基因工程原理习题参考答案(共20页)

1、PAGE PAGE 32基因工程(jyn gngchng)原理习题集参考答案一、名词(mng c)解释(jish)1、DNA分子克隆技术：克隆，指含有单一的DNA重组体的无性繁殖系，或指将DNA重组体引入宿主细胞建立无性繁殖系的过程。DNA分子克隆技术也称基因克隆技术，是在体外将DNA分子片段与载体DNA片段连接，转入细胞获得大量拷贝的过程。其基本步骤包括：制备目的基因将目的基因与载体用限制性内切酶切割和连接，制成DNA重组导入宿主细胞筛选、鉴定扩增和表达。载体在细胞内自我复制，并带动重组的分子片段共同增殖，从而产生大量的DNA分子片段。主要目的是获得某一基因或DNA片段的大量拷贝，有了这些与

2、亲本分子完全相同的分子克隆，就可以深入分析基因的结构与功能，随着引入的DNA片段不同，有两种DNA库，一种是基因组文库，另一种是cDNA库。2、分子杂交：两条不同来源的DNA（或RNA）链或DNA与RNA之间存在互补顺序时，在一定条件下可以发生互补配对形成双螺旋分子，这种分子称为杂交分子。形成杂交分子的过程称为分子杂交。3、限制性片段长度多态性：从不同个体制备的DNA，使用同一种限制性内切酶酶切，切得的片段长度各不相同。酶切片段的长度可以作为物理图谱或者连接图谱中的标记子。通常是在酶切位点处发生突变而引发的。4、报告基因：一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因,也就是说,是一个表达产物非常容易被鉴

3、定的基因、5、多聚酶链式反应（PCR）：一种体外扩增DNA的方法。PCR使用一种耐热的多聚酶，以及两个单链引物。以过高温变性将模板DNA分离成两条链。低温退火使得引物和一条模板单链结合，然后是中温延伸，反应液的游离核苷酸紧接着引物从5/端到3/端合成一条互补的新链。而新合成的DNA又可以继续进行上述循环，因此DNA的数目不断倍增。6、核酸的凝胶电泳：将某种分子放到特定的电场中，它就会以一定的速度向适当的电极移动。某物质在电场作用下的迁移速度叫做电泳的迁移率，它与电场强度成正比，与该分子所携带的净电荷数成正比，而与分子的摩擦系数成反比（分子大小、极性、介质的粘度系数等）。在生理条件下，核酸分子中

4、的磷酸基团是离子化的，所以，DNA和RNA实际上呈多聚阴离子状态。将DNA、RNA放到电场中，它就会由负极向正极移动。在凝胶电泳中，一般加入溴化乙锭进行染色，此时，核酸分子在紫外光下发出荧光，肉眼能看到约50ngDNA所形成的条带。7、细菌转化：所谓细菌转化，是指一种细菌菌株由于捕获了来自另一种细菌菌株的DNA，而导致遗传特性发生改变的过程。这种提供转化DNA的菌株叫做供体菌株，而接受转化DNA的菌株则叫做受体菌株。大肠杆菌是使用最广泛的实验菌株。8、反义核酸：指与靶DNA或RNA碱基互补，并能与之结合的一段DNA或RNA。9、RNA interference：是一种进化上保守的抵御转基因或外

5、来病毒侵犯的防御机制。将与靶基因的转录产物mRNA 存在同源互补序列的双链RNA 导入细胞后,能特异性地降解该mRNA ,从而产生相应的功能表型缺失,这一过程属于(shy)转录后基因沉默机制范畴。10、Spi：噬菌体体重组(zhn z)克隆的一种筛选方法，其筛选方法是Spi+：不能感染(gnrn)E.coli(p2)； Spi-：(red- gam-)能感染E.coli(p2),形成小噬斑/host recA+/chi。包装时若gam- ,需recA产物的作用才可形成噬斑(但为小噬斑)，所以对宿主菌有要求(recA+)但recA+可引起其它重组：载体改为red-/gam+可在recA-受体中增

6、殖。11、DNA文库：将某种生物的基因组DNA切割成一定大小的片段，并与合适的载体重组后导入宿主细胞，进行克隆。这些存在于所有重组体内的基因组DNA片段的集合，即基因组文库，它包含了该生物的所有基因。12、cDNA：cDNA是指以mRNA为模板，在逆转录酶的作用下形成的互补DNA。13、cDNA文库：以细胞的全部mRNA逆转录合成的cDNA组成的重组克隆群体称为cDNA文库。14、DNA探针：是带有标记的一段已知序列DNA，用以检测未知序列、筛选目的基因等方面广泛应用。15、转导（作用）：借助于病毒载体，遗传信息从一个细胞转移到另一个细胞。16、染色体步移：通过相互重叠的基因组克隆之间进行一连

