第21章基因诊断与基因治疗ppt课件

1、第 二 十 一 章基因诊断与基因治疗Genetic Diagnosis and Gene Therapy.基因(gene) 基因是为生物活性产物编码的DNA功能片断，这些产物主要是蛋白质或各种RNA。.基因变异致病类型内源基因的变异基因构造突变基因表达异常外源基因的入侵.第 一 节基因诊断Gene Diagnosis. 二、分类 DNA诊断以DNA为检测对象的诊断方法。 RNA诊断以mRNA为检测对象的诊断方法。一、基因诊断的概念和特点 一、定义利用现代分子生物学和分子遗传学的技术和方法，直接检测基因构造及其表达程度能否正常，从而对疾病作出诊断的方法。.三、特点针对性强 特异性高灵敏度高 适用

2、性强，诊断范围广.二、 基因诊断常用技术方法 一、核酸分子杂交技术二、聚合酶链反响三、基因测序四、基因芯片五、DNA指纹.一、核酸分子杂交(molecular hybridization)技术 核酸分子杂交可用以检测样本中能否存在与探针序列互补的同源核酸序列。 核酸探针 是一类具有放射性标志或化学标志的并与目的目的DNA或RNA分子序列互补的寡核苷酸片段。 . 探针是可以同某种待研讨的核酸序列或蛋白多肽链特异结合的任何分子，经标志之后可用来检测目的DNA/RNA 或蛋白质分子。 实验流程：提取DNA(限制酶切)凝胶电泳膜转移杂交放射自显影分析.建立在核酸杂交技术根底上的常用基因诊断方法1、限制

3、性内切酶(restriction endonuclease)酶谱分析法2、DNA限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism, RFLP)分析法 3、等位基因特异寡核苷酸 (allele specific oligonucleotide, ASO)探针杂交法.1、限制性内切酶酶谱分析法 是利用限制性内切酶和特异性DNA探针来检测能否存在基因变异的一种方法。.Mst酶切位点(CCTNAGG)53正常基因53突变基因1.15kb1.35kb镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析AT .+0.2kb1.15kb1.35kb正常人突变携带着患

4、者镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析.2、DNA-RFLP分析法 中性突变是指在人基因组中，平均每200对碱基可发生一对变异的景象。 DNA多态性是指中性突变导致个体间核苷酸序列的差别。 限制性片段长度多态性是指DNA多态性假设发生在限制性内切酶识别位点上，酶切水解该DNA片段就会产生长度不同的片段。.RFLP分析法.3、ASO杂交法 根据知基因突变位点的核苷酸序列，人工合成相应于正常和突变基因碱基序列的两种寡核苷酸探针，用它们分别与受检者DNA进展分子杂交来检测能否存在等位基因突变。 .ASO杂交法探针：M N M N M N M N 正常基因 纯合突变 杂合突变 基因缺陷 新的突变类

5、型？ +.二、聚合酶链反响 (polymerase chain reaction, PCR) 是利用特异的引物，特异地扩增目的DNA的方法。 实验流程：提取DNAPCR凝胶电泳显色分析.5Primer 15Primer 2Cycle 2Cycle 155 55 5 5Template DNA55 555 5 551、根本任务原理.Cycle 355 555 5 555 5 55 555 52530 次循环后，模板DNA的含量可以扩展100万倍以上。.2、常用的PCR方法： 常规PCR、巢式PCR、多重PCR、多种PCR、不对称PCR、反转录PCR、定量反转录PCR、mRNA差别显示PCR、原位

6、PCR、实时PCR等等。.3、在PCR技术根底上的常用基因诊断方法PCR-SSCP法*PCR-ASO法PCR-RFLP法PCR-限制酶谱法PCR-STR短串联反复序列，short tandem repeat. SSCP是指一样长度的单链DNA因其碱基序列不同，甚至单个碱基不同，都能够构成不同的空间构象，从而在中性聚丙烯酰胺凝胶电泳时泳动速率不同的景象。 单链构象多态性 (single strand conformation polymorphism, SSCP).PCR-SSCP分析 是指PCR产物变性后，经聚丙烯酰胺凝胶电泳，正常基因和变异基因的迁移位置不同，借此可分析确定致病基因的存在。.

