方式：1、直接法：多用于有特异性细胞学特征，且又较容易确诊的疾病。可根据细胞形态，结合临床资料，直接提

14、出疾病的诊断意见。如慢性宫颈炎、脂肪瘤、淋巴肉瘤等。2、分级法：有三级、四级和五 级三种分类方法。三级法 阴性涂片中仅为正常及炎症变性细胞。报告未找到肿瘤细胞； 可疑-涂片中找到一些异型细胞，不能肯定为癌细胞。报告找到可疑肿瘤细胞； 阳性发现典型的肿瘤细胞。报告找到肿瘤细胞。四级法 阴性涂片中仅为正常及炎症变性细胞报告未找到肿瘤细胞；核异质（非典型增生）细胞涂片中找见异型细胞倾向于真正的核异质细胞，但不能排除高度异型的炎症变性细胞及不典型的癌细胞。报告找到核异质细胞。癌疑涂片中找到一些重度核异质细胞，基本符合癌细胞的标准，但因数量过少或形态不典型，所以不能排除癌细胞的可能性。报告找到可疑癌细胞

15、。 阳性发现肯定的肿瘤细胞。报告找到肿瘤细胞。 改良巴氏五级分类法（多用于子宫颈刮片脱落细胞检验）I级：涂片未见异常细胞或不正常细胞（基本正常）。级：涂片内见异常细胞但均为良性。 a：有轻度核异质细胞，变形细胞等。b：有中至重度核异质细胞，属于癌前期病变，需定期复查。级：有可疑癌（恶性）细胞，形态明显异常，难以肯定良、 恶性，需复查。级：有癌细胞，但不够典型或数量极少，需进一步证实。 V级：有癌细胞。形态典型且数量较多，如有可能区分其组织 学分型。 （三）细胞学诊断的质量管理体系：1、标本的采集：2、制片的过程：3、阅片诊断：4、复查会诊：5、定期随访：六、细胞病理学诊断细胞病理学检查的影响因

16、素：1.患者信息：年龄、性别、激素水平、临床表现、病史、其他检查结果。2.病变部位：局部解剖学知识、放射学特征、技术局限性。3.细胞特点：细胞量、细胞类型、细胞群体、细胞分布和黏附性、细胞形态、涂片背景。4.其他信息：电子显微镜、组织化学、免疫细胞化学、流式细胞术、细胞遗传学。（一）细胞数量 细胞数量和类型提供了靶组织或器官的重要信息，不仅反映了病变性质，而且与非病变因素有关。细胞过多表示增殖过程指数增加，代表增生或肿瘤。细胞过少也并非表示无恶性细胞的存在。因此，足够量的标本是提高结果解释可靠性的重要因素。（二）细胞结构特征 正常上皮细胞常保持细胞极性和细胞间黏附性。典型的恶性上皮细胞的极性差

17、，细胞间相互重叠，有时三维状聚集呈球形。癌细胞具有异常黏附性和异常聚集性2个主要特征。（三）细胞核特征 细胞核形态的异常称为核异质，分轻度、中度、重度，或者低度和高度。 正常细胞的体积相对较小，分布均匀；核呈圆形或卵圆形，核边界光滑，染色质呈细颗粒状。涂片上同一类型细胞之间差别很小，称为单形性。 核染色过深，核染色质分布不规则，呈粗颗粒状，核膜增厚，核大小不均，即核大小、形态、染色异常又称为核多形性。 常用核质比来表达细胞核和细胞质的相对比例（四）细胞质特征 细胞大小和形态不一称为细胞大小不均。异常细胞的细胞质可增多或减少，并影响到核质比。细胞质由高尔基体、核糖体、内质网、线粒体或代谢物等组成

18、。细胞质内贮存物质只有通过特殊染色才能鉴别。细胞质变性包括肿胀性、水肿性、空泡样变化，质膜完整性破坏使内容物溢出，即细胞溶解。（五）背景和人为因素1.涂片背景：包括细胞和非细胞成分，而细胞又包括上皮细胞和非上皮细胞，通常有助于疾病的诊断，但也会导致误诊。细胞学涂片也可用于寻找微生物。病原性微生物有病毒、细菌、霉菌和原虫等。2.人为因素：指人为污染或涂片制作过程引起细胞形态学变化，与采样、运送和涂片制备等因素有关。（六）显微镜涂片筛查原则1.先用低倍镜浏览涂片，了解涂片制备和染色等信息，并进行全片观察，寻找有无异常细胞，然后再用高倍镜证实。2.在筛检标本及显微镜观察的同时，必须回答2个问题：（1）细胞群体与器官来源有何关系？（2）如细胞群体异常，则是非特异性异常还是明确异常。七、细胞病理学诊断质量保证（一）诊断准确性和局限性： 常用统计学指标有灵敏度、特异性、阳性预测值、阴性预测值和准确性等。假阳性结果是某些疾病之间有类似细胞学改变 假阴性结果说明采样部位是在病变周围或病变前阶段。（二）细胞病理学诊断质量保证：室内质量控制：是对实验室内部操作所采取的控制方法。室间质量评