《生物化学》本科课件14章 核酸分子杂交

1、DNA的均一性：病毒DNA均一DNA, Tm值范围窄。 动物细胞DNA不均一DNA, Tm值范围较宽。核酸分子杂交(Hybridization of nucleic acids ) 核酸分子杂交的双方是待测核酸序列及探针。待测的核酸可以是克隆基因片段、基因组DNA、细胞总RNA。将核酸从细胞中分离纯化后可以在体外与探针杂交（膜上印迹杂交），也可以直接在细胞内进行（原位杂交）。 探针（probe）：是一种已知的、仅与特异性靶分子反应的分子。 探针必须用一定的手段加以标记，以利于以后的检测。常用的标记物包括放射性核素和非放射性标记物两大类。检测这些标记物的方法都是极其灵敏的。 核酸分子探针核酸-分

2、子杂交 杂交的双方是 待测核酸 及 探针 两条互补 DNA 单链 或一条 DNA 单链与互补的RNA 链形成双链核酸分子的过程称为核酸分子杂交。通常是探针与受体 DNA 或 RNA 分子的之间的杂交。 探针 (probe) 用同位素或非同位素标记的具有已知核苷酸顺序的单链 DNA 或 RNA 分子称为探针。探针用于鉴别或分离基因以及检测基因的表达。DNA探针、RNA探针、cDNA探针及寡核苷酸探针探针的种类：基因组DNA探针、cDNA探针、cRNA探针、 寡核苷酸探针（1）双链DNA探针。通过切口平移标记或随机引物标记法标记。后者能产生高比活的探针，但标记探针的产量较低，不适量切片的原位杂交。

3、 （2）人工合成脱氧寡核苷酸。由DNA合成仪合成，与克 隆的DNA相比，人工合成脱氧寡核苷酸有下列优点：特 异性较高，当DNA顺序未知时可按氨基酸顺序进行合 成，可用于相似基因顺序差异研究；可用合成的不同顺 序探针对特定基因进行最佳杂交条件的筛选；由于分子 量小，与相同量的dsDNA探针相对而言，具有高得多的 摩尔浓度。 （3）单链cDNA探针。单链cDNA探针常通过克隆载体M13 获得。ssDNA探针与dsDNA探针相对比，其最大优点 在于，ssDNA探针不会像dsDNA探针那样与自身互补 的第二条链复性杂交，增加了探针的有效浓度。 （4）反义寡核苷酸探针。见合成的20-70个寡核苷酸克隆

4、到RNA表达载体上而获得。这种探针既有寡核苷酸 探针的优点，又有cDNA探针的优点。 （5）单链反义RNA探针。可由构建的RNA表达载体而获得。 在RNA聚合酶的作用下，以DNA为模板合成反义RNA 探针。这种探针与切口平移标记的DNA探针相比，特异 性高，RNA/RNA形成的杂交分子具有热稳定性，而且 探针的大小也比较恒定，因而增加了杂交的敏感性及均 一性。此反义RNA探针不含有载体顺序，减少了非特异 性杂交，还能防止dsDNA中第二条链的竞争性杂交。杂 交后用RNA酶消化单链未杂交的探针，可明显减少本底。 因此，RNA探针在核酸原位杂交中的应用也越来越广泛。 示cDNA转录为cRNA，可标

5、记以不同的标记物，然后与细胞中的mRNA相结合。Biotin(生物素)，Au(金)，digo-（地高辛)/ebook/study/nuclear/16922.html cRNA探针在原位杂交组织化学 核酸杂交技术探针技术 利用标记分子对其它分子的识别 对后者进行检测探针带有供反应后检测的合适标记物，并与特异靶分子反应。 探 针 靶分子反应 抗 体 抗原 外源凝集素 碳水化合物、 亲合素 生物素、 受 体 配基（Ligand） 互补核酸间 标记方法 放射性探针 非放射性探针(一) 核酸分子杂交原理1DNA 变性 DNA 分子在一定条件下其双链之间的氢键断裂而形成单链分子现象称为 DNA 变性。热

6、变性：90-100C溶解温度 (melting temperature，Tm) 为双链 DNA 变性一半所需的温度。 碱变性：pH 10化学试剂变性：尿素、甲酰胺、甲醛2DNA 分子的复性 变性的 DNA 分子的两条互补单链在一定的条件下重新组合成双链螺旋结构，称为 DNA 复性或退火。Absorbance at 260 nm浓度 = 50 g/ml双链 DNA A260 = 1.00 单链 DNA A260 = 1.37碱基 A260 = 1.60变性 DNA 的粘度降低、A260 紫外吸收值增加。(二) 探针的标记1. 同位素标记探针 常用的同位素为 32P、35S2. 非同位素标记探针