7、正常人纯合突变杂合突变Leber 遗传性神经病患者 PCR/SSCP分析 线粒体DNA第11778位GA所致+.三、基因测序(gene sequencing) 即测定某一基因的碱基序列。 实验流程：提取DNA分别出有关基因测序分析诊断 基因测序的方法：化学裂解法DNA链末端合成终止法DNA自动测序.四、基因芯片gene chip) 基因芯片，又称DNA芯片、DNA阵列、寡核苷酸微芯片DNA chip、DNA arrays、oligonucleotide micro-chip是指将许多特定的寡核苷酸片段或基因片段作为探针，有规律地陈列固定于支持物上，然后与待测的标志样品的基因按碱基配对原理进展杂

8、交，再经过激光聚焦荧光检测系统等对芯片进展扫描，并配以计算机系统对每一探针上的荧光信号作出比较和检测，从而迅速得出定性和定量的结果。.基因芯片的运用1、在诊断中的运用 核酸序列分析、基因表达分析、寻觅新基因、突变基因和基因多态性检测等2、在药学研讨中的运用 药物挑选、药物作用机制研讨、耐药菌株、药敏检测、毒理学研讨、环境化学毒物的挑选、基因扫描等.五、DNA指纹(DNA fingerprint) 在人基因组DNA中有高度可变的“小卫星区域，采用“小卫星基因探针，在同一限制酶切产物的DNA杂交图谱上，同一个体不同组织来源的DNA的谱带完全一致，而不同个体之间同卵双生除外谱带都不一样，好像人的指纹

9、具有高度个体特异性一样，因此这种杂交图谱被称为DNA指纹或遗传指纹genetic fingerprint。. 简言之：DNA指纹或遗传指纹是指采用“小卫星基因探针进展DNA分子杂交 Southern 印迹，Southern blotting所得的图谱。 实验流程：提取DNA限制酶切凝胶电泳膜转移杂交放射自显影分析.三、基因诊断的运用遗传疾病肿瘤感染性疾病传染性流行病判别个体疾病易感性器官移植组织配型法医学中个体识别、亲子鉴定.总结 基因诊断的概念、特点、常用的技术方法及运用。.复习题1、名词解释： 基因诊断、DNA诊断、RNA诊断、RFLP分析、SSCP、基因芯片、DNA指纹2、简述基因诊断的

10、特点、常用技术方法及可用于诊断的疾病。简述基因变异致病的类型及内源性基因变异的类型。简述限制性内切酶谱分析法、ASO探针杂交法、PCR-SSCP分析、基因芯片、DNA指纹等的实验流程。.第 二 节基因治疗Gene Therapy.一、基因治疗的概念早期是指用正常的基因整合入细胞基因组，以校正和置换致病基因的一种治疗方法。 目前广义上来讲是指将某种遗传物质转移到患者细胞内，使其在体内发扬作用，以到达治疗疾病目的的方法。一、基因治疗的概念.二、基因治疗的根本方法1、基因矫正 (gene correction)2、基因置换 (gene replacement)3、基因增补 (gene augment

11、ation)4、基因失活 (gene inactivation) . 1、基因矫正 (gene correction) 指将致病基因的异常碱基进展纠正，而正常部分予以保管。 纳米钳.A G C T G T G A A G T C G T GT C G A C A C T T C A G C A CabnormalgeneGene correctionnormalgeneTACG.2、基因置换 (gene replacement) 指用正常的基因经过体内基因同源重组，原位交换致病基因，使细胞内的DNA完全恢复正常形状。.A G C T G T G C A A G T C G T GT C G A

12、 C A C G T T C A G C A CnormalgeneA G C T G T G C A A G T C G T GT C G A C A C G T T C A G C A CnormalgeneA G C T G T G T A A G T C G T GT C G A C A C A T T C A G C A CabnormalgeneGene replacement.3、基因增补 (gene augmentation) 将目的基因导入病变细胞或其他细胞，不去除异常基因，而是经过目的基因的非定点整合，使其表达产物弥补缺陷基因的功能或使原有基因表达加强。.A G C T G

