GC-MSSIM法同时分析卷烟中教学提纲

1、Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。GC-MSSIM法同时分析卷烟中-GC-MS/SIM法同时分析卷烟中挥发和半挥发性有机酸郭磊（南昌卷烟总厂技术中心，南昌330069）【摘要】采用加速溶剂萃取，以二氯甲烷-乙腈（1:2，V/V）的混合溶液为萃取溶剂，N,O-双（三甲基硅基）三氟乙酰胺硅烷化，反-2-己烯酸和肉桂酸为内标，GC-MS/SIM法同时测定了烟叶中的甲酸、乙酸、乳酸、苯甲酸、十六酸、十八酸等26种挥发、半挥发性有机酸。方法的回收率为81.1%106.4%，相对标准偏差为1.73%7.08%，检测限在0.1g/g13.72g/g之

2、间。以该方法对部分烟叶样品中挥发性、半挥发性有机酸进行了定量分析。【关键词】气相色谱-质谱/选择离子；加速溶剂萃取；烟叶；有机酸TheSimultaneousDeterminationofVolatileandSemi-volatileOrganicAcidsinTobaccobyGasChromatographyMassSpectrometry/SIMGuoLeiTechnologyCenterofNanchangCigaretteGeneralFactory,Nanchang330069AbstractThevolatileandsemi-volatileorganicacidsincig

3、aretteswereextractedwithadichloromethane-acetonitrile(1:2,v/v)solventmixturebyacceleratedsolventextraction,thenderivedwithN,O-Bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide.Themethodforsimultaneousdeterminationof26organicacidsincludingofformicacid,aceticacid,lacticacid,benzoicacid,hexadecanoicacid,octadecano

4、icacidetal.byGC/MS/SIMwasdevelopped,usingtrans-2-hexenoicacidandcinnamicacidasdoubleinternalstandards.Therecoveriesrangedfrom81.1%to106.4%withRSDsof1.73%7.08%.Thelimitsofdetectionrangedfrom0.1g/gto13.72g/g.Thecontentsoforganicacidsin15brandsofdomesticandforeigncigarettesweredeterminedandcomparedresp

5、ectively.KeywordsGC-MS/SIM；ASE；Tobacco；Organicacids1引言烟草中的有机酸种类繁多，含量差异大，它们对烟草和卷烟的质量有着重要的影响，尤其是其中的挥发和半挥发性有机酸，研究这些有机酸的种类和含量对了解烟草的内在质量和改进卷烟配方具有重要的指导意义。烟草有机酸传统的分析方法主要有GC1，2、GC/MS3、HPLC4、IC5和CE6等，但这些方法均不能实现挥发性和半挥发性有机酸的同时分析。目前，烟草中含量较高的甲酸、乙酸等低分子量的脂肪酸，由于它们水溶性、挥发性强，采用传统的分析方法很难对它们进行定量分析，这是目前烟草有机酸分析中亟待解决的问题。加速

6、溶剂萃取法(AcceleratedSolventExtraction，ASE)是将样品放在密封的萃取池中，加热到较高的温度(通常50200)，引起容器中压力升高，同时给予一定压力(通常10342.5KPa13790KPa)，使溶剂保持液态，从而可以大大提高萃取效率。相比于常温和常压，加速溶剂萃取法的萃取溶剂用量少，萃取时间短，萃取效率高。本工作采用加速溶剂萃取，N,O-双（三甲基硅基）三氟乙酰胺衍生化，以GC-MS/SIM法实现了同时对挥发、半挥发性有机酸的定量分析。2实验部分2.1仪器、试剂和样品6890/5975气相色谱/质谱联用仪（美国Agilent公司），ASE200加速溶剂萃取仪（美

7、国Dionex公司），分析天平（感量0.0001g，德国Sartorius公司）。25种常见有机酸（AcrosOrganics公司）；乳酸、羟基乙酸（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；乙酸苯乙脂、反-2-己烯酸、肉桂酸（AcrosOrganics公司）；N,O-双（三甲硅基）三氟乙酰胺（BSTFA）（Fluka公司）；二氯甲烷、乙腈为色谱纯试剂（J&TBaker公司）。根据预实验的结果，配制有机酸母液，以二氯甲烷-乙腈（1:2，V/V）定容，其浓度如表1所示。在同一个容量瓶中，内标反-2-己烯酸（IS1）和肉桂酸（IS2）配制成0.96mg/mL和5.19mg/mL的乙腈溶液。内标（IS3）