7、串杂交从而实现染色体上基因的定位。17、斑点杂交：将被检标本点到膜上，烘烤固定后与探针进行杂交。这种方法耗时短，可做半定量分析，一张膜上可同时检测多个样品。18、-complementation：质粒载体重组克隆的筛选方法，LacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的-半乳糖苷酶阴性的突变体之间实现互补。LacZM15 ：放在F质粒上，随宿主传代；LacZ ：放在载体上，作为筛选标记。19、菌落原位杂交：将细胞从培养平板转移到硝酸纤维素滤膜上，然后将滤膜上的菌落裂解以释放出DNA。将DNA烘干固定于膜上与32P标记的探针杂交，放射自显影检测菌落杂交信号，并与平板上的菌落

8、对位。20、核酸原位杂交：标记探针与细胞或组织切片中的核酸进行杂交的方法。21、限制性内切酶：识别DNA的特异序列，并在识别点或其周围切割双链DNA的一类核酸内切酶。22、酶切位点：DNA上一段碱基的特定序列，限制性内切酶能够识别出这个序列并在此将DNA酶切成两段。23、DNA连接酶：催化(cu hu)DNA中相邻的5/磷酸(ln sun)基与3/羟基(qingj)间形成磷酸二酯键，使DNA切囗封合，连接DNA片段。24、持家基因：是指对所有类型组织细胞在任何时候都需要其表达的基因，通常都是维持细胞基本生存所必须的基因，其表达常保持在固定的水平。又称为组成性表达基因。25、奢侈基因：只在某特定

9、的细胞类型中表达或者说只在发育阶段的某些时期表达的基因叫做奢侈基因。26、Tm值：是反映DNA的热稳定性的一个参数，称为DNA的熔解温度，系指一半的双链DNA解离成为单链时的温度。27、分子标记：广义的分子标记是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质。蛋白质标记包括种子贮藏蛋白和同工酶（指由一个以上基因位点编码的酶的不同分子形式）及等位酶（指由同一基因位点的不同等位基因编码的酶的不同分子形式）。狭义的分子标记是指能够用来作为指纹鉴定或区分个体特点的DNA片段。28、基因工程：指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其他载体分子中，构成遗传物质的重新组合，使之进入原先没有这类分子的寄主细胞内并进行持续

10、稳定的繁殖和表达的过程。29、载体：是携带外源DNA进入宿主细胞进行扩增和表达的DNA，它们一般是通过改造质粒、噬菌体或病毒等构建的。30、卫星DNA：又称短串联重复，26个核苷酸组成的重复单位串联重复（1060次），两侧为特异的单拷贝序列，人类基因组中每10kbDNA序列至少有一个STR序列。31、多克隆位点：DNA中含有两个以上密集的、能被多种限制性内切酶识别和切割的位点区。32、定位克隆：也称为图位克隆，是在获取基因在染色体上的位置信息后，采用各种实验方法对基因进行克隆和定位。定位克隆包括定位和克隆两个过程，定位是通过连锁分析找出与目的基因紧密连锁的遗传标记在染色体上的位置，克隆是从定位

11、的染色体区段内分离克隆所要的基因，并进一步研究其功能。 也可以回答为“通过遗传标记”先获得某一表型基因在染色体上的定位，再在候选区域内选择已知基因，进行突变的筛选，并获得cDNA及全基因的过程。33、基因芯片：基因芯片又称为DNA微阵列，以基因序列为分析对象的微阵列，是通过缩微技术，根据分子间特异性地相互作用的原理，将生命科学领域中不连续的分析过程集成于硅芯片或玻璃芯片表面的微型生物化学分析系统，以实现对细胞、蛋白质、基因及其他生物组分的准确、快速、大信息量的检测。34、RT-PCR：是以RNA为起始材料经逆转录反应产生cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增，从而获取目的基因或检测基因表达

12、。主要用于分析基因的转录产物，克隆cDNA及合成cDNA探针，改造cDNA序列等。35、锚定PCR：用于在体外扩增未知序列的DNA片段的方法，一般的PCR必须预先知道欲扩增DNA片段两侧的序列，但人们经常需要(xyo)分析一端序列未知的基因片段，可利用锚定PCR。该法的基本原理是在基因未知序列端添加同聚物尾，人为赋予未知基因末端序列信息，再用人工合成的与多聚尾互补的引物作为锚定引物，在与基因另一侧配对的特异引物参与下，扩增带有同聚物尾的序列。锚定引物PCR对分析未知序列基因有特殊用途。36、反向PCR：常规PCR可扩增位于两个引物之间的DNA片段，但不能扩增引物外侧的DNA序列，反向PCR则可

13、扩增引物外侧的DNA片段，对已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增和研究。其原理为：先用一种在目标DNA区段上没有识别位点的限制性内切酶从距离目标DNA一定距离的两侧位置切割DNA分子，然后将这些片断进行分子内连接(linji)形成环，根据已知的目标DNA序列按照向外延伸的要求设计一对向外引物，保证被扩增的是目标DNA区段两侧的未知序列。37、多重PCR：在同一反应中采用多对引物同时扩增几个不同DNA片段，如果基因某一区段缺失，则相应的电泳图谱上此区段PCR扩增产物消失，从而发现基因异常。多重PCR具有灵敏、快速的特点，特别适用于检测单拷贝基因缺失、重排、插入等异常改变(gibin)，其结果与s

