《专题2课题2土壤中分解尿素的细菌的分离和计数》课件

1、尿素分子的立体结构CO（NH2）2+H2O CO2+2NH3脲酶课题21、常见的分解尿素的微生物芽孢杆菌、小球菌、假单胞杆菌、克氏杆菌、棒状杆菌、梭状芽孢杆菌，某些真菌和放线菌也能分解尿素。2、课题目的一、从土壤中分离出能够分解尿素的细菌二、统计每克土壤样品中尿素细菌的数目启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。. 筛选菌株PCR技术是一种常用的DNA扩增技术，此项技术的自动化，需要使用耐高温的DNA聚合酶，如果请你来找这种耐高温的酶，你会去哪里找？热泉70-80摄氏度的高温条件淘汰了绝大多数微生物，而耐热的Taq细菌脱颖而出。水生耐高温细菌Taq1、实验室微生物的

2、筛选原理（P21） 人为提供有利于目的菌株生长的条件（包括营养、温度、pH等），同时抑制或阻止其他微生物生长。（一）筛选菌株一、研究思路2、选择培养基 在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称做选择培养基。（一）筛选菌株一、研究思路加入青霉素的培养基 细菌不生长，酵母菌、霉菌等真菌能生长不加含碳有机物的无碳培养基 分离自养型微生物 1.在培养基的配方中，为微生物的生长提供碳源和氮源的分别是是什么物质？碳源是葡萄糖，氮源是尿素2.分析该配方的培养基对微生物是否具有选择作用？如果有，又是如何进行选择的？有筛选作用。尿素是培养基中的唯一氮源，因此，原则上

3、只有能够利用尿素的微生物才能够生长。阅读22页本课题使用的培养基配方二、统计菌落数目显微镜直接计数法稀释涂布平板法（活菌计数法）（二）微生物计数1、显微镜直接计数法1mm一、研究思路每一个大方格边长为 1mm ，则每一大方格的面积为1mm2，盖上盖玻片后，载玻片与盖玻片之间的高度为0.1mm，所以计数室的容积为0.1mm3。1mm下面以一个大方格有25个中方格的计数板为例进行计算：设五个中方格中总菌数为A，菌液稀释倍数为B，那么，一个大方格中的总菌数是多少?1ml菌液中的总菌数?(1ml=1cm3=1000mm3）5AB1045A缺点：不能区分死菌与活菌2、统计菌落数目稀释涂布平板法（二）微生

4、物计数平板菌落数统计注意事项1、几个菌落粘连一起，只要肉眼能区分，就算几个；2、不管菌落大小，只要肉眼看得见，就应该计数；3、菌落数目过多时，可以合理采用样方法。某班级菌落数统计表格第1组第2组第3组第4组151216519095256820717716235721781881024平均每mL样品中活菌数平板组别恰当的稀释度、正确的涂布操作是成功地统计菌落数目的关键。（取样0.1mL,稀释倍数106）【例1】某同学在稀释倍数为106的培养基上测得平板上的菌落数的平均值为234，那么每毫升样品中菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为0.1 mL）A.2.34108B.2.34109C.234D.

5、23.4思考1：如何根据平板上的菌落数推测出每mL样品中的菌株数？14【解析】选B。稀释倍数为106，0.1 mL稀释液的菌落数的平均值为234，则每毫升样品中菌落数就为234/0.1106=2.34109。每mL样品中的菌株数=（CV）MC：某一稀释度下平板上生长的平均菌落数V：涂布平板时所用的稀释液的体积M：稀释倍数思考2：为什么测平板上的菌落数可以推测样品中的活菌的数目？当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约有多少活菌。为了保证结果准确，一般选用菌落数在30300的平板进行计数。思考3：统计的菌落数往往

6、比活菌的实际数目高还是低，为什么？低。因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。因此，统计结果一般用菌落数而不是活菌数来表示。 第一位同学只涂布了一个平板，没有设置重复组，因此结果不具有说服力。 第二位同学考虑到设置重复组的问题，涂布了3个平板，但是，其中1个平板的计数结果与另2个相差太远，说明在操作过程中可能出现了错误，因此，不能简单地将3个平板的计数值用来求平均值。实例分析1启 示在设计实验时，一定要涂布至少3个平板，作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性。在分析实验结果时，一定要考虑所设置的重复组的结果是否一致，结果不一致，意味着操作有误，需要重新实验。实例分析2想一

7、想：A同学和其他同学所得实验结果差异 如此之大，请分析原因可能有哪些？实例分析2想一想：你能通过设置对照，帮助A同学排除 上述两个可能影响实验结果的因素吗？一种方案： 可以由其他同学用与A同学一样的土样进行实验。如果结果与A同学一致，则证明A无误；如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。实例分析想一想：你能通过设置对照，帮助A同学排除 上述两个可能影响实验结果的因素吗？另一种方案： 将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。 实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的！ 实例启示设置对照实验的目的是什么？ 排除实验操作、培养条件