8、乙酸苯乙酯配成2.51mg/mL的乙腈溶液。准确移取有机酸母液10mL，以及乙酸苯乙酯溶液20L，反-2-己烯酸溶液和肉桂酸溶液50L，置于25mL容量瓶中，以二氯甲烷-乙腈（1:2，V/V）混合溶液定容，摇匀，得到工作曲线中的最高浓度有机酸标液（用于有机酸衍生化条件优化）。2006年烤烟烟叶（云烟87，B2F）；2006年15种国内外成品卷烟(其中编号1#-10#为国内卷烟，11#-15#为国外卷烟)。2.2实验方法2.2.1气相色谱和质谱条件GC条件：色谱柱为DB-5MS石英毛细管柱（50m0.25mmi.d.0.25md.f.）；初始炉温40(3min)4/min280(40min)；进

9、样口温度280；载气为氦气，流速1.0mL/min；分流比为10:1；MS条件：离子源温度230；四极杆温度150；各有机酸衍生化产物的选择离子如表1所示：表1有机酸母液浓度(mg/L)及衍生物的选择离子(m/z)化合物母液浓度(mg/L)选择离子(m/z)化合物母液浓度(mg/L)选择离子(m/z)化合物母液浓度(mg/L)选择离子(m/z)甲酸194.69103己酸2.66173十二酸1.29257乙酸236.38117羟基乙酸50.18205十四酸31.84285丙酸1.41131反-2-己烯酸171十五酸2.53299丁酸1.141452-呋喃甲酸3.69125十六酸335.16313

10、2-甲基丁酸2.60159庚酸0.60187十七酸28.223273-甲基丁酸0.84159苯甲酸2.47179亚油酸251.86337戊酸1.07159辛酸1.08201亚麻酸374.623353-甲基戊酸1.00173壬酸0.82215油酸125.933394-甲基戊酸0.55173癸酸0.52229十八酸121.22341乳酸66.96117肉桂酸161注：、为内标2.2.2样品的处理方法和加速溶剂萃取的条件取烟叶（烟丝），粉碎后过40目筛，烟末装入密封袋中保存（水分测量采用行业标准YC/T317）。准确称取0.500g烟末，装入萃取池中，加入反-2-己烯酸溶液（IS1）和肉桂酸溶液（I

11、S2）50L，进行加速溶剂萃取。条件如下：萃取池体积：11mL，提取溶剂：二氯甲烷-乙腈（1:2，V/V），炉温：100，系统压力：10342.5KPa，加热时间：15min，萃取时间：15min，萃取次数：3次，氮气吹扫时间：90s。2.3.3有机酸三甲基硅烷衍生物的制备取经过0.45m滤膜过滤的提取液1ml，转入色谱瓶中，加入100LBSTFA，密封，在60水浴中衍生化40min，取出冷却至室温，供GC-MS分析。3结果与讨论3.1内标物的选择采用对照标样和样品的色谱图、保留时间以及标样加入法进行定性。对于待测的27种有机酸，由于其保留时间的跨度比较大，各成分之间的含量差异大，采用单内标不

12、能对每种有机酸都准确定量。根据预实验的结果，本文选择反-2-己烯酸和肉桂酸，以双内标法进行定量分析。有机酸标样和烟叶样品中有机酸衍生物的选择离子色谱图如图1、2所示：图1有机酸标样衍生物的选择离子检测图1.甲酸2.乙酸3.丙酸4.丁酸5.2-甲基丁酸6.3-甲基丁酸7.戊酸8.3-甲基戊酸9.4-甲基戊酸10.乳酸11.己酸12.羟基乙酸IS1.反-2-己烯酸13.2-呋喃甲酸14.庚酸15.苯甲酸16.辛酸17.壬酸18.癸酸IS2.肉桂酸19.十二酸20.十四酸21.十五酸22.十六酸23.十七酸24.亚油酸25.油酸和亚麻酸（采用各自的特征离子339、335可实现分离）26.十八酸注：各