14、outhern blotting一样可靠。38、质粒：是染色体外能够进行自主复制的遗传单位，包括真核生物的细胞器和细菌细胞中染色体以外的脱氧核糖核酸（DNA）分子。现在习惯上用来专指细菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体以外的DNA分子。在基因工程中质粒常被用做载体。39、粘粒载体：也叫柯斯质粒，是一类人工构建的含有DNA的cos序列和复制子的特殊特殊类型的质粒载体。40、穿梭质粒载体：是人工构建的一类具有两种不同复制起点和选择记号，因而可以在两种不同寄主细胞中存活和复制的质粒载体。41、基因突变：基因突变是指由于DNA碱基对的置换、增添或缺失而引起的基因结构的变化，亦称点突变。42、逆转录酶：在

15、体内、外均能转录病毒性RNA成为DNA，称为依赖RNA多聚酶，即为逆转录酶。分布在病毒的类核内。逆转录酶与三种功能有关： 使RNA一DNA杂合双链形成；切除杂合双链中的RNA链；进而再生成DNA一DNA的双链。43、扣除杂交：就是用一般细胞的mRNA与特殊细胞的cDNA杂交，先扣除一般共有的cDNA，再将剩下的特异的cDNA进行克隆，用此方法已成功克隆出控制动物胚胎发育和组织分化的基因。44、测序酶 为修饰的T7 DNA polymerase，99%3-5外切活性被除去（Version1.0）；完全除去(V 2.0)；用于测序反应(测序酶)。45、YAC载体(zit) 酵母人工染色体载体；含酵

16、母染色体复制(fzh)起点ori，自主复制(fzh)序列ARS；着丝粒（CEN）；两个端粒（TEL）。用于克隆50kb以上甚至-Mb（200-500kb）。原生质体电转化，URA3-trp-ade2-1赭石突变酵母菌，红色菌落插入失活。46、同尾酶 一类产生相同粘性末端的限制性内切酶。47、cI筛选法 C基因发生突变时不能溶源化，C- ：在hflA（高频溶源化）中形成噬斑。C+ 在hflA中形成溶源，产生混浊噬斑。48、Sanger测序 即酶法测序，用双脱氧核苷酸作为链终止试剂，通过聚合酶的引物延伸产生一系列大小不同的分子后再进行分离的方法。49、同裂酶：DNA经限制性内切酶切割后，产生相同粘

17、性末端，这类限制性内切酶称为同裂酶。50、复制起点：DNA复制的起始位点，DNA复制在起始位点处形成复制叉进行双向复制，通常DNA复制的起始DNA序列存在重复倒位序列。51、启动子：启动子是DNA分子可以与RNA聚合酶特异结合的部位，也就是使转录开始的部位。在RNA合成开始位点的上游大约10bp和35bp处有两个共同的顺序，称为-10和-35序列。这两个序列的共同顺序如下,-35区“AATGTGTGGAAT”，-10区“TTGACATATATT”。大多数启动子均有共同顺序(consensus sequence)，只有少数几个核苷酸的差别。52、起始密码子：AUG不仅是Met或者fMet(在原核

18、细胞)的密码子，也是肽链合成的起始信号，故称AUG为起始密码子。53、起始因子： 在蛋白质生物合成的起始阶段与核糖体亚基结合，起始蛋白质的合成。在E.coli中已分离出三种IF。IF1、IF2和IF3。其中，IF3具有形成三元复合物和解离因子活性，使70S核糖体颗粒解离为30S和50S亚基；IF2形成30S前起始复合物；IF1无特异功能，但具有加强 IF2和IF3的活性作用。54、复制终点DNA复制的终止位点，DNA复制在起始位点处形成复制叉进行双向复制，在终止位点处终止DNA复制，通常DNA复制的终点DNA序列存在重复倒位序列。55、终止子：细菌DNA中有转录终止信号，称为终止子。作用是在D

19、NA模板的特异位点处终止RNA的合成。在终止子处，RNA聚合酶停止其聚合作用，将新生RNA链释出，并离开模板DNA。56、终止密码子：UAA、UAG和UGA为终止密码子，不代表任何氨基酸，也称为无意义密码子。57、终止因子： 蛋白质肽链合成的终止因子，在E.coli中已分离出三种释放因子。RF1，RF2和RF3。其中，只有RF3与GTP(或GDP)能结合。它们均具有识别mRNA链上终止密码子的作用，使肽链释放，核糖体解聚。二、选择(xunz)题参考答案1、B 2、B 3、C 4、C 5、B 6、C 7、B 8、C 9、B 10、C 11、C 12、C 13、D 14、B 15、C 16、D 1

