第五章酶和酶类药物

1、第五章 酶和酶类药物生物催化剂酶 蛋白质类酶核酶（具有催化作用的核酸）1926年，Summer从刀豆中分离获得了脲酶结晶，提出酶的化学本质是蛋白质.后来发现某些RNA分子也有酶活性，出现核酶 ribozyme.酶学、微生物学的基本原理与化学工程等有机结合而产生酶工程。酶工程利用酶或含酶细胞作为生物催化剂完成重要的化学反应。酶工程主要内容包括：酶的生产、分离纯化、酶的固定化、酶生物反应器、酶与固定化酶的应用等。 遵循这一过程，已经出现了一批基因工程表达的酶制剂。从早期的消化、消炎为主扩展到降压、凝血与抗凝血、抗氧化与抗肿瘤等。本章内容第一节 酶是生物催化剂第二节 酶的化学本质、结构与功能第三节

2、酶促反应动力学第四节 酶的命名、分类和活性测定第五节 固定化酶第六节 酶在医药学上的应用一、酶的生物学意义酶的定义：酶是生物体内一类具有催化活性和特定空间构象的生物大分子，包括蛋白质和核酸。第一节 酶是生物催化剂底物一般催化剂催化酶催化能量非催化产物酶不能改变反应的平衡常数酶与一般催化剂不同，有以下特点： 高度的不稳定性 高度的催化效率 高度的特异性 酶活力可调节性二、酶作用的专一性和专一性学说受酶催化的化合物称为该酶的底物(substrate)酶对底物的专一性立体化学专一性非立体化学专一性立体异构专一性（D-氨基酸 氧化酶）几何异构专一性键专一性基团专一性（磷酸酶）绝对专一性（脲酶）（一）专

3、一性类型1、立体化学专一性（1）旋光异构专一性：当底物具有旋光异构体时，酶只能作用其中一种。同样，底物没有不对称碳原子，而酶促反应含有不对称碳原子时，该底物受酶催化后往往只得到一种立体异构体。（2）几何异构专一性：当底物是含有双键的顺反异构体时，酶只能作用其中一种。2、非立体化学专一性（1）键专一性（2）基团专一性（3）绝对专一性（二）酶的专一性学说Koshland提出“诱导契合学说” 一方面认为酶与底物之间互补，另一方面认为酶本身不是固定不变的，酶分子与底物的契合是动态的契合。酶分子与底物分子接近时，酶蛋白受底物分子的诱导，其构象发生有利于同底物结合的变化，酶与底物在此基础上互补契合，进行反

4、应。Fischer曾提出“锁钥学说”诱导契合学说E + S ES E + P第一节 酶是生物催化剂第二节 酶的化学本质、结构与功能第三节 酶促反应动力学第四节 酶的命名、分类和活性测定第五节 固定化酶第六节 酶在医药学上的应用第二节 酶的化学本质、结构与功能一 、酶的化学本质及其组成1、酶的化学本质 由于大多数酶的化学本质是蛋白质，因此，酶与其他蛋白质一样，主要由氨基酸组成，具有一、二、三、四级结构。也是两性电解质，具有等电点，易变性失活，能被蛋白水解失活。但是，不是所有蛋白质都是酶，只是具有催化活性的蛋白质才是酶。酶蛋白 蛋白质部分+非蛋白质部分+辅助因子=全酶（有活性）结合酶单纯酶小分子有

5、机化合物（B族维生素）无机金属离子辅酶辅基2、酶的化学组成酶结合酶酶蛋白作用： 辅酶或辅基的作用： 起传递电子、原子和某些基团 的作用即决定反应的类型决定催化反应的专一性和高效性辅助因子金属离子作用：1.活性中心的组成成分2.连接酶与底物的桥梁3.维持酶的构象 对结合酶而言，通常全酶才具有催化活性 酶的辅助因子分为辅基和辅酶。辅酶与酶蛋白结合比较疏松（一般为非共价键结合），并可用透析方法除去；辅基与酶蛋白结合牢固（一般以共价键结合），不能以透析方法除去。维生素与辅酶维生素辅酶形式主要作用维生素B1TPP-酮酸氧化脱羧维生素B2FMN、FAD递氢维生素PPNAD+、NADP+递氢维生素B6磷酸吡