13、峰号与图1所代表的化合物相同，丰度较低的酸未标出，定量时采用各自的特征离子图2烟草样品中有机酸衍生物的选择离子检测图3.2衍生化条件的选择有机酸衍生化反应的完全程度是影响定量分析结果准确、可靠的重要因素。在实验中，以不参与衍生化反应的乙酸苯乙酯为内标（IS3,特征离子为104），以各有机酸衍生化产物与乙酸苯乙酯峰面积的比值为参考(选择甲酸、乙酸、己酸、2-呋喃甲酸、苯甲酸、十四酸、十六酸、油酸、十八酸等九种有代表性的有机酸)，主要考察了衍生化温度、时间和衍生化试剂（BSTFA）的用量对各种有机酸衍生化效率的影响（注：以相同方法选择ASE参数）。3.2.1有机酸标样衍生化条件的选择取最高浓度标准

14、溶液（1mL/份），分别于不同温度、不同时间和不同BSTFA用量（见表2）的条件下进行衍生化反应，考察在不同条件下有机酸标样的衍生化效率。表2有机酸衍生化条件的优化实验参数选择条件衍生化温度254050607080衍生化时间10min20min30min40min50min60min标样BSTFA用量10L20L30L40L50L60L样品BSTFA用量40L60L80L100L120L结果显示：衍生化温度和时间对于有机酸衍生化效率的影响不大，而衍生化试剂的用量对衍生化效率的影响较大，不足的用量会导致衍生化反应不完全，影响定量分析，如图3所示。最终确定有机酸标样的衍生化条件为：衍生化温度：60

15、；时间：40min；BSTFA用量：40L。图3BSTFA用量对有机酸标样衍生化效率的影响3.2.2样品BSTFA的用量由于样品成分复杂，如一些醇类、酚酸等也会和BSTFA发生反应，消耗掉一定量的BSTFA，因此，相应增加了BSTFA的用量。以2.2.2中的条件进行加速溶剂萃取，得样品提取液。取提取液（1mL/份），分别加入一定量BSTFA（表2），按优化条件进行衍生化反应后，进样分析。结果（图4）表明：当BSTFA用量为100L时，样品中各种有机酸的衍生化效果较好。图4BSTFA用量对样品有机酸衍生化效率的影响3.3提取条件的选择加速溶剂萃取仪（ASE）条件的选择对样品的提取效率有较大影响，

16、实验中主要对以下3个条件进行了优化8,9,10：提取溶剂、温度和时间。表3ASE参数的优化实验参数选择条件提取溶剂二氯甲烷/乙腈（V/V）2:11:11:21:31:4温度60708090100110时间5min10min15min20min25min由于挥发和半挥发性有机酸之间性质的差异，实验中选择混合溶剂为提取溶剂，考察了二氯甲烷（V1）和乙腈（V2）不同体积比对有机酸提取效率的影响。准确称取0.500g烟末，装入萃取池中进行萃取。条件为：压力：10342.5KPa，温度：80，时间：10min，提取3次。向得到的提取液中加入20L乙酸苯乙酯溶液，混合均匀。取经过0.45m滤膜过滤的提取液

17、1ml，转入色谱瓶中，加入一定量BSTFA，密封，按优化的条件进行衍生化反应，冷却至室温后，进样分析。结果（图5）表明：当二者体积比为1:2时，各有机酸的提取效果均较好。图5不同比例萃取溶剂对有机酸提取效果的影响以同样的方法对ASE的其它参数（表3）进行优化，考察不同条件下的提取效率。各种有机酸的提取效率随着温度的升高而增加，当提取温度超过100以后，再升高温度提取效率基本上不再变化；随着提取时间的增加，各有机酸的提取效率有所增加，当提取时间为15min时，各酸的提取效率均比较好。最终确定的ASE参数为：提取温度：100；提取时间：15min。3.4标准曲线和检测限准确移取有机酸母液0.25m

18、L、0.5mL、1.0mL、2mL、5mL、10mL，分别置于25mL容量瓶中，加入50L反-2-己烯酸和肉桂酸溶液，以二氯甲烷-乙腈（1:2，V/V）混合溶液定容，摇匀，得到一系列已加标的不同浓度的标准溶液。取不同浓度的标准溶液各1.0mL，以优化的条件进行衍生化反应后，进样分析。以峰面积比（甲酸癸酸、乳酸、羟基乙酸、2-呋喃甲酸以反-2-己烯酸为内标；苯甲酸、十二酸十八酸以肉桂酸为内标）对浓度比作图，制作标准曲线。回归方程及检测限见表4。表4有机酸的标准工作曲线、相关系数、检测限、相对标准偏差和回收率化合物回归方程相关系数R2检测限(g/g)RSD(%,n=6)样品含量(g/g)回收率(%