20、7、B 18、C 19、B 20、D 21、D 三、填空题参考答案1、外显子,内含子,断裂基因； 2、必须基因,非必须基因； 3、转化,供体菌株,受体菌株； 4、变性(binxng)、退火、延伸；5、碱性(jin xn)磷酸酶，5磷酸；6、质粒载体、 噬菌体载体、人工染色体载体。7、200-500kb， 10-215kb，平均100kb；8、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶，聚丙烯酰胺凝胶；9、切口平移法、随机引物法；10 GAATTC， GGATCC，GATC ；11、RNA酶，RNA；12、小于10kb，9-23kb；13、 最快，最慢，居中。14、复制区，IG区。四、判断题参考答案：1、错误

21、2、错误 3、错误 4、错误五、说明题（下列各项在基因工程中的主要作用或功能）参考答案：1、电泳介质,用于分离大小相差1bp的DNA,或用于分离蛋白质。2、用于制备单链DNA,因载体有单链丝状噬菌体的IG区,在帮助单链噬菌体的帮助下在宿主细胞中制备单链DNA。3、补齐DNA5端缺失的磷酸4、用于植物基因工程的转化载体, 内含T-DNA区。5、DNA合成底物。6、电泳介质,用于分离大DNA或RNA7、作为分子杂交用,用于筛选与探针同源的基因8、除去DNA5端的磷酸基,防止DNA重组时载体的自连9、安慰诱导物,结构与别乳糖相似,用于诱导乳糖操纵元的表达10、生色剂，-半乳糖苷酶分解X-gal形成蓝

22、色产物，用于互补或蓝白斑筛选。六、问答题参考答案：1、分子标记是能够用来作为指纹鉴定或区分个体特点的DNA片段。这种标记在遗传学研究和生物技术应用方面具有非常重要的作用。分子标记的基础是个体间存在的自然遗传变异，进而造成许多遗传序列的多态性，即这些序列在不同的个体表现不同。分子标记就是通过查找和应用这种变异对个体、性状和基因在遗传差异的基础上进行鉴别。 （1）限制性片段(pin dun)长度多态性 这是发展最早的分子标记技术。其原理是检测DNA在限制性内切酶酶切后形成的特定DNA片段的大小。因此凡是可以(ky)引起酶切位点发生变异的突变都可导致RFLP的产生。此技术包括以下基本步骤： DNA的

23、提取(tq)和纯化；DNA的限制性内切酶酶切；用凝胶电泳将DNA片段分开；把DNA片段转移到滤膜上；利用放射性标记的探针与滤膜上的DNA片段进行杂交以显示特定的DNA片段，然后分析结果。（2）随机扩增多态性DNA该技术用随机引物非定点地扩增DNA片段，然后用聚丙烯酰胺凝胶电泳分开扩增片段。其特点包括：不需DNA探针，设计引物也不需要预先知道序列信息；用一个引物就可扩增出许多片段，总的来说RAPD在检测多态性时是一种相当快速的方法；技术简单，RAPD分析不涉及分子杂交、放射自显影或其他技术；RAPD分析所需DNA样品量少；RPD分析中存在的最大问题是重复性不太高，因为在PCR反应中条件的变化会引

24、起一些扩增产物的改变。（3）扩增片段长度多态性 其特点是把RFLP和PCR结合了起来。其基本步骤是：把DNA进行限制性内切酶酶切，然后选择特定的片段进行PCR扩增（在所有的限制性片段两端加上带有特定序列的“接头”），用接头互补的但3/端有几个随机选择的核苷酸的引物进行特异PCR扩增，只有那些与3/一端严格配对的片段才能得到扩增，再在有高分辨率的测序胶上分开这些扩增产物，用放射性法、荧光法或银染色法均可检测之。（4）单核苷酸多态性技术 同一位点的不同等位基因之间常常只有一个或几个核苷酸的差异，因此在分子水平上对单个核苷酸的差异进行检测是很有意义的。目前SNP作为一种新的分子标记，已 有2000多

25、个标记定位于人类染色体上，在植物上也在进行开发研究。2、类限制性核酸(h sun)内切酶、类限制性核酸(h sun)内切酶和类限制性核酸(h sun)内切酶三类。类限制性核酶最适合基因工程，因为类限制性核酶内切酶只由一条肽链构成，仅需MG2+，切割DNA特异性最强，且就在识别位点范围内切断DNA。类和类限制性核酸内切酶由于切割序列是随机的，与识别序列不统一，因此在基因工程中没有什么价值。3、细菌通过对自身DNA上的识别序列进行甲基化来保护自己的DNA不被限制性内切酶破坏。4、对于平末端DNA，右先连上工设计合成的EcoRI切割产生的脱氧寡核苷酸双链接头，然后再插入到EcoRI限制位点中去；也可

