诊断和治疗的意义ppt课件

1、JAK2基因突变对于骨髓增殖性肿瘤的分类、诊断和治疗的意义中山大学附属第三医院血液科徐妍 硕士研讨生 1、MPD：是一系或多系分化相对成熟的骨髓细胞不断的克隆性增殖所致的一组肿瘤性疾病的统称。 2、MPD包含慢性粒细胞白血病CML，真性红细胞增多症PV，原发性血小板增多症ET，和原发性骨髓纤维化PMF,慢性中性粒细胞白血病CNL，慢性嗜酸细胞白血病/高嗜酸细胞综合症CEL/HES等多种疾病。 一、骨髓增殖性疾病MPD MPD的病因和发病机制尚未完全明确。2005年发表在Nature上的一篇文章初次报道了JAK2突变发生于多种MPD，在他们的研讨中，约80的PV患者存在JAK2基因突变，导致基因

2、编码产物第617位氨基酸由缬氨酸突变为苯丙氨酸。二、MPD发病机制 这一变化导致JAK激酶相关的特异性的受体酪氨酸磷酸化活性继续加强，使红细胞对细胞因子如EPO的反响加强，继续激活JAK-STAT信号途径，从而发生PV，这一机制在小鼠模型中得到证明。 同样地，JAK2 V617F也存在于其他MPD中1 。 这个基因突变的发现无疑对MPD的分类、诊断和治疗产生了深远的影响。1 James C, Ugo V, Le Coudic JP, et al. A unique clonal JAK2 mutation leading to constitutive signalling causes po

3、lycythaemia vera. Nature, 2005,434:1144-1148. 三、JAK-STAT信号途径细胞因子与其相应受体结合后，引起细胞质受体构象的改动，进而激活与受体相关联的JAK激酶，JAK激酶可以使特异性受体的酪氨酸残基磷酸化，进而促使相应的STAT因子磷酸化，从而激活STAT因子。最后，激活的STAT蛋白从受体上游离构成二聚体，进入细胞核内与GASgamma activated site加强子家族成员相结合，诱导靶基因表达。JAKJAKStatStatStatStatStatStat胞浆胞核胞浆表示图：JAK-STAT信号途径可以激活JAK2激酶的受体包括：EPO-

4、R,TPO-R,GM-CSF-R,IL-3R,gp130受体家族等。研究组 PVET骨纤其他对照组Jones AV 2 58 /72 (81%) 24 /59 (41%) 15 /35 (43%) 30/ 152(20%) 0/160（0）Vainchenker W 3 80% 3025-750%Nelson ME 4 74% (n = 506) 36% (n = 339) 7% (n = 556) Fei HR 5 42 / 57(73.7%) 40/ 68 (58.8%)8/12(66.7%) Lucia E 6 90.2% 72.1 %63.2 %50%_2 Jones AV, Krei

5、l S, Zoi K, et al.Widespread occurrence of the JAK2 V617F mutation in chronic myeloproliferative disorders Blood. 2005;106(6):2162-8. 3 Vainchenker W, Constantinescu SN.A Unique Activating Mutation in JAK2 (V617F) Is at the Origin of Polycythemia Vera and Allows a New Classification of Myeloprolifer

6、ative Diseases.Hematology. 2005:195-200. 4 Nelson ME, Steensma DP. JAK2 V617F in myeloid disorders: what do we know now, and where are we headed? Leuk Lymphoma. 2006 Feb;47(2):177-94. 5 Fei HR, Zhang R, Chen SN, et al.The clinical implication of JAK2 mutation expression in patients with myeloprolife

7、rative disorders. Zhonghua Nei Ke Za Zhi. 2007 Apr;46(4):271-3. 6 Lucia E, Martino B, Mammi C, et al.The incidence of JAK2 V617F mutation in bcr/abl-negative chronic myeloproliferative disorders: assessment by two different detection methods. Leuk Lymphoma. 2021 Oct;49(10):1907-15. 参考文献： 在修订的2021 WH