7、非同位素标记探针不危害操作者的健康并且不污染环境； 非同位素标记探针比较稳定 (可储存一年以上) 并且可反 复使用多次； 多种检测方法 (显色反应、化学发光或荧光检测) 均能检 测出非同位素标记探针; 与同位素标记的探针有相同的敏感性。 常用的非同位素标记分的高辛 (Digoxigenin，DIG) 生物素 (Biotin) 3DIG 标记探针的方法(三) 膜支持物1硝酸纤维素膜 (Nitrocellulose membrane) DNA 非共价结合到膜上。 硝酸纤维素膜的强度低、易碎。2尼龙膜 (Nylon membrane) DNA 共价结合到带正电荷的尼龙膜上；尼龙膜有较强的结合 DNA

8、 的能力并能与 50 bp 的核苷酸链结合。 尼龙膜的强度高，利于探针的去除和重新杂交。(四) 受体分子从凝胶向膜的转移1. 毛细管转移 (Capillary transfer) 2. 电转移 (Electroblotting) 3. 真空或正压转移 (Vacuum or positive pressure blotting) 印渍技术 Blotting 首先由Edwen Southern在1975年提出。Blotting即“印渍”，指将存在于凝胶中的生物大分子转移（印渍）到固定化介质上，并加以检测分析的技术，目前广泛应用于DNA、RNA、和蛋白质的检测 印渍技术的类别及应用 DNA印迹技术

9、Southern blottingRNA印迹技术 Northern blotting蛋白质印迹技术 Western blotting 斑点印迹 Dot blotting原位杂交 in situ hybridization DNA点阵 DNA array DNA芯片技术 DNA chip 重 物转移缓冲液滤纸桥玻璃板硝酸纤维素膜或尼龙膜含变性 DNA的琼脂糖凝胶滤纸玻璃板纸 巾毛细管转移滤纸(五) 将受体分子固定在膜上的方法1. 干烤 置硝酸纤维素膜于抽真空的 80C 烤箱中 2 小时； 置尼龙膜于抽真空的 120C 烤箱中 2 小时。2. UV 交联作用 用 UV 将 DNA 固定在硝酸纤维素

10、膜或尼龙膜上。UV 交联仪(六) DIG 探针与受体分子的杂交靶分子 (DNA 或 RNA 分子)硝酸纤维素膜或尼龙膜DIG 标记的探针与靶分子杂交DIG 标记的探针DIG-dUMP(六) DIG 探针与受体分子的杂交(七) DIG 信号检测1. 在抗 DIG 抗体上偶联荧光素 用于原位杂交2. 在抗 DIG 抗体上偶联碱性磷酸酶，以碱性磷酸酶催 化的底物显色反应或化学发光反应检测 DIG 探针的 杂交信号。(1) 用于显色反应的底物 NBT (氮蓝四唑盐酸盐) BCIP (5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐) (2) 用于化学发光反应的底物 AMPPD、CSPD 和 CDP-Star用荧光素检测

11、杂交信号抗 DIG 抗体荧光素细胞核染色体抗 DIG 抗体用碱性磷酸酶检测杂交信号碱性磷酸酶显色反应底物 NBT (氮蓝四唑盐酸盐) BCIP (5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐) 化学发光反应底物 AMPPD、CSPD 和 CDP-Star核酸原位杂交的主要过程 经过五大过程：固定，预杂交、杂交、冲洗和显示。 一组织细胞的固定 进行核酸原位杂交的组织或细胞必须经过固定处理。 固定液：1.能很好地保护组织细胞的形态。 2.对核酸无抽提、修饰与降解作用。 3.不改变核酸在细胞内的定位。 4.对核酸与探针的杂交过程无阻碍作用。 5.对杂交信号无遮蔽作用。 6.理化性质稳定、价格低廉。 4%多聚甲醛：

12、能很好地保持组织或细胞内的RNA，一般固定10-15分钟RNA的含量比较恒定。 10%的甲醛液：虽然可促进DNA双链分子的交联进而变性，但用含50%的甲酰胺杂交液进行杂交可解决。 乙醇/冰醋酸（3/1）:虽然广泛用于核酸原位杂交时的组织细胞固定，不过固定后组织细胞内RNA明显减少，但同时本底也很低。二预杂交 目的：是去除核酸表面的蛋白质，以利于核酸探针对靶核 酸进行杂交。 组织细胞中的核酸都以核酸蛋白质复合体的形式存在与细胞浆或细胞核中，固定过程中固定液的交联作用时胞浆或胞核内的各种生物大分子形成网络，影响探针的穿透力，阻碍杂交体的形成。 常用的去垢剂：Triton-X100 十二烷基碘酸钠（