26、以将EcoRI的限制位点进行改造，将粘性末端变成平末端后，用T4DNA连接酶进行连接。5、 6、重组DNA的主要步骤主要包括以下四个基本步骤： （1）目的基因的获得； （2）目的基因与载体分子在体外进行连接反应，形成重组体； （3）将人工重组的DNA分子导入能进行正常复制的寄主细胞，从而得到复制； （4）重组体分子的转化子克隆的选择和筛选。7、重组DNA的主要步骤主要包括以下四个基本步骤： （1）目的基因的获得； （2）目的基因与载体分子在体外进行连接反应，形成重组体； （3）将人工重组的DNA分子导入能进行正常复制的寄主细胞，从而得到复制； （4）重组体分子的转化子克隆的选择和筛选。8、差异

27、克隆：利用来源不同DNA之间的表现度差异来分离差异表达基因的功能克隆方法。在任何组织中都表达的基因是管家基因，在大多数cDNA文库中都出现。用一个来源的cDNA去除第二个来源中共同的RNA，留下独特的RNA用于文库构建。9、基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其他载体分子中，构成遗传物质的重新组合，使之进入原先没有(mi yu)这类分子的寄主细胞内并进行持续稳定的繁殖和表达的过程。 基因工程是基因分子(fnz)水平上的遗传工程，是一门能定向改造生物遗传性状的育种新技术。基因工程能使带有各种遗传信息的DNA片段越过不同生物间特异的细胞界限而组入到完全不同的生物体内。定向地控制、修饰和改变

28、生物体的遗传和变异，从而创造出自然界没有或具有新的遗传性状的生物新品种。10、(1)具有多克隆位点； （2）能自我复制； （3）具有筛选(shixun)标记；（4）在细胞内的稳定性。11、 (1)具有多克隆位点； （2）能自我复制； （3）具有筛选标记；（4）在细胞内的稳定性。12、（1）cDDNA是指以mRNA为模板，在逆转录酶的作用下形成的互补DNA。以细胞的全部mRNA逆转录合成的cDNA组成的重组克隆群体称为cDNA文库。 基因组文库指的是将某种生物的基因组DNA切割成一定大小的片段，并与合适的载体重组后导入宿主细胞,进行克隆得到的所有重组体内的基因组DNA片段的集合,它包含了该生物的

29、所有基因。 （2）基因组文库与cDNA文库的差别：基因组文库中包含了甩有的基因，而cDNA文库只包含表达的基因，缺乏内元和调节序列，因此在研究基因结构时没有多大用处。cDNA文库代表了mRNA的来源，其中一些特定的转录本丰富而另一些很少，所以存在丰度的差别；而基因组文库在理论上均等地代表了所有基因序列。从不同细胞类型制备的cDNA文库包含一些共同序列和独特序列，可用于分离差别表达的基因；基因组文库中不能。基因组文库由于含有不表达序列，因此比cDNA文库大。mRNA在不同的组织之间存在丰度的差异，因此cDNA文库的在构建时对于mRNA含量较少的就比较困难，而基因组文库不存在这样的问题。13、（1

30、）抗生素抗性基因插入失活法； （2）一半乳糖苷酶基因失活插入法； （3）放射性标记核酸探针杂交法。14、构建cDNA文库的主要步骤：mRNA分离； cDNA第一链合成； cDNA第二链合成 载体(zit)与cDNA的连接；噬菌体的包装(bozhung)及转染； cDNA文库(wnk)的扩增和保存。15、聚合酶链反应，是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的的方法，因此也称为基因的体外扩增法。是20世纪80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点。其应用主要是以下几个方面： （1）科学研究： 基因克隆；DNA测序；分析突变；基因重组

31、与融合；检测基因的修饰；鉴定与调控蛋白质结构的DNA序列；转座子插入位点的绘图；合成基因的构建；构建克隆或表达载体；检测某基因的内切酶多态性等。 （2）临床诊断：细菌、病毒、螺旋体、支原体、衣原体、立克次氏体、分枝杆菌等病原体的鉴定；人类遗传病的鉴定；诊断遗传疾患；临测临床标本中病原体的核酸序列；对法医学标本做遗传学鉴定；分析激活癌基因中的突变情况；生成克隆化双链DNA中的特异序列作为探针。16、（1）相同点：反应的底物都是dNTP（dATP、dCTP、dTTP、dGTP）；都需要DNA聚合酶的催化，而且链的延伸都只能是5/3/方向；都需要模板，都按半保留复制机理进行；都需要引物；都需要MG2

32、+催化。（2）不同点：细胞内DNA复制是半不连续复制，而PCR中，DNA是连续复制；细胞内DNA的复制时，不需要将双链完全解开形成单链，按半不连续方式进行DNA的复制，而PCR反应中，DNA双链必须完全解链，复制过程都是连续进行的；细胞内DNA的复制时，DNA的解链通过解链酶催化，而PCR反应中是通过高温使双链解离；细胞内DNA的复制时，引物是通过RNA聚合酶和成的RNA链，而PCR反应中所需的引物是人工合成的寡聚核苷酸； 细胞内DNA的复制时，温度保持一致，而PCR反应中，温度在解链温度、退火、延伸3个温度之间变化。17、PCR反应五要素：参加PCR反应的物质主要有六种，即引物、耐热DNA聚