6、哆醛（胺）转移氨基泛酸辅酶A转移酰基生物素生物素固定CO2叶酸四氢叶酸一碳单位转运维生素B12甲基-B12转移甲基硫辛酸硫辛酸转移酰基二、酶分子结构与功能必需基团：酶分子中与酶活性相关的基团（羟基、巯基、咪唑基和羧基）活性中心内必需基团结合和催化活性中心外必需基团维持酶构象 活性中心：酶分子与底物结合并将底物转化为产物的空间结构区域结合基团：与底物结合，形成酶底物复合物催化基团：把底物转化为产物1.一级结构与活性中心2. 酶活性与高级结构的关系 酶的活性不仅与一级结构有关，并且与其高级结构也密切相关。就某种程度而言，在酶活性的表现上，空间结构甚至比一级结构更为重要。 某些酶在细胞内初合成或分泌

7、时并无催化活性，必须经过某些物质的作用，才能转变为有活性的酶。这种无活性状态的酶的前身称为酶原。使酶原转化为酶的作用称为酶原的激活。3. 酶原的激活 胰蛋白酶原的激活 丝组缬天天天天赖异缬甘缬异组丝缬天天天天赖S-SSSSSS - S离子键或氢键六肽肠激酶胰蛋白酶原胰蛋白酶胃蛋白酶原的激活 几种碎片弹性蛋白酶胰蛋白酶弹性蛋白酶原几种碎片羧基肽酶A胰蛋白酶羧基肽酶原A2个二肽胰凝乳蛋白酶胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶胰凝乳蛋白酶原六肽胰蛋白酶肠激酶或胰蛋白酶胰蛋白酶原6个多肽碎片胃蛋白酶H+或胃蛋白酶胃蛋白酶原除去的小分子活性酶激活条件酶原各种蛋白酶的激活4. 同工酶概念：催化同一化学反应，但酶蛋白的分

8、子组成、结构、理化性质乃至免疫学性质和电泳行为都不同的一组酶称为同工酶LDH1LDH2LDH3LDH4LDH5H4H3MH2M2HM3M4乳酸脱氢酶（LDH）：H型M型四聚体, 5种同工酶乳酸脱氢酶同工酶电泳图谱LDH同工酶的亚单位组成及在人体各组织器官中的分布同工酶百分比组织器官 LDH 1 LDH2 LDH3 LDH4 LDH5心肌 67 29 4 1 1 肾 52 28 16 4 1 肝 2 4 11 27 56骨骼肌 4 7 21 27 41红细胞 42 36 15 5 2肺 10 20 30 25 15胰腺 30 15 50 5脾 10 25 40 25 5子宫 5 25 44 22

9、 4LDH同工酶的生理功能葡萄糖 丙酮酸 乳酸（LDH5：丙酮酸还原酶）三羧酸循环 丙酮酸 乳酸（LDH1：乳酸脱氢酶）经血液运输NADH + H+NAD+氧化磷酸化ATP骨骼肌心 肌LDH同工酶谱分析的临床意义：LDH1： 染色斑点大而深帮助诊断心肌梗塞LDH5： 染色斑点大而深帮助诊断肝癌第一节 酶是生物催化剂第二节 酶的化学本质、结构与功能第三节 酶促反应动力学第四节 酶的命名、分类和活性测定第五节 固定化酶第六节 酶在医药学上的应用第三节 酶促反应动力学 酶浓度E 底物浓度S 温度（T） 酸碱度（ pH ） 抑制剂（I） 激活剂（A）影响酶促反应动力学的因素主要有:一、酶浓度对酶促反应

