结构生物学六各种谱学方法

1、结构生物学六各种谱学方法各种谱学方法紫外、红外、激光拉曼、荧光、圆二色性光谱等各种谱学方法是主要结构测定方法的很好的补充，它们能给出生物大分子二级结构及一些溶液构象方面的粗略信息。通过谱学方法可以方便、快捷地获取三维结构的运动性方面的信息，在大分子结构与功能关系的研究中有重要意义各种谱学方法紫外-可见差光谱荧光探针法圆二色谱激光拉曼光谱红外光谱紫外-可见差光谱吸收光谱的原理紫外-可见差光谱吸收光谱的原理定性：吸收光谱的形状，特征吸收波长的位置定量：比尔定律 A = lg(1/T) = abc蛋白质的光吸收基团：酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸差光谱：分子内的生色团经受一定环境变化时，吸收峰发生位移，吸

2、光度和谱带半宽度也有改变，变化后和变化前的光谱差称为差光谱。应用：推断生色团在大分子中是隐藏的、半暴露的、还是暴露的。蛋白质和核酸的热变性动力学研究测定蛋白质的缔合和解离荧光探针法荧光光谱的原理荧光探针法荧光光谱的原理蛋白质的内源荧光：来自色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸，270300 nm 有吸收，313, 350 nm 有荧光蛋白质的外源荧光：蛋白质与荧光探针共价或非共价结合，形成发荧光的配合物。应用：蛋白质疏水区的探测氨基状态的探测二硫键的检测细胞内粘度的测定检测结合程度蛋白质聚合和解离的检测圆二色谱平面偏振光、圆偏振光和椭圆偏振光圆二色性：左右圆偏振光进入物质时，光学活性物质分子对左右圆偏振光

3、的吸收不同，其差值就是圆二色性（CD)。应用：测定二级结构检测构象变化圆二色谱激光拉曼光谱基本原理拉曼散射和瑞利散射激光拉曼光谱基本原理特征拉曼频率 振动频率决定于原子团和化学键的特性。从特征频率及其位移来判断各种基团的存在与否，以及它的化学环境变化的情况使用波数s来表示特征频率，它与频率n及波长l的关系为： s = 1 / l = n / c , 波数的单位是cm-1拉曼光谱的种类共振拉曼光谱傅里叶变换拉曼光谱拉曼旋光活性表面增强拉曼光谱标记拉曼光谱激光拉曼光谱拉曼光谱的应用测定一级结构测定二级结构活性位点、结合位点等局部区域的结构变化研究酶的作用机制研究药物与靶分子的相互作用第三章 蛋白质

4、结构原理（教材第7章）引言 蛋白质结构研究的不断深入认识蛋白质结构规律蛋白质在生命过程中的作用第三章 蛋白质结构原理（教材第7章）结晶状态的蛋白质特征蛋白质的结构层次稳定蛋白质构象的作用力蛋白质结构分类蛋白质折叠问题结晶状态的蛋白质特征结晶状态和溶液状态的蛋白质的结构是基本相同的不同晶型中蛋白质的结构是相同的寡聚酶晶体中不同结晶环境里形成基本相同的亚基结构X射线晶体结构与NMR溶液结构是基本相同的蛋白质结晶的特点蛋白质晶体中的溶剂含量：3050%晶体中蛋白质分子之间存在溶剂通道晶体中蛋白质分子之间的存在接触界面结晶状态的蛋白质特征结晶条件对蛋白质结构的影响不同结晶条件下往往形成相同的晶型结晶时

5、间对蛋白质结构没有影响少数蛋白质在不同结晶条件下会形成不同的结构微重力条件对蛋白质结晶和晶体结构的影响微重力环境有利于生物大分子的晶体生长微重力不足以改变蛋白质分子的构象微重力条件能够改善与蛋白质分子有联系的有序水分子的空间排布蛋白质的结构层次引言蛋白质结构的研究历史20世纪初，Fisher和Hofmeister提出蛋白质肽链学说1952年，丹麦生化学家Linderstrom-Lang提出蛋白质三级结构理论1958年，英国晶体学家Bernal提出蛋白质四级结构理论蛋白质各级结构的概念：一级结构：多肽链中氨基酸残基的排列顺序（氨基酸序列）。二级结构：多肽链骨架（主链）的局部空间结构，不涉及侧链的