33、合酶、dNTPs（包括dATP，dCTP，dGTP，dTTP，是PCR反应中靶DNA序列扩增的原料）、模板DNA和缓冲液（通常含有MGCl2、Tris一HCl、KCl等）、MG2+（DNA聚合酶的激活剂）。18、很多载体都携带(xidi)一段细菌的lacZ基因，它编码一半乳糖苷酶N一端(ydun)的146个氨基酸，称为一肽，载体(zit)转化的宿主细胞为lacZ15基因型，它表达一半乳糖苷酶的C一端肽链。当载体与宿主细胞同时表达两个片段时，宿主细胞才有一半乳糖苷酶活性，使特异的底物X一gal变为蓝色化合物，这就是所谓的一互补，而重组子由于基因插入使一肽基因失活，不能形成一互补，在含X一gal的

34、平板上，含阳性重组子的细菌为无色菌落或噬菌斑。19、限制性酶切片段长度多态。20、原理：基因芯片的工作原理与经典的核酸分子杂交方法一致，都是应用已知核酸序列作为靶基因与互补的探针核苷酸序列杂交，通过随后的信号检测进行定性与定量分析。具体讲即是将许多特定的寡核苷酸片段或cDNA基因片段作为靶基因，有规律地排列固定于支持物上；样品DNA/RNA通过PCR扩增、体外转录等技术掺入荧光标记分子或放射性同位素作为探针；然后按碱基配对原理将两者进行杂交；再通过荧光或同位素检测系统对芯片进行扫描，由计算机系统对每一探针上的信号做出比较和检测，从而得出所需要的信息。 生物学研究的意义： （1）用于绘制基因缺失

35、图谱和进行基因表达分析； （2）用于基因突变研究； （3）用于病毒病原体的检测和基因分型；（4）用于细菌检测；（5）用于同细胞周期发育阶段的cDNA作探针系统性地研究细胞中任意时期特异表达的基因；（6）能了解某些基因对特定生长发育阶段的重要性；（7）基因芯片还可用于进行基因诊断，可建立正常人特定组织、器官的基因芯片，给出标准杂交信号图；（8）用病人的可疑cDNA做探针与之杂交，检查哪些基因的表达受抑制或激活。21、管家基因是指所有类型组织细胞在任何时候都需要表达的基因。由于管家基因是生命活动必需的基因，表达相对稳定，差异小，所以在基因芯片技术中根据各芯片的管家基因可以得出标准化系数进行标准化校

36、正；管家基因在所有的细胞中都有表达，因此有关管家基因的概念有助于分析差异表达基因的表达情况，进而进行差异表达基因的克隆。通过管家基因，能比较不同样本中某种mRNA的水平。在进行基因分离时，可通过不同组织间基因的比较，扣除相同部分（管家基因）后得到差异表达基因，从而得到不同组织间基因表达。22、（1）用于鉴定启动子； （2）可以用以了解细胞中基因的表达情况，便于分析基因的调节； （3）在转基因研究领域用于检测转基因是否(sh fu)成功23、基本(jbn)步骤：组织与细胞的固定组织(zzh)和细胞杂交前的预处理探针的选择及标记杂交杂交结果的检测。24、（1）RFLP标记 DNA某一位点上的变异有

37、可能引起该位点特异性的限制性内切酶识别位点的改变，包括原有位点的消失或出现新的酶切位点，致使酶切片段长度随之发生变化。这种变化引起的多态现象即为限制性片段长度多态性（RFLP）。对RFLP的检测主要是用southern杂交的方法进行，即利用限制酶酶解及凝胶电泳分离不同生物体的DNA分子，然后用经标记的特异DNA探针与之杂交，通过发射自影或非同位素显色技术来揭示DNA的多态性。 （2）RAPD标记 随机扩增多态性DNA，用随机短引物（人工合成的六核苷酸）进行DNA的PCR扩增。所扩增的DNA区段是事先未知的，具有随机性和任意性，因此随机引物PCR标记技术可用于对任何未知基因研究。 （3）ISSR

38、标记 简单序列重复区间扩增多态性。利用基因组中常出现的SSR本身设计引物，无需预先克隆和测序。 （4）SSR标记 简单重复序列多态性，又称微卫星DNA多态性，即由二核苷酸，三核苷酸或四核苷酸串联重复的拷贝数目不等而出现的多态现象。 （5）STS标记 序列标定位置。染色体上位置已定的、核苷酸序列已知的、且在基因组中只有一份拷贝的DNA短片断，一般长200500bp。STS标记是根据单拷贝的DNA片断两端的序列，设计一对特异引物，经PCR扩增基因组DNA而产生的一段长度为几百bP的特异序列。（6）AFLP标记扩增片段长度多态性。通过对基因组DNA酶切片段的选择性扩增来检测DNA酶切片段长度的多态性