10、速度的影响条件：底物浓度足够大反应速度与酶浓度成正比酶浓度反应速度E2E1SE二、底物浓度对酶促反应速度的影响Km矩形双曲线图形V=Km+SVmS米氏方程式中 Vm为最大反应速度， S为底物浓度， Km 为米氏常数， V为底物浓度不足以产生最大速度时的反应速度米氏常数的意义米氏常数Km为酶促反应速度达到最大反应速度一半时的底物浓度。 = 1/2 Vm， Km = SKm单位为mol/LKm 可以近似地代表E与S的亲和力, Km越小，代表 E与S亲和力越大三、温度对酶促反应速度的影响在一定温度范围内， T，酶活性 ， T，酶活性；超过一定温度范围， 酶反而变性失活；最适温度，酶活性最高；低温酶活

11、性 高温，破坏酶活性四、PH对酶促反应速度的影响PH 影响酶必需基团、底物等的解离程度最适 PH体外实验选取适当缓冲液6 最适PH 10 PH反应速度/相对活力胰蛋白酶五、抑制剂对酶促反应速度的影响 巯基酶抑制剂 *专一性抑制 丝氨酸酶抑制剂 不可逆抑制 非专一性抑制抑制作用 *竞争性抑制作用 可逆性抑制 *非竞争性抑制作用 反竞争性抑制作用（一）不可逆抑制作用概念：抑制剂与酶活性中心必需基团共价结合， 不能用透析、超滤等物理方法将其除去常见抑制剂：巯基酶抑制剂 丝氨酸酶抑制剂1、巯基酶抑制剂 抑制剂：重金属离子Ag+、Hg2+、砷剂等巯基酶失活的酶分子2、羟基酶抑制（胆碱酯酶）抑制剂：有机磷

12、化合物丝氨酸酶丝氨酸酶乙酰胆碱 + H2O胆碱 + 乙酸胆碱酯酶有机磷杀虫剂胆碱能神经兴奋中毒（心跳变慢、瞳孔缩小、流涎、多汗、呼吸困难）（二）可逆性抑制作用概念：抑制剂与酶非共价结合，可用透析、 超滤等方法除去类型：竞争性抑制作用 非竞争性抑制作用 反竞争性抑制作用1、竞争性抑制 概念：抑制剂结构与底物结构相似，互相竞争 酶的活性中心，从而抑制酶的活性ESEEE + S ES E + PI+EISII琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制CH2COOHCH2COOH琥珀酸脱氢酶H-C-COOHHOOC-C-HCH2-COOHCOOH（-）琥珀酸延胡索酸丙二酸I：磺胺药S：对氨基苯甲酸（PABA）磺胺类药物

13、的竞争性抑制二氢叶酸合成酶磺胺药与PABA相互竞争与FH2合成酶结合PABA二氢蝶呤谷氨酸FH2合成酶磺胺类药物（-）FH2FH2还原酶FH4结构相似磺胺类药物的抑菌机理 MTX（-）结构相似（氨甲蝶呤）细菌不能利用环境中的叶酸合成二氢叶酸 竞 争 性 抑 制 作 用 特 点 1. i与S结构相似； 2. i与S互相竞争与 酶 结合； 3. 抑制程度取决于S和i的相对比例； 4. S，可以减少或去除抑制作用。 （Km， Vm不变）2、非竞争性抑制作用 概念：抑制剂和底物结构不相似，两者互不干扰 同时与酶结合，从而抑制酶活性。E + S ES E + P+I+IEI+SESIESI 非竞争性抑制

14、作用特点 1. i与S结构不相似； 2. i与S互不干扰同时与 酶 结合； 3. 抑制程度只取决于i的浓度； 4. S，不能去除抑制作用。 （Km不变， Vm ）非竞争性抑制作用竞争性抑制作用3、反竞争性抑制作用 概念：抑制剂仅与酶-底物复合物（ES）结合， 使酶失去催化活性E + S ES E + P+I ESI六、激活剂对酶促反应速度的影响凡能提高酶活性的物质，大部分是离子或简单的有机化合物必需激活剂非必需激活剂第一节 酶是生物催化剂第二节 酶的化学本质、结构与功能第三节 酶促反应动力学第四节 酶的命名、分类和活性测定第五节 固定化酶第六节 酶在医药学上的应用第四节 酶的命名、分类和活性测