13、SDS） 常用的蛋白酶：蛋白酶K。三、杂交 杂交过程是核酸原位杂交技术的主要环节。1、探针的选择核酸原位杂交中所用的探针可以是双链的DNA（dsDNA）也可以是单链的DNA（ssDNA）,或为RNA。近年来人工合成的寡核苷酸也得到了广泛应用。一般而言，标记的DNA或RNA探针都可用于DNA或RNA的定位，其长度为50-300bp（碱基）最好，这个长度范围的探针在组织细胞中的穿透力好，杂交效率高。四、冲洗 杂交后冲洗是减低非特异性杂交的关键步骤，其SSC的浓度可低至0.1SSC。 应用放射性核素探针时，冲洗可达几小时，而用生物素及地高辛等标记的探针冲洗时间则可缩短为15分钟。 冲洗时温度不能高于

14、50，否则将导致组织细胞结构的破坏及组织或细胞从切片上脱落，使实验失败。 五、显示 核酸原位杂交结果的显示应体现特异性和敏感性。当DNA探针长度超过0.5Kb时非特异性杂交增多，本底增高。 探针与无关基因中部分同源顺序的非特异性结合亦是非特异性杂交的原因之一。 除探针的非特异性结合外，检测系统亦是导致非特异性结果的原因之一。 生物素标记的探针，常用免疫组织化学技术检测，在许多组织中因含有内源性生物素（维生素H）而出现假阳性结果。地高辛标记就不存在这种问题。 *对照试验核酸分子杂交方法及特点（一）DNA印迹技术 Southern blotting 又称为Southern杂交，即DNA-DNA杂交

15、分析。研究DNA图谱的基本技术用于基因组DNA分析，如在基因组中特异基因定位及检测用于分析重组质粒和噬菌体。遗传诊断DNA图谱分析及PCR产物分析基本方法DNA标本用限制性内切酶消化，经琼脂糖凝胶电泳分离各酶解片段；经碱变性，Tris缓冲液中和，高盐下通过毛吸作用将DNA从凝胶中转印至硝酸纤维素滤膜上，烘干固定，凝胶中DNA片段相对位置在DNA片段转移到滤膜的过程中继续保持着。附着在滤膜上的DNA与32P标记的探针杂交，利用放射自显影术确定探针互补的每条DNA带的位置，确定在众多酶解产物中含某一特定序列的DNA片段的位置和大小。Paper TowelsSouthern Blottingtiss

16、ueSDS蛋白酶K酚/氯仿无水乙醇离心斑点印迹Dot blotting斑点杂交法是不经过电泳，而将被检标本直接点到膜上，烘烤固定，用于杂交。这种方法耗时短，可做半定量分析，一张膜上可同时检测多个样品。 原位杂交* 细胞或染色体的原位杂交，用于基因定位。 * 细菌菌落的原位杂交：筛选阳性克隆。Tissue in situ hybridization 原位杂交即组织原位杂交，指组织切片或细胞涂片直接用于杂交分析。先经适当处理，使细胞通透性增加，让探针进入细胞内与DNA或RNA杂交。原位杂交可以确定探针的互补序列在胞内的空间位置，具有重要的生物学和病理学意义。 原位杂交还是显示细胞亚群分布和动向及病

17、原微生物存在方式和部位的一种重要技术。 用于原位杂交的探针可以是单链或双链DNA，也可是RNA探针。 探针的标记物可以是放射性同位素、放射性生物素和半抗原等，放射性同位素中，3H和35S最为常用，而32P能量过高，致使产生的影像模糊，不利于确定杂交位点。 原位杂交中，标本的固定条件是影响杂交效率的重要因素。标本组织蛋白质的消化程度对探针进入细胞极为重要，去除蛋白质的方法是，用0.2mol/l HCl处理载玻片，用蛋白酶K消化，然后用不同浓度的乙醇脱水。原位杂交还是一种新技术，发展很快，在敏感性、特异性、稳定性上还需进一步完善和提高。 原位杂交Northern blotBMP-4转染与未转染细胞

18、mRNA斑点杂交 双标记阳性者同一细胞中 原位杂交信号呈紫蓝色，位于细胞核中； 免疫组化阳性呈棕色，位于细胞膜或浆上/med/data/jcyx/blswx/201003/344927.html淋巴瘤的原位杂交和免疫组化双标记技术 基因的定量分析（二）RNA印渍技术 Northern blotting又称为Northern杂交，即RNA-DNA杂交分析。是一种将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上的方法。主要用于检测某一组织或细胞中已知的特异mRNA的存在及表达水平以及比较不同组织和细胞的同一基因的表达情况。RNA定量分析一个基因的表达，需要经过转录（mRNA生成）、翻译（蛋白质合成）、修