39、。AFLP揭示的DNA多态性是酶切位点和其后的选择性碱基的变异。（7）CAPS标记 是特异引物PCR与限制性酶切相结合而产生的一种DNA标记，当SCAR或STS的特异扩增产物的电泳谱带不表现多态性时，一种补救办法就是用限制性内切酶对扩增产物进行酶切，然后再通过琼脂糖或聚丙烯胺凝胶电泳检测其多态性，这种多态性称为CAPS标记。它揭示的是特异PCR产物DNA序列内限制性酶切位点变异的信息，也表现为限制性片段长度的多态性。（8）SNP标记(bioj) 单核苷酸多态性。不同个体基因组DNA序列同一位置上的单个核苷酸的差别(chbi)。其比较的不是DNA的片段长度，而是相同序列长度里的单个碱基的差别。2

40、5、重组的类型(lixng)主要有以下几种： （1）同源重组：重组对之间需要有同源性。调节这一过程的蛋白（如大肠杆菌中的RecA）不是序列专一性的，而是同源依赖的，经常涉及长的同源区域。Holliday模型可以用来解释同源重组的分子机制。 （2）位点特异性重组：在能识别特定的核苷酸序列的重组酶作用下，DNA分子间的重组。噬菌体DNA的整合和切离是典型的位点特异性重组。调节这一过程的蛋白（位点特异性重组酶）在供体和受体分子中识别短的，特异DNA序列，这些蛋白之间的相互作用帮助重组。 （3）转座重组：由于在转座酶的作用下转座因子插入染色体或切离染色体而产生的遗传重组，重组对之间不需要同源性。如玉米

41、中的Ac一Ds双因子系统，果蝇中的P因子等。 （4）异常重组：发生在彼此同源性很小或没有同源性的DNA序列之间。按其机制主要分为两类：末端连接是指断裂的DNA末端彼此相连；链滑动是指DNA复制时，由一个模板跳跃到另一个模板所引起的重组。 （5）不正常重组：重组对之间不需要同源性或少量同源性，是异常细胞作用的结果。包括复制中不正常的（但在错误的地方发生）同源重组。 （6）人工重组：体外用纯化的酶和底物进行的DNA连接引起的重组。26、PCR是一种模拟天然DNA复制过程,在有DNA模板、DNA聚合酶（常用TaqDNA聚合酶）、引物和4种dNTP的情况下，通过高温变性一低温退火一中温延伸这样反复循环

42、的过程，在体外扩增特异性DNA片段的分子生物学技术。 特殊的PCR方法有：锚式PCR，可以用来快速分离cDNA末端（RACE）；反向PCR，可扩增引物外侧的DNA片段，对已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增和研究；多重PCR，在同一反应中采用多对引物同时扩增几个不同的DNA片段，如果基因某一区段缺失，则相应的电泳图谱上此区段PCR扩增产物长度减少或消失，从而发现基因异常；反转录PCR，先将mRNA反转录成cDNA，然后再以cDNA为模板，用PCR方法加以扩增。其他还有PCR，荧光PCR等。27、根据核酸(h sun)分子探针的来源及其性质，探针的种类可分为四类： （1）基因组DNA探针(tn

43、zhn) 克隆化的各种基因片段是最常用的核酸(h sun)探针，因真核基因组存在高度重复序列，探针应尽可能选用基因的编码序列（外显子），避免使用内含子及其他非编码序列，否则探针可能因高度重复序列的存在引起非特异性杂交而导致假阳性结果。 （2）cDNA探针 与mRNA互补的DNA链称cDNA，cDNA中不存在内含子及其他高度重复序列，故特异性高，是一种较理想的核酸探针。 （3）RNA探针 RNA探针有以下优点： RNA：RNA、RNA：DNA杂交体较DNA：DNA杂交体的稳定性高；RNA单链不存在双链DNA探针的互补双链的复性，杂交效率高；RNA无高度重复序列，非特异杂交少；杂交后可以用RNas

44、e消化未杂交的RNA探针，可降低杂交本底。（4）寡核苷酸探针 人工合成的寡核苷酸片段作探针的优点：可以根据需要合成相应的序列，避免基因组DNA探针中高度重复序列所带来的影响；多数长为1530bp即使有一个碱基不配对也会影响杂交链的Tm值，严格控制反应条件，可检测出基因点突变；探针复杂性降低，杂交反应时间较短。28、（1）非放射性标记物主要有四类： 半抗原：如生物素、地高辛，可利用这些半抗原的抗体进行检测。配体：生物素是抗生物素蛋白卵白素和链霉菌类抗生物素蛋白的配体可用亲和法检测。荧光素：如罗丹明（一种荧光染料）等可被紫外线激发出荧光，用于检测。化学发光材料：有些标记物与另一类物质反应而产生化学