15、定 酶的分类与编号 酶活性的测定 酶的命名习惯命名系统命名酶的分类与编号氧化还原酶类转移酶类水解酶类裂解酶类（裂合酶类）异构酶类合成酶类（连接酶类）每种酶的分类编号均有4个数字组成酶活性的测定 酶活性： 酶活性单位： 酶活性的测定：时间Sor P IUKatmol分mol秒酶所具有的催化能力 反应的初速度测定条件：1ml血清，PH=7.4，37，2.5g丙酮酸30分钟1个单位（1U）丙氨酸 + -酮戊二酸丙酮酸 + 谷氨酸血液中丙氨酸氨基转移酶（ALT）活性的测定 谷丙转氨酶（GPT）第一节 酶是生物催化剂第二节 酶的化学本质、结构与功能第三节 酶促反应动力学第四节 酶的命名、分类和活性测定第

16、五节 固定化酶第六节 酶在医药学上的应用第五节 固定化酶（Immobilized Enzyme） 酶在水溶液中不稳定，一般不能反复使用，而且不易与产物分离，不利于产物的提纯和精制。 针对这些限制酶广泛应用的因素，将水溶性酶或游离细胞经过化学或物理手段处理，将酶束缚在一定的空间内，限制酶分子在此区间进行活跃的催化作用，成为不溶于水的固定化的酶或细胞。 固定化酶、固定化细胞是一种在空间运动上受到完全约束或局部约束的酶、细胞。可使所使用的酶、细胞能反复使用，使产物分离提取容易，并在生产工艺上可以实现连续化和自动化，故在20世纪70年代后得到迅速发展 。 其新的功能和新的应用正在迅速不断地扩展，是一项

17、研究领域宽广、应用前景极为引人瞩目的新研究领域和新技术。 固定化酶是指借助于物理和化学的方法把酶束缚在一定空间内并仍具有催化活性的酶制剂。 广义的固定化酶又包括固定化酶和固定化细胞两类。 一、固定化酶的概念和优点固定化酶优点：酶经固定化后，稳定性有了提高；可反复使用，提高使用效率、降低成本；有一定机械强度，可进行柱式反应或分批反应，使反应连续化、自动化，适合于现代化规模的工业生产；极易和产物分离，酶不混入产物中，简化了产品的纯化工艺。 吸附法 包埋法 共价结合法 交联法 二、固定化酶的制备方法共价结合法1.吸附法 吸附法是通过载体表面和酶分子表面间的次级键相互作用而达到固定目的的方法。 只需将

18、酶液与具有活泼表面的吸附剂接触，再经洗涤除去未吸附的酶便能制得固定化酶。是最简单的固定化技术，在经济上也最具有吸引力。物理吸附法： 载体有高岭土、磷酸钙凝胶、多孔玻璃等。离子吸附法： 载体有CM-纤维素、DEAE-纤维素和DEAESephadex、合成的大孔阳离子和阴离子交换树脂等。 吸附法的优点：操作简单，可供选择的载体类型多，吸附过程可同时达到纯化和固化的目的，所得到的固定化酶使用失活后可以重新活化和再生。吸附法的缺点：酶和载体的结合力不强，易脱落， 会导致催化活力的丧失和沾污反应产物。 世界第一例获得工业应用的固定化酶是 DEAE-Sephadex A-25吸附的氨基酰化酶反应用于 DL

19、-AA的光学分析。吸附法的优点、缺点共价结合法是目前研究中最为活跃的方法。它是酶蛋白分子上的功能基团和固相支持物表面上的反应基团之间形成共价键，因而将酶固定在支持物上（借助共价键将酶的非活性必需侧链基团和载体的功能基团进行偶连）。2. 共价结合法 共价结合法有数十种，如重氮化、迭氮化、酸酐活化法、异硫氰酸酯法、双功能试剂反应等。 优点： 酶与载体结合牢固，操作稳定性良好。 缺点： 载体需活化，固定化操作复杂，反应条件较剧烈，酶易失活并产生空间位阻效应。 3 . 交联法 是用双功能或多功能试剂使酶分子内或分子间彼此连接成网络结构而使酶固定化的技术。交联法常与吸附法结合使用，或者与包埋法配合，目的