8、O分类系统中，有无JAK2突变成为MPD主要的诊断目的7 。1假设JAK2突变阳性，血红蛋白添加，骨髓红系细胞明显增生可以诊断PV，即使血红蛋白低于以往WHO规定的目的值，但却继续超越正常值 20g/L的PV也可以确诊。2假设JAK2突变阳性，血小板仅仅继续大于450X109/L,骨髓巨核细胞增生，可以诊断ET。 四、 2021 WHO分类系统7 Tefferi A and Vardiman JW.Classification and diagnosis of myeloproliferative neoplasms: The 2021 World Health Organization cr

9、iteria and point-of-care diagnostic algorithms. Leukemia 2021, 22, 1422 原WHO关于PV诊断规范如下：A1：红细胞比积增高比正常平均值25或血红蛋白男性185g/L、女性165g/L；A2：无引起继发性红细胞增多缘由如无家庭性红细胞增多症，无低氧血症动脉P0292、无高氧亲和力血红蛋白，无截短的促红素Epo受体和无肿瘤分泌EPO所致EPO升高；A3：脾大；A4：骨髓细胞无Phbcrabl，但可有其他克隆性遗传学异常；A5：体外培育有内源性红系集落构成； B1：血小板增多40010g/L；B2：白细胞1210g/L；B3：骨

10、髓活检示全髓系增生以红系和巨核系增生明显；B4：血清EPO减低；具有A1+A2+任何A项或Al+A2+B项中任何2项均可诊为PV.(3)不仅MPD的诊断发生革命性进展，连称号都改动了。MPD改称为骨髓增殖性肿瘤(myelo- proliferative neoplasm，MPN)，MDS/MPD(myelodysplastic /myeloproliferative disorder)称为MDS/MPN。新分类的MPN 中还包含了肥大细胞病MCD。(4)以前的慢性嗜酸细胞白血病/高嗜酸细胞综合症CEL/HES分别重新划分为CEL，HES和有PDGFRA, PDGFRB或者FGFR1基因异常的嗜

11、酸细胞增高症3种MPN，并强调这类疾病的本质是肿瘤. 现已明确，MPN具有共同的干细胞来源的克隆型遗传特征，临床出现不同表型是突变影响的蛋白、酪氨酸激酶及相关分子的不同构型和异常的信号转导所呵斥的。 1、MPN诊断规范的根据:多数患者都具有JAK2突变，主要是JAK2 V617F, 还有JAK2外显子12突变。由于JAK2 V617F是髓系细胞特异性的，在PV以外其他缘由呵斥的红细胞增多症并不出现，因此是PV的一个敏感的诊断标志。 五、JAK2突变对于MPN的诊断意义2、但是，髓系肿瘤中JAK2 V617F并非PV独有， 还可见于50%的ET或PMF。但其他髓系肿瘤JAK2 V617F发生频率

12、很低，淋巴系肿瘤不出现。仅检测JAK2 V617F 突变虽然不能单独用来区分不同类别的MPN，但是结合骨髓活检的组织学根据，可以诊断ET和PMF，排除反响性的血小板增多和骨髓纤维化。 3、JAK2 突变在PV诊断中意义最大，而诊断ET或PMF时那么能够未发现JAK2 V617F，缘由除了大约一半患者确实无突变外，还由于目前的检测方法并没有规范化。4、运用直接测序、位点特异性PCR和荧光定量PCR检测JAK17F基因突变的方法会出现一些差别。不同方法的检测灵敏度不同，突变检出率能够不同。通常直接测序检测的灵敏度约20-25%，位点特异性PCR方法约1-3%，荧光定量PCR方法约0.5-5% 79

13、 。 参考文献：7 Murugesan G, Aboudola S, Szpurka H, et al. Identification of the JAK2 V617F mutation in chronic myeloproliferative disorders using FRET probes and melting curve analysis. Am J Clin Pathol, 2006, 125:625-633.8 Vannucchi AM, Pancrazzi A, Bogani C, et al. A quantitative assay for JAK2(V617F)