19、)甲酸Y=2.4911x-0.59260.999411.54.13139.298.6%乙酸Y=1.9889x-0.38660.999713.73.33158.595.3%丙酸Y=1.8445x+0.00280.99970.14.591.389.7%丁酸Y=1.2557x+0.00470.99990.16.180.284.4%2-甲基丁酸Y=0.9577x+0.00090.99980.16.070.989.1%3-甲基丁酸Y=1.0418x+0.00070.99990.26.440.592.5%戊酸Y=1.0839x+0.00160.99990.14.351.081.1%3-甲基戊酸Y=0.67

20、42x-0.00060.99990.15.340.392.2%4-甲基戊酸Y=0.7564x-0.00040.99980.26.3683.6%己酸Y=0.9148x-0.00660.99970.12.111.486.1%乳酸Y=1.2456x-0.27890.99952.34.0268.789.1%羟基乙酸Y=0.4812x-0.10450.99951.12.7925.986.5%2-呋喃甲酸Y=1.2639x-0.01880.99940.24.73.796.6%庚酸Y=0.6229x-0.00020.99980.12.580.295.8%苯甲酸Y=4.3815x+0.00110.99940.

21、35.422.396.7%辛酸Y=0.6464x-0.00190.9990.17.080.7102.7%壬酸Y=0.432x+0.00010.99910.36.060.992.9%癸酸Y=0.4184x-0.00010.99940.16.740.5106.4%十二酸Y=0.895x+0.00060.99950.25.231.196.9%十四酸Y=1.721x-0.09910.99561.04.3829.894.1%十五酸Y=0.9438x-0.00040.99960.32.837.389.7%十六酸Y=4.5235x-3.17590.99753.12.51357.692.6%十七酸Y=2.14

22、31x-0.11290.99480.61.7322.492.7%亚油酸Y=1.0263x-0.77520.99473.11.85330.682.1%亚麻酸Y=0.6274x-0.55990.99855.41.73401.083.5%油酸Y=2.4905x-0.58930.99911.41.8896.084.2%十八酸Y=4.2053x-0.96120.99761.74.1393.898.6%3.5方法的回收率和精密度采用标样加入法测定回收率。将与样品含量相当的一定量标样加入样品中，将加标样品和未加标样品平行进行前处理和定量分析，测定回收率结果见表4。3.615种国内、国外卷烟品牌中挥发、半挥发

23、性有机酸的分析采用本方法测定了15种国内、国外的卷烟中挥发、半挥发性有机酸的含量。每个样品进行2次平行测定，结果取其平均值，各有机酸的定量结果如表5所示。表515种国内和国外卷烟中挥发、半挥发性有机酸的含量(g/g)卷烟牌号1#2#3#4#5#6#7#8#9#10#11#12#13#14#15#甲酸311.4277.2267.5471.9287.6375.9411.0295.7379.6277.9348.7315.4248.2377.3404.9乙酸261.4313.8359.0375.3362.1296.0292.7311.7606.3221.0444.5349.2367.6335.2723

24、.6丙酸1.72.22.72.72.02.11.52.83.61.93.02.92.43.35.4丁酸0.50.40.50.50.40.40.20.60.50.30.60.50.40.61.12-甲基丁酸0.91.21.01.11.21.10.91.21.10.91.01.21.01.11.83-甲基丁酸0.30.40.40.50.50.40.40.50.90.40.60.90.70.71.6戊酸1.21.31.51.51.41.41.01.41.81.31.61.81.52.01.93-甲基戊酸0.20.20.20.10.30.50.51.11.12.7己酸2.02.12.42.52.52.