19、饰等过程，最后才能形成具有生物学活性的蛋白质分子。因此对一个基因的检测，可从其表达过程中的不同阶段来进行。mRNA检测是研究基因表达功能重要常用方法包括 Northern blot、 Slot blot、RT-PCR核糖核酸酶保护分析（ribonuclease protection assay，RPA）。mRNA定量的意义 特定基因表达水平可反映细胞的生长、存活状态,对特定基因转录水平的定量分析已成为基因功能研究的核心部分. mRNA定量分析用于临床诊断，包括检测肿瘤细胞耐药基因的调节与表达、化疗疗效的分析、基因治疗的生物动力学与转录、表达水平的研究;并提供了评价肿瘤进展,检测外周血中肿瘤细胞

20、的有效手段，还可用于病菌、病毒的检测 Northern blotNorthern杂交是研究基因表达的最严谨的方法之一， 可以定量分析组织中某一特异mRNA的表达丰度，根据其迁移的位置也可判断基因分子大小。 这一技术应用十分广泛，常用于基因表达调控、基因结构及功能、遗传变异及病理研究 RT-PCR半定量分析基因表达mRNAcDNAPCR（内参基因）RNA酶保护性实验（Ribonuclease protection assay，RPA）mRNA定量分析方法将标记的特异RNA探针与待测的RNA样品液相杂交，标记的特异RNA探针按碱基互补的原则与目的基因特异性结合，形成双链RNA，免受RNA酶的消化；

21、未结合的单链RNA经RNA酶A或RNA酶T1消化形成寡核糖核酸，故该方法命名为RNA酶保护实验。对于32P标记的探针，杂交双链进行变性聚丙酰胺凝胶电泳，用放射自显影系统检测被保护的探针的信号；对于生物素标记的探针，杂交双链经过变性聚丙酰胺凝胶电泳后电转移至尼龙膜，采用链霉亲和素辣根过氧化物酶（Streptavidin-HRP）和化学发光底物与膜上biotin标记的探针结合，X射线胶片或化学发光图像分析仪检测杂交信号。RPA可用于检测在总RNA混合物中特定mRNA分子的表达。尽管操作比较复杂，但是这种方法可以在一次检测中分析多达25样品。敏感性和高通量的优点使得RPA在病原体的发现中显得非常有用

22、。由RPA得到的结果，结合普通的形态学技术有助于阐明疾病的发生过程。DNA微阵列技术芯片将成千上万种基因的DNA片段有组织的点在固相片基上，将这种芯片作为探针，去检测不同组织和不同细胞的基因表达情况。应 用DNA微阵列技术的应用包括:基因表达分析、多基因突变和多态性检测、疾病诊断和分型、研究疾病分子机制药物筛选和疫苗开发 Western杂交(蛋白质印迹)* 蛋白质水平上的杂交技术，又称为免疫印迹，即检测蛋白质与标记的特定蛋白抗体结合，经放射自显影显示条带，根据条带密度确定蛋白质表达量。* 与DNA、RNA水平上的Southern杂交、Northern杂交相对应，称为Western杂交。* 常结

23、合Northern印迹技术，检测基因表达调控。Western blotting用于检测样品中特异性蛋白质的存在、细胞中特异蛋白质的半定量分析以及蛋白质分子的相互作用研究等。 检测一个基因的表达产物是否正确，或者比较表达产物量的 相对变化，首选方法是 Western blot Western blot SDSWestern blot三种印迹技术的比较免疫组化操作规程 1、脱蜡和水化 脱蜡前，应将组织芯片在室温中放置60分钟或60恒温箱中烘烤20分钟。 1）组织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟，2次 2）无水乙醇中浸泡5分钟； 3）95%乙醇中浸泡5分钟； 4）70%乙醇中浸泡5分钟； 2、抗原修复 用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片。 1）抗原热修复 （1）高压热修复 ：在沸水中加入EDTA或枸橼酸钠缓冲溶液。玻片在缓冲液中浸泡5分钟，加压10分钟，（适用于较难检测或核抗原的抗原修复）。（2）煮沸热修复 水浴锅加热枸橼酸钠缓冲溶液至95左右，放入组织芯片加热1015分钟。（3）微波热修复 适用的抗原有：AR，Bax，Bcl-2，C-fos，X-jun，C-kit，C-myc，E-cadherin，Chromogranin A，Cyclin，ER，Heat shock protein，HPV，Ki-67，MDMZ，p53，p34，p16，p15，P-glyco