一、二、三代测序技术

1、一代、二代、三代测序技术第一代测序技术-Sanger链终止法一代测序技术是20世纪70年代中期由Fred Sanger及其同事首先发明。其基 本原理是，聚丙烯酰胺凝胶电泳能够把长度只差一个核苷酸的单链DNA分子区 分开来。一代测序实验的起始材料是均一的单链DNA分子。第一步是短寡聚核 苷酸在每个分子的相同位置上退火，然后该寡聚核苷酸就充当弓物来合成与模板 互补的新的DNA链。用双脱氧核苷酸作为链终止试剂（双脱氧核苷酸在脱氧核 糖上没有聚合酶延伸链所需要的3-OH基团，所以可被用作链终止试剂）通过 聚合酶的引物延伸产生一系列大小不同的分子后再进行分离的方法。测序引物与 单链DNA模板分子结合后，

2、DNA聚合酶用dNTP延伸引物。延伸反应分四组 进行，每一组分别用四种ddNTP （双脱氧核苷酸）中的一种来进行终止，再用 PAGE分析四组样品。从得到的PAGE胶上可以读出我们需要的序列。第二代测序技术-大规模平行测序大规模平行测序平台（massively parallel DNA sequencing platform ）的出 现不仅令DNA测序费用降到了以前的百分之一，还让基因组测序这项以前专属 于大型测序中心的“特权”能够被众多研究人员分享。新一代DNA测序技术有 助于人们以更低廉的价格，更全面、更深入地分析基因组、转录组及蛋白质之间 交互作用组的各项数据。市面上出现了很多新一代测序仪

3、产品，例如美国RocheApplied Science公司的454基因组测序仪、美国Illumina公司和英国Solexa technology公司合作开发的Illumina测序仪、美国Applied Biosystems公司 的SOLiD测序仪。Illumina/Solexa Genome Analyzer测序的基本原理是边合 成边测序。在Sanger等测序方法的基础上，通过技术创新，用不同颜色的荧光 标记四种不同的dNTP，当DNA聚合酶合成互补链时，每添加一种dNTP就会 释放出不同的荧光，根据捕捉的荧光信号并经过特定的计算机软件处理，从而获 得待测DNA的序列信息。以Illumina测

4、序仪说明二代测序的一般流程，（1） 文库制备，将DNA用雾化或超声波随机片段化成几百碱基或更短的小片段。用 聚合酶和外切核酸酶把DNA片段切成平末端，紧接着磷酸化并增加一个核苷酸 黏性末端。然后将Illumina测序接头与片段连接。（2）簇的创建，将模板分子 加入芯片用于产生克隆簇和测序循环。芯片有8个纵向泳道的硅基片。每个泳道 内芯片表面有无数的被固定的单链接头。上述步骤得到的带接头的DNA片段变 性成单链后与测序通道上的接头引物结合形成桥状结构，以供后续的预扩增使用。 通过不断循环获得上百万条成簇分布的双链待测片段。（3）测序，分三步：DNA 聚合酶结合荧光可逆终止子，荧光标记簇成像，在下

5、一个循环开始前将结合的核 苷酸剪切并分解。（4）数据分析第三代测序技术-高通量、单分子测序被称为第三代的测序的He-licos单分子测序仪，PacificBioscience的SMRT技 术和Oxford Nanopore Technologies公司正在研究的纳米孔单分子测序技术正向 着高通量低成本长读取长度的方向发展。不同于第二代测序依赖于DNA模板 与固体表面相结合然后边合成边测序，第三代分子测序，不需要进行PCR扩增。(1)Helico BioScience单分子测序技术。该测序是基于边合成边测序的思想， 将待测序列随机打断成小分子片段并用末端转移酶在3末端加上poly(A)，以 及在

6、poly(A)的末端进行荧光标记和阻断，把这些小片段与带有poly(T)的平板 杂交成像来获得已经杂交模板所处的位置，建立边合成边测序的位点加入聚合 酶和被Cy3荧光标记脱氧核苷酸进行DNA合成，每次只加入一种脱氧核苷酸， 然后将未参与合成的dNTP和DNA聚合酶洗脱，直接对Cy3成像，观测模板 位点上是否有荧光信号，然后化学裂解核苷酸上的燃料并释放加入下一种脱氧 核苷酸和聚合酶的混合物，进行下一轮反应。(2)Pacific BioscienceSMRTT技 术。该测序也是基于边合成边测序的原理，这项技于使用了 Zero-ModeWaveguide(ZMW)(零级波导)。测序的过程：被荧光标记

7、磷酸集团 的核苷酸在聚合酶活性位点上与模板链结合(每种脱氧核苷酸被不用颜色的染料 标记)，被激发出荧光，在荧光脉冲结束后，被标记的磷酸集团被切割并释放，聚 合酶转移到下一个位置，下一个脱氧核苷酸连接到位点上开始释放荧光脉冲，进 行下一个循环。(3)Oxford Nanopore Technologies的纳米孔单分子测序 技术。大多数纳米孔测序技术的基本原理是当DNA分子或者它的组成碱基从一 个孔洞经过时而检测到被影响的电流或光信号。OxfordNanopore测序技术是 以a-溶血素来构建生物纳米孔，核酸外切酶依附在孔一侧的夕卜表面，一种合成 的环糊精做为传感器共价结合到纳米孔的内表面。这个系统被镶嵌在一个脂双分 子层内，为了提供既符合碱基区分检测又满足外切酶活性的物理条件，脂双分子 层两侧为不同的盐浓度在适合的电压下，核酸外切酶消化单链DNA，单个碱 基落入孔中，并与孔内的环糊精短暂的相互作用，影响了流过纳米孔原本的电流， 腺嘌呤与胸腺嘧啶的电信号大小很相近，但胸腺嘧啶在环糊精停留是时间是其他 核苷酸的2-3倍所以每个碱基都因其产生电流干扰振幅是特有的而被区分开来。总结：第一代指双脱氧末端终止法，扩增后通过毛细管电泳读取序列，每次获取数据量 少第二代为高通量测序，采用微珠或高密度芯片边合成边测序，代表有454，solexa， s