25、42.02.32.72.82.53.02.63.03.1乳酸1791.3208.6293.1290.9241.3199.8253.3223.4199.5216.4203.8213.2229.2140.2287.4羟基乙酸46.661.751.358.269.249.457.368.746.6134.445.741.943.242.346.72-呋喃甲酸9.68.38.312.010.410.411.17.99.89.910.39.812.49.612.0庚酸0.70.60.60.60.50.60.70.90.80.60.80.70.80.80.8辛酸1.71.81.81.91.52.01.91

26、.72.22.82.12.32.52.42.5壬酸3.02.32.82.82.23.62.03.02.94.12.83.63.12.52.7癸酸2.21.72.22.21.82.41.52.12.12.32.11.83.12.41.7苯甲酸13.35.66.84.98.98.74.16.19.05.16.910.047.310.815.1十二酸3.62.32.83.12.63.33.43.03.13.47.32.73.63.81.9十四酸57.051.856.856.058.560.555.057.759.053.559.060.869.275.870.7十五酸19.416.517.319.6

27、20.822.521.918.918.320.520.522.636.930.626.0十六酸789.6761.8765.5786.7817.1871.3826.6784.9730.4751.9733.8677.5740.3762.4634.4十七酸44.242.042.642.545.945.946.942.239.442.842.040.344.944.140.3亚油酸620.7608.9587.9603.3643.0647.8656.4617.8591.7589.5586.1546.3574.9584.7542.9亚麻酸831.1816.4760.4811.2818.0892.3879.

28、9827.7720.4751.9710.0620.1657.0682.7616.9油酸206.8209.7211.1208.3222.1227.3222.4207.6213.2198.0199.5183.3227.4205.6203.8十八酸199.4193.2192.8195.6207.3217.5209.5196.9187.1190.1185.3172.0217.9200.0176.3总量5219.63591.83639.33956.13829.03945.03964.03686.73832.23484.03621.03283.73553.53524.94660.6注：4-甲基戊酸含量均太

29、低，未做定量分析。含量太低，未做定量分析。从表5可知：国内、国外卷烟中挥发性有机酸含量的差别较大。其中尤其以3-甲基戊酸含量差别最大，国内卷烟中3-甲基戊酸的含量普遍偏低，在有些品牌中几乎没有检测出，而国外卷烟中3-甲基戊酸的含量明显高于国内卷烟，以15#卷烟最高。国产卷烟1#中的乳酸、10#中的羟基乙酸和国外卷烟13#中的苯甲酸的含量明显高于其它牌号的卷烟；国内、国外卷烟中挥发、半挥发性有机酸在总量上相差不大。在SPSS(StatisticalProductandServiceSolutions)上用Kruskal-WallisH法检验发现，国内外15种卷烟中26种有机酸含量除2-呋喃甲酸、

30、癸酸、十二酸外均差异显著(显著性水平0.05，下同)；国内卷烟中有13种有机酸的含量差异显著，而国外卷烟烟丝中26种有机酸含量均没有显著差异(表6)。造成这种差异的原因可能与卷烟的配方设计和加香加料有关。相比国内卷烟，国外卷烟的配方设计明显更加均匀。表6国内外15种卷烟烟丝Kruskal-WallisH法检验结果10domesticcigarettes15foreigncigarettes15domesticandforeigncigarettes2Evolvingsignificancelevel2Evolvingsignificancelevel2Evolvingsignificancel

31、evel甲酸16.7710.0528.7270.06827.4450.017乙酸17.5430.0418.40.07827.4970.017丙酸17.0860.0478.40.07826.9550.02丁酸15.8860.0697.7450.10125.7420.0282-甲基丁酸14.0860.1197.0910.13122.8650.0633-甲基丁酸16.3140.0618.2910.08127.5870.016戊酸18.40.0318.40.07828.2710.0133-甲基戊酸17.0140.0488.3410.0828.010.014己酸17.2570.0457.0910.131

32、27.1610.018乳酸18.4570.038.40.07827.8970.015羟基乙酸18.7430.0278.0730.08928.490.0122-呋喃甲酸17.0290.0487.9640.09326.4770.022庚酸12.1140.2075.3450.25421.0060.101苯甲酸17.1140.0473.9270.41627.2650.018辛酸16.0290.0666.7640.14924.1420.044壬酸14.2570.1138.40.07824.7610.037癸酸18.1430.0348.7270.06828.5030.012十二酸10.8860.2847.3090.1220.310.121十四酸12.9140.1677.9640.09323.4710.053十五酸13.6570.1358.7270.06825.3940.031十六酸15.4290.087.4180.11525.0970.034十七酸16.4570.0587.8550.