20、是使酶紧紧地结合于载体上。 有4种交联方法： 交联酶法, 酶与辅助蛋白交联法 吸附交联法, 载体交联法。 包埋法又分为凝胶包埋法及微囊化包埋法两种。 凝胶包埋法是将酶或细胞限制于高聚物网格中，包埋介质有卡拉胶、海藻胶、琼脂、明胶和聚乙烯醇（PVA）等 ； 4. 包埋法四种固定化酶制备方法的特点小结物理吸附包埋法共价结合法共价交联法制备易易难难结合力弱强强强酶活力高高中中底物专一性无变化无变化有变化有变化再生可能不可能不可能不可能固定化费用低中高中制法特性三 . 固定化酶在医药中的应用工农业生产药物生产亲和层析医疗固定化酶(细胞）应用实例固定化酶和固定化细胞应用生产时间氨基酰基转移酶DL-氨基酸

21、的旋光度解析1969葡萄糖异构酶将葡萄糖异构变为果糖1973青霉素酰胺酶生产6-APA1973天冬氨酸酶生产L-天冬氨酸1973延胡索酸酶生产L-苹果酸1974-半乳糖苷酶水解乳糖1977L-天冬氨酸-脱羧酶生产L-丙氨酸1982 固定化酶在工农业生产上的应用 产 物 酶或细胞 固定化方法 原 料L-氨基酸果糖浆6APAL-门冬氨酸L-苹果酸低乳糖牛奶乳糖干蛋白果汁脱苦啤酒植物白脱脂肪酸氨基酰化酶葡萄糖异构酶或含该酶之菌体青霉素酰胺酶含有门冬氨酸的菌体含有反丁烯二酸酶的菌体乳糖酶碱性蛋白酶葡萄糖氧化酶和氧化氢酶柚苷酶木瓜蛋白酶脂肪酶脂肪酶载体结合法载体结合法或交联法载体结合法胶格包埋法胶格包埋

22、法载体结合法载体结合法胶格包埋法载体结合法载体结合法或包埋法胶格包埋法载体结合法乙酰-DL-氨基酸葡萄糖青霉素G反丁烯二酸反丁烯二酸牛奶牛奶蛋白桔类果汁生啤酒植物油植物油 产 物 酶或细胞 固定化方法 原 料类固醇L-丙氨酸D-苯甘氨酸ATP核苷酸类味精乙醇啤酒L-亮氨酸乙酸乳酸淀粉酶杆菌肽氢气含脱氢酶及羟化酶的菌体含有L-门冬氨酸、-脱羧酶的菌体氨基酰化酶乙酰激酶5-磷酸二酯酶，5-腺苷酸脱氨酶Sacharomyces carlsbergensie或S.Cerevisiae同上Serratia marcescensAectobcter.sp.乳酸杆菌与酵母Bacillus substilis

23、Bacill sp.Clostridium butyicum Rhodospirillium rubrum胶格包埋法包埋法载体结合法载体结合法载体结合法角叉胶或聚丙烯酰胺胶包埋聚乙烯氯或多孔砖吸附或海藻酸包埋角叉胶包埋水合氧化钛吸附明胶包埋聚丙烯酰胺胶包埋聚丙烯酰胺胶包埋聚丙烯酰胺或琼脂包埋类固醇前体L-门冬氨酸乙酰-DL-苯基苷氨酸ADPRNA葡萄糖培养基 苏氨酸培养基乙醇培养基 固定化生长菌体在三废处理上的应用应用内容 菌 体 固定化方法 毒 物废水处理脱氮作用Candida tropicalisPsendomonas Putida各种微生物混合培养Pseadomonas sp Micrococcus deritrificans聚丙烯酰胺胶包埋聚丙烯酰胺胶包埋皂土和Mg或聚氨基甲酸乙酯海绵活性炭吸附液膜酚苯废水亚硝酸、硝酸 固定化酶在医药治疗上的应用 溶液酶的应用缺陷：酶作为异体物质，在体内应用会导致免疫反应酶是蛋白质，在体内易被网状内皮系统移除和被蛋白质酶水解破坏由于稀释效应，药物酶无法集中于靶器官组织以达到治疗所需的