8、等无关变量对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。（三）实验基本原则1、平行重复原则2、对照原则3、单一变量原则一、研究思路实验名称：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数实验原理：实验目的：材料用具：方法步骤：1、分组编号 2、处理（遵循实验设计的基本原则） 对照原则、单一变量原则（等量原则） 科学性原则、平行重复原则 可行性原则 3、观察记录（设计观察记录表）实验预期：实验结果的分析与评价：实验结论：设计时请利用P23-P24的三个资料二、实验设计实验名称：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数实验原理：实验目的：材料用具：方法步骤：1、分组编号 2、处理（遵循实验设计的基本原则） 对照原则、单一变量

9、原则（等量原则） 科学性原则、平行重复原则 可行性原则 3、观察记录（设计观察记录表）实验预期：实验结果的分析与评价：实验结论：设计时请利用P23-P24的三个资料二、实验设计实验设计实验名称：实验目的：实验原理：实验用具：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数将土壤中能够分解尿素的细菌筛选出来，并进行统计分析。1.提供以尿素作为唯一氮源的培养基，原则上只有能分解尿素的培养基才能生长。小铁铲、信封、酒精灯、培养皿、试管、试管架、移液管、胶头滴管、蒸馏水、选择培养基、牛肉膏蛋白胨培养基等。2.当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。实验设计土壤中分解尿素的细菌的

10、分离与记数1.土壤取样2.制备培养基3.样品稀释、取样涂布4.微生物的培养、观察并记录结果5.细菌的计数土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。实验步骤1土壤取样 制备5个牛肉膏蛋白胨培养基和15个选择培养基，准备好无菌试管和移液管。实验步骤2.制备培养基 制备5个牛肉膏蛋白胨培养基和15个选择培养基，准备好无菌试管和移液管。 注：每个稀释度下需要3个选择培养基（平行重复原则），1个牛肉膏蛋白胨培养基。选用稀释倍数为103107的稀释液。实验步骤2.制备培养基为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？测定土壤中细

11、菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？ 因为土壤中各类微生物的数量(单位：株/kg)是不同的，例如在干旱土壤中的上层样本中：好氧及兼性厌氧细菌数约为2 185万，放线菌数约为477万，霉菌数约为23.1万。因此，为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度进行分离，同时还应当有针对性地提供选择培养的条件。测定土壤中细菌的数量，一般选用104、105和106倍的稀释液进行平板培养；测定放线菌的数量，一般选用103、104和105倍稀释液；测定真菌的数量，一般选用102、103和104倍稀释液。注： 样品的稀释 将10g土样加入盛有90mL无菌生理盐水的锥形瓶中,充分摇

12、匀，吸取上清液1mL，转移至盛有9mL水的无菌试管中，依次等比稀释至107稀释度，并按照由107至103稀释度的顺序分别吸取0.1mL进行平板涂布操作。按照浓度从低到高的顺序涂布平板，不必更换移液管。实验步骤3.样品稀释、取样涂布注意：由于初次实验，对于稀释的范围没有把握，因此选择了一个较为宽泛的范围：稀释倍数为103107。将涂布好的培养皿放在30下培养。比较牛肉膏培养基和选择培养基中菌落的数量、形态等，并做好记录。4.微生物的培养、观察并记录结果不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。细菌一般在3037的温度下培养12d；放线菌一般在2528的温度下培养57d；而霉菌一般在25

13、28的温度下培养34d。注：一般来说，在一定的培养条件下(相同的培养基、温度及培养时间)，同种微生物表现出稳定的菌落特征。 当菌落数目稳定时，选取菌落数在30300的平板进行计数。在同一稀释度下，至少对3个平板进行重复计数，然后求出平均值，并根据平板所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。实验步骤5.细菌的计数操作提示一无菌操作1、取土用的小铁铲的盛土样的信封在使用前都需要灭菌。2、应在火焰旁称取土壤。在火焰附近将称好的土样倒入锥形瓶中，塞好棉塞。3、在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作。二做好标记注明培养基种类、培养日期、平板培养样品的稀释度等。三规划时间课题延伸CO（NH2）2+H2OCO2+2NH3脲酶pH升高指示剂（酚红）将变红挑选选择培养基中不同形态的菌落接入含酚红培养基的斜面中，观察能否变红。1、结合对照，分析培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出一些菌落。2、是否获得了某一稀释度下，菌落数目在30300的平板。在这稀释度下，是否至少有两个平板的菌落数相近？3、你统计的每克土壤中含有能分解尿素的细菌