14、mutation in myeloproliferative disorders by ARMS-PCR and capillary electrophoresis. Leukemia, 2006, 20:1055-1060.9 McClure R, Mai M, Lasho T. Validation of two clinically useful assays for evaluation of JAK2 V617F mutation in chronic myeloproliferative disorders. Leukemia, 2006,20:168-171. 5、突变类型：携带

15、纯合型还是杂合型等位基因以及突变细胞的比例都与临床病症有关，对MPD并发症的发生率及预后都有重要意义； PV患者较ET或IMF患者更多携带纯合型突变细胞10、11 。10 Ross L. Levine, Claude Belisle, et al. X-inactivationbased clonality analysis and quantitative JAK2V617F assessment reveal a strong association between clonality and JAK2V617F in PV but not ET/MMM, and identifies a

16、 subset of JAK2V617F-negative ET and MMM patients with clonal hematopoiesis. Blood, 2006,107:4-4141.11 Linda M. Scott, Mike A. Scott,et al. Progenitors homozygous for the V617F mutation occur in most patients with polycythemia vera, but not essential thrombocythemia. Blood, 2006, 108:2435-2437. 6、突变

17、量：临床任务对患者杂合型/纯合型突变克隆的携带情况，突变比例的定量检测也越来越注重。转染JAK2 V617F突变基因的小鼠模型可出现类似PV的表型，突变基因表达量进一步增高时可以进展为骨髓纤维化，而在突变基因低表达的小鼠模型中可以察看到一过性的血小板增多12 。 MPD疾病过程中临床病症和JAK2 V617F突变携带比例的变化很能够与杂合型突变向纯合型突变的基因转变有关13 。12 Lacout C, Pisani DF, Tulliez M,et al. JAK2V617F expression in murine hematopoietic cells leads to MPD mimic

18、king human PV with secondary myelofibrosis. Blood, 2006, 108:1652-1660.13 Campbell PJ, Scott LM, Buck G, et al. Definition of subtypes of essential thrombocythaemia and relation to polycythaemia vera based on JAK2 V617F mutation status: a prospective study. Lancet, 2005, 366:1945-1953.7、JAK2基因突变的发现也

19、导致其他临床诊断目的的变化。PV患者血红蛋白添加或者血细胞容积添加是诊断重要的目的，但并非总是和体内红细胞总量真正添加红细胞增多症相一致。PV有时候可以表现为红细胞压积正常，是由于血浆也相应添加了。 既然如此，那么在经典MPN(PV, ET 和PMF)血红蛋白和血细胞容积也不一定有明显区别。过去PV专业协作组PVSG建议在诊断PV时运用红细胞总量 (RCM) 来抑制上述缺陷，2001年的WHO规范开场强调要做骨髓活检来协助诊断。 1PV：既然几乎一切PV患者有JAK2突变，外周血JAK2V617F检测是当前PV患者首选的检查。与此同时，该当检测血清Epo程度，真正的PV同时出现JAK2 V61

20、7F阴性和Epo程度正常或添加的能够性非常小，血清Epo程度减低检测可以发现极少见的JAK2 V617F阴性的PV。 另一方面，也应该思索检测JAK2 V617F阴性，血清EPO程度正常或者低下患者的JAK2外显子12突变和骨髓活检。骨髓细胞学变化也是ET，PMF和JAK2突变阴性的PV必需的诊断规范之一。2 ET、PMF：由于JAK2 V617F见于50% 的ET或PMF，诊断血小板增多和骨髓纤维化患者时应思索JAK2突变。突变出现可以排除反响性骨髓增殖，然而没有检出突变并不能排除MPN的能够性。诊断ET和PMF时通常也需求骨髓检查。 同样，ET或PMF类似CML时，尤其是在未发现JAK2

21、V617F时，在骨髓检查之初就要思索细胞遗传学检查。假设没有发现Ph染色体，但是骨髓有小巨核细胞时，应思索做FISH检测BCR-ABL基因。 WHO诊断规范(见下页)阳性目的 1.继续性BPC600109L 2.骨髓活检以巨核细胞系增多为特征，巨核细胞体积较大，多为成熟型阴性目的 1.无PV证据：骨髓铁染色正常，红细胞数正常或Hb185 g/L(男)或165 g/L(女)2.无CML证据：无Ph染色体，无bcr-abl交融基因 3.无慢性IMF证据：无胶原纤维，无或极少网状纤维 4.无MDS证据：无del(5q)，t(3；3)(q21；q26)或inv(3)(q21q26)等染色体异常，无明显