45、发光现象，能直接对x光片曝光。（2）优点：安全、对环境(hunjng)和人体无害、其标记物可反复使用，不存在半衰期问题，其标记的DNA探针保存在50%的甘油中，在一200C可保存(bocn)半年之久。（3）合成非放射性核酸(h sun)探针的方法主要有：异羟基毛地黄苷配基标记DNA探针（地高辛配基系统）。DNA探针的生物素标记。直接与核酸发生活性反应、连接到核酸探针上的非放射性标记物，如：光敏生物素；辣根不定期氧化物酶；碱性磷酸酶等，均可通过化学方法直接交联到核酸探针上，杂交后再用相应的方法，如抗原一抗体反应、酶促反应显色等检测。荧光素标记核酸探针：根据探针标记的性质不同，杂交体可直接用荧光显

46、微镜观察，或用酶组织化学法、免疫组织法检测。29、滤膜杂交主要有： （1）southern blotting：特指DNA印迹杂交； （2）northern blotting：特指RNA印迹杂交； （3）dot blotting（斑点印迹）/slot blotting（狭线（缝）印迹）。例如：southern blotting（印迹法）基本流程：组织或细胞基因组DNA限制性内切酶酶切琼脂糖凝胶电泳印迹转移至滤膜预杂交加入探针杂交洗膜放射自显影。30、足迹法研究RNA聚合酶与启动子的识别及结合末端标记的DNA+RNA聚合酶用用DNA酶水解电泳放射自显影，对照：DNA用DNA酶水解电泳放射自显影，结

47、果：启动子部位受RNA聚合酶保护，不被降解；启动子功能的研究一启动子突变。使启动子的碱基序列发生变化或采用修饰碱基的方法，可以改变启动子的强弱。使启动子的功能减弱或消失下降突变，使启动子的功能增强上升突变。31、真核生物mRNA的3/端有一段poly（A）结构，根据碱基互补配对原则，A与T能形成碱基互补。32、在极端非标准条件下，限制酶能识别与切割序列相似的序列，这个改变的特殊性称星星活性。引起星星活性的因素：高浓度甘油（5%）；酶过量（100U/g）；低离子强度（25mM）；高Ph(8.0)；有机溶剂（二甲基亚砜（PMSD）、乙醇、乙二醇、二甲基乙酰胺、 二甲基甲酰胺）；用其它二价阳离子代替

48、Mg2+ （Mn2+ 、Cu2+、Co2+、 Zn2+）。33、Ipp：大肠杆菌强启动子（脂蛋白基因）lac：乳糖操纵元的启动子及操纵子 S：大肠杆菌分泌蛋白基因序列 MCS：多克隆位点 Ipp：大肠杆菌(d chn n jn)强终止(zhngzh)子 lacI：乳糖(r tn)操纵元的调控基因 ori：质粒的复制起点 ampr：抗氨苄青霉素(AmpR)的基因此载体的用途：作为大肠杆菌中的一个可调控的表达载体，可大量表达克隆的外源基因，并将蛋白分泌到细胞外。工作原理：将外源基因正确插入到克隆载体后，转化进入大肠杆菌，通过加入IPTG诱导外源基因的表达。34、pBR322 ori：来源于pBR3

49、22载体的质粒复制起点，此载体在宿主菌中能自主复制。 lacIq：来自于乳糖操纵元的调控突变基因，可产生大量调控蛋白。 Plac：来自于乳糖操纵元的启动子 lacO：来自于乳糖操纵元的操纵子g10 RBS：来自于g10基因的核糖体结合位点序列。6His：6个组氨酸的短肽序列，这些带有组氨酸标签的蛋白质能够紧紧地同A蛋白柱结合，但很容易被EDTA溶液洗脱。从而可以一步完成大量蛋白质的纯化。MCS：多克隆位点，可以插入外源基因。rrnB：来自5SrRNA基因的终止子序列。此载体的用途：作为大肠杆菌中的一个可调控的表达载体，可大量表达克隆的外源基因，此蛋白带有6个组氨酸的短肽序列，这些带有组氨酸标签

50、的蛋白质能够紧紧地同A蛋白柱结合，但很容易被EDTA溶液洗脱。从而可以一步完成大量蛋白质的纯化。工作原理：将外源基因正确插入到克隆载体后，转化进入大肠杆菌，通过加入IPTG诱导外源基因的表达。35、（1）根据已知氨基酸序列和密码子使用频率及简并性，分别对氨基酸N端、C端和中间都取一定长度的序列推出其mRNA。（2）再根据mRNA合成cDNA，并加上放射性标记作为探针(猜测体探针)。（3）提取该物种的总DNA，用适合的酶切消化，选择一种合适的载体与酶切消化DNA的片段连接，转化宿主，筛选，构建该物种的基因组文库。（4）用3种探针分别与文库进行原位杂交，筛选阳性克隆，再用3种探针分别与不同探针从文

51、库中筛选的阳性克隆杂交，阳性克隆可能为该基因克隆。（5）将此阳性克隆作序列分析对比，直到克隆到基因为止。七、分析题：参考答案：1、（1）PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：必要时重新(chngxn)设计引物。减低酶量或调换另一来源的酶。降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。适当提高退火温度或采用二温度点法(93变性，65左右退火与延伸