13、 T G C A A G T C G T GT C G A C A C G T T C A G C A CnormalgeneA G C T G T G T A A G T C G T GT C G A C A C A T T C A G C A CabnormalgeneGene augmentation.4、基因失活 (gene inactivation) 指将特定的序列导入细胞后，在转录或翻译程度阻断某些基因的异常表达，已到达治疗疾病的目的。.几种常见的基因失活技术反义核酸技术核酶技术三链技术干扰RNA技术肽核酸基因敲除.反义(antisence)核酸技术 是指用人工合成的RNA或DNA

14、来阻断基因的转录或复制，使编码基因不能转录为mRNA，因此不能翻译成相应的蛋白质。.反义RNA技术 反义RNA是指与mRNA互补，且能抑制与疾病发生直接相关基因表达的RNA。 反义RNA技术是指利用反义RNA在mRNA程度上封锁基因表达，最终可经过调理剂量，来治疗由基因突变或过度表达所致的疾病或严重感染性疾病。 .T C G A C A C A T T C A G C A CA G C T G T G T A A G T C G T GabnormalgeneGene inactivationabnormalmRNA U C G A C A C A U U C A G C A C反义RNA A

15、 G C U G U G U A A G U C G U GAbnormal proteinAbnormal protein.核酶(ribozyme)技术 经过核酶分子结合到靶RNA分子中适当的部位，构成锤头核酶构造，催化对靶RNA分子的剪切，从而破坏靶RNA分子到达治疗疾病的目的。.5353靶RNA核酶分子核酶技术.三链技术(triplex approach) 又称为反基因战略(antigene stragegy)，是利用脱氧寡核苷酸能与双螺旋双链DNA专注性序列结合，构成三链DNA，从而在转录程度或复制程度阻止基因转录或复制的技术。 能构成三链DNA的脱氧寡核苷酸称为三链DNA构成脱氧寡核

16、苷酸triplex-forming oligonucleotide,TFO)。.复制、转录三链DNA技术.干扰RNA(interference RNA,RNAi)技术 RNAi是指在特定因子作用下，有导入胞内的双链RNA降解生成的约22nt左右的SiRNAs(single strand RNAi)。 RNAi技术是指利用碱基互补配对原那么，使RNAi和靶DNA结合，同时诱导激活体内的基因沉默因子，从而使靶DNA降解。.dsRNARNAi-DNARNA、DNA降解干扰RNA技术RNAi.RNAi技术的特点特异性强效率性高作用时间长可经过细胞屏障而发扬作用.肽核酸(peptide nucleic

17、acid,PNA)技术 PNA是指DNA-肽复合物。 PNA技术是利用多肽与DNA的特异性结合，专注地抑制某一基因的表达。.肽肽核酸技术.基因敲除(gene knock-out)技术 指有目的的去除动物体内某种基因的技术。.三、基因治疗的其他方法1、“自杀基因的运用 某些病毒或细菌的基因所表达的酶能将对人体无毒或低毒的药物前体在人体细胞内转变为细胞毒性产物，从而导致携带该基因的受体细胞也被杀死，故称这类基由于自杀基因。 自杀基因 无毒、低毒的药物前体 细胞毒性产物细胞死亡.2、基因疫苗的运用 将编码外源性抗原的基因插入到含真核表达系统的质粒上，然后将质粒直接导入人或动物体内，让其在宿主细胞内表

18、达抗原蛋白，诱导机体产生免疫应对。.重组表达质粒外源性抗原基因基因疫苗.二、基因治疗的根本程序一、治疗性基因的选择 目的基因的选择二、基因载体的选择三、靶细胞的选择四、基因转移五、外源基因表达的挑选 利用载体中的标志基因 有neor标志基因时，用 418进展挑选六、回输体内 静脉回输 自体骨髓移植 埋入皮下组织病毒载体*非病毒载体体细胞生殖细胞间接体内疗法(ex vivo)直接体内疗法(in vivo). 常见基因载体的优缺陷载体 优点 缺陷逆转录病毒 基因组小并且简单 仅感染分裂细胞 稳定整合于宿主基因组 随机整合能够导致突变 生物学特性清楚 经常只需短暂表达 可高效转入复制中的细胞 病毒滴度低107pfu/ml 对宿主无害 能够会于有复制才干的病毒重组腺病毒相关病毒 基因组小 未知 可特异整合于人染色体19q 需腺病毒辅助复制 以人细胞作为宿主 携带外源基因才干有限 无毒，无致病性 难