6、构象及整个肽链的空间排列。三级结构：整个肽链的折叠情况，包括侧链的排列。四级结构：相同或不同的蛋白质亚单位（亚基）通过非共价键结合在一起时的组合方式。蛋白质的结构层次蛋白质的结构层次蛋白质的结构层次蛋白质的一级结构蛋白质的二级结构蛋白质的超二级结构与折叠结构域和蛋白质的三级结构蛋白质的四级结构蛋白质的一级结构氨基酸肽键多肽链的构象一级结构与生物学功能序列比较氨基酸氨基酸是蛋白质的基本组成单位氨基酸的结构氨基酸氨基酸的立体化学氨基酸有两种立体构型：L-型和D-型（Gly除外）蛋白质都是由L-型氨基酸构成D-型氨基酸存在于某些细菌细胞壁和小肽抗生素中氨基酸氨基酸的酸碱性质所有氨基酸至少有2个可解离

7、的质子一些R-基团也是可解离的氨基酸的氨基、羧基以及R-基团有相应的pKa值氨基酸的净电荷取决于pH值+H3NCCOO-HR+H3NCCOOHHRH2NCCOO-HRH+H+阴离子形式( pH 8.5)两性离子形式阳离子形式( pH 3)等电点 pI氨基酸所有蛋白质都是由20种标准氨基酸构成的氨基酸20种标准氨基酸的分类氨基酸与蛋白质的三维结构疏水残基多位于蛋白质分子内部，亲水残基多位于分子表面外部残基：D, E, K, R; H, N, Q内部残基：L, I, V, M, F两可残基：G, A, S, T, Y, C, W, PGly最小的残基，常出现在两条肽链十分靠近的位置具有广范围的 (

8、f,y) 值，可出现在其他残基禁止的构象中柔性大，常出现于需要运动或转折的肽链片断中氨基酸与蛋白质的三维结构Prof角固定为-60左右，常形成一个转角，改变肽链的方向缺少形成氢键的-NH-，对a螺旋和b折叠具有破坏性可以顺式肽键的形式存在几乎总是暴露在分子表面Cys可以三种形式存在：自由的-SH、配位的-SH以及二硫键常埋藏于分子内部二硫键能够增强蛋白质三维结构的稳定性肽键Peptide bondN-terminusC-terminus肽键C-N键：1.45，C-N肽键：1.33，C=N键：1.25肽键标准的肽键： 顺式 : 反式 = 1 : 1000 Pro的氨基形成的肽键： 顺式 : 反式

9、 = 1 : 4肽键的特征肽键具有部分双键的性质，不能自由旋转肽单位是刚性的平面，6个原子都处在同一个平面上除了Pro的氨基形成的肽键以外，大多数肽键都是反式的多肽链的构象主链构象角f (C-N-Ca-C)y (N-Ca-C-N)w (Ca-C-N -Ca)多肽链的构象多肽链的构象主链构象角的取值范围是受限制的多肽链的构象Ramachandran图一级结构与生物学功能重要的功能位点的残基高度保守功能相似的蛋白质具有相同的序列模式PROSITE数据库：蛋白质家族和结构域数据库例：Bowman-Birk型丝氨酸蛋白酶抑制剂的序列模式： C-x(5,6)-DENQKRHSTA-C-PASTDH-PA

10、STDK-ASTDV-C-NDKS-DEKRHSTA-C某些位点的单个氨基酸的突变可能引起疾病镰刀型红细胞贫血症囊性纤维化病Normal Red Blood Cells Sickled Red Blood Cells镰刀型红细胞贫血症囊性纤维化病(cysticfibrosis,CF)囊性纤维化病(cysticfibrosis,CF)囊性纤维化病(cysticfibrosis,CF)是白种人中最常见的致死性常染色体隐性遗传病。由于大量粘液阻塞全身外分泌腺所致慢性阻塞性肺疾病和胰腺功能不全,CF临床主要表现为慢性咳嗽、大量粘痰及反复发作的难治性肺部感染、长期慢性腹泻、吸收不良综合征、生长发育迟缓等

11、;汗腺受累表现为汗液中氯、钠离子异常增高。这种增高是临床诊断的最重要的特异性指标。1989年,Rommens等运用定位克隆(positionalcloning)法将CF致病基因克隆出来。 现已知CF基因位于人类染色体7q31,全长250kb,共有27个外显子,cDNA全长为6129bp,基因编码为1480个氨基酸的多肽链,这一蛋白质被命名为囊性纤维病跨膜转运调节物cysticfibrosistransmembraneconductanceregulator,CFTR)。 根据cDNA顺序推测,CFTR结构与生物界普遍存在的一类转运蛋白相似,它含有两个重复的由跨膜区和ATP结合折叠区 (nucleotideATP-BindingFolds,N