22、的粒细胞增生异常，无或极少有小巨核细胞 5.无以下缘由引起的反响性血小板增多：炎症、免疫、肿瘤或先前已切脾3ET的治疗3不典型MPN：诊断不典型MPN (CNL, HES, CEL-NOC,MCD 和不能分类的MPN)时，通常要求BCR-ABL阴性, 有红系造血异常，粒细胞发育异常，或者单核细胞发育异常1x109/L。 4 CNL：假设外周血白细胞25x109/L 伴随80%分叶核中性粒细胞或带状中性粒细胞，不成熟粒细胞10%和原始粒细胞1%骨髓中5%原始细胞时，思索CNL。 5不能分类的MPN：假设发现骨髓形状学异常的肥大细胞聚集，疑心MCD的时候，该当思索类胰蛋白酶染色检查骨髓，做流式细胞

23、仪分析寻觅形状异常的肥大细胞 (CD25阳性), 假设有能够最好进展KIT D816V突变检测。当临床表型和经典的或者其他非经典的MPN的诊断规范不符时候，可思索不能分类的MPN。 6CEL-NOC、HES：CEL-NOC包含伴有嗜酸细胞增多的PDGFRA,PDGFRB 和FGFR1重排的髓系肿瘤。诊断两者都需求外周血嗜酸细胞计数1.5x109/L，排除继发性嗜酸细胞增多，排除其他急慢性髓系肿瘤，并且没有表型异常和/或克隆性T淋巴细胞。诊断HES需求没有细胞遗传学异常，外周血原始细胞2%或骨髓原始细胞5%两个条件。 基因检测在疾病诊断中愈来愈重要，从1960年在CML中发现了Ph染色体时开场，

24、 除Ph染色体的特征性BCR-ABL基因，陆续在PV, ET和PMF中发现JAK2 V617F，PV中JAK2外显子12突变；在ET或PMF中发现的PLW515L/K，在伴有嗜酸细胞增多症的髓系恶性肿瘤中发现的PDGFRA, PDGFRB 或 FGFR1基因重排，在MCD中发现的KITD816V和其他KIT突变，在幼年型粒单细胞白血病JMML中的发现RAS通路突变包括 RAS, PTPN11 或者NF1。 这些与髓系恶性肿瘤发病相关的基因的发现，最终将导致一些新分类和诊断方式。例如，检测 FIP1L1- PDGFRA突变(用FISH 或者 RT-PCR)，PDGFRB-重排(用染色体核型或 F

25、ISH)，或者FGFR1易位 (用染色体核型)都是目前原发性嗜酸细胞增多症分类及选择治疗方案的必要检查。 既然JAK2突变广泛存在于MPN，那么，抑制JAK2基因来治疗MPN的药物也就具有相当的运用前景，如抑制JAK2基因表达的药物TG101209, Go6976, erlotinib都有运用于临床治疗的能够。 六、JAK2突变对于MPN的治疗意义1、TG101209 2007年Pardanani A 等人研制出一种口服的生物小分子TG101209，能抑制JAK2 激酶(IC(50)=6 nM), 而对于其他的激酶如JAK3 抑制造用较弱(IC(50)=169 nM)。它可以抑制表达JAK2V617F 突变的Ba/F3细胞小鼠原B细胞株的生长。在人类表达JAK2V617F 突变的急性髓系白血病细胞株中， TG101209可以促进细胞凋亡，抑制JAK2V617F、STAT5 和 STAT3的磷酸化。这就预示着它能够治疗MPN，且其治疗作用在裸鼠模型中得到证明。 2、Go6976 2006年Grandage VL 等人证明G6976在体外实验中能直接抑制 JAK2. G6976还能抑制表达MPN相关的JAK2 V61