药物毒理学：长期毒性研究

1、长期毒性研究（重复给药毒性试验）Repeat dose toxicity study提纲第一节概述第二节 基本原则与要求第三节基本内容第四节分类实例讨论第一节 概述 ？In vivo：ADMEDrugTarget organToxic reactionSingle doseDrugDrugDrugDrugIn vivo：ADMETarget organToxic reactionRepeat dose一、定义与目的：长期毒性试验（重复给药毒性试验Repeat dose toxicity study）是观察反复给药情况下,实验动物出现的：毒性反应剂量-反应关系主要靶器官毒性反应的性质和损害程度可

2、逆性等毒性产生时间持续时间可能反复产生毒性反应的时间有否迟发性毒性反应有否蓄积毒性耐受性Descriptive toxicology找出无观察到有害作用剂量(No Obvious Adverse Effect Level, NOAEL）(Applied toxicology)二、应用意义：预测受试物可能引起的临床不良反应(adverse reaction)；判断受试物反复给药的主要毒性靶器官(target organ)；推测临床试验的起始剂量和重复用药的安全剂量范围(margin of safety)；提示临床试验中需重点监测的指标(indexes for monitoring)；为临床试验中

3、的解毒或解救措施提供参考； 为更长期的毒性试验(包括致癌试验)的剂量设计和观察指标的选定提供参考。 三、特点：研究周期最长，困难最大，耗资最多，难以重复。对于新药研究的成功与否起着举足轻重的作用。对保证临床安全用药起着最主要的作用。无法用其它替代方法来取代。总之，重复给药毒性试验是判断一个候选药物是否有进一步开发的价值、通过权衡利弊能否过渡到临床试验的重要依据之一。第二节 基本原则与具体要求一、基本原则试验管理：GLP （Good Laboratory Practice) 参照有关的技术指导原则：CFDA 、 ICH 、OECD 、 FDA、 EMEA整体性：充分考虑药效学、药代动力学和其它毒

4、理学研究的试验设计和研究结果。具体问题具体分析：试验设计应根据化合物的结构特点和理化性质、同类化合物在国内或国外的临床使用情况、临床适应症和用药人群、临床用药方案、相关的药效学、药代动力学和毒理学研究信息等综合考虑。 随机、对照、重复。二、具体要求应在药效、药代、安全性药理、急性毒性试验之后进行；试验设计应由药学、药理、毒理、临床研究人员共同制定；研究设计必须科学、周到和合理；严格掌握试验条件、尽量排除干扰；观察指标力求全面并能针对新药的作用特点，突出重点；认真、科学地分析实验结果，实事求是辨别真伪；数据经合理的统计学处理；结论能明确回答新药毒副反应的主要特点及安全剂量的 主要范围。第三节 基

5、本内容一、受试物：采用制备工艺稳定、符合临床试验用质量标准规定的样品，能代表所要评价物质的总体，理化性质应清晰，包括：制作方法(合成、提取、发酵、重组表达等)所用的前体及溶剂(工程菌、细胞)纯化的方法残留物杂质质量可控性二、实验动物：1、选择理想的实验动物： ：对受试物的生物转化与人体相近对受试物敏感；已有大量历史对照数据实际应用：化学药和中药常选用两种动物，大鼠和Beagle狗皮肤用药的常用小型猪或家兔 生物技术药物，常用非人灵长类-猴2、实验动物的质量控制 ：正常、健康和未孕，动物体重差异应在平均体重的20之内。符合国家有关规定的等级要求，来源、品系、遗传背景清楚，质量合格。选用处于体重增

6、长曲线对数期的动物，试验开始时大鼠为6周龄左右，Beagle犬为6个月龄左右，猴为2-3岁左右 少年期3、实验动物的性别和数量 ：大鼠：雌、雄各10 - 30只Beagle犬或猴：雌、雄各4 - 6只 4、动物试验设施的要求：动物饲养环境能够影响实验动物的生长发育、生理功能与机体代谢，如体重、免疫功能、应激状态、代谢能力等，从而影响了其对受试药品的毒性反映。国家标准GB GB14925-2010中华人民共和国标准 实验动物 环境及设施对动物实验室的要求中山大学实验动物中心动物实验设施(SPF)动物实验设施(狗实验室) 动物实验设施(猴实验室) 三、给药方案：1、给药剂量(dose levels

7、)：一般至少设高、中、低三个剂量给药组和一个赋形剂对照组，必要时还需设立空白对照组或阳性对照组。 高剂量原则上应使动物产生明显的毒性反应，甚至出现个别动物死亡。（找出毒性反应和靶器官）低剂量原则上应高于动物药效学试验的等效剂量，并不使动物出现毒性反应。（找出NOAEL）在高剂量和低剂量之间设立中剂量，考察毒性反应剂量-反应关系2、对照组 (control)：空白(blank)对照组：对试验组动物取得的各种数据与正常动物进行比较，也可比较试验前后各种数据的本底值 赋形剂(vehicle)对照组(包括溶媒、胶囊、生理盐水、佐剂或空载体) ：排除赋形剂对试验结果解释的干扰。阳性(positive)对

8、照组(包括已知典型毒性反应的阳性对照物和已知毒性资料的标准物)：考察所选用的实验系统及方法是否能反映一些特殊的毒性（如神经系统毒性），提供对受试物所产生的毒性反应程度进行比较。 3、给药途径 (route)：原则上应与临床用药途径一致，特殊情况需作说明 经口给药(by orally)：灌胃(i.g)、灌服胶囊、掺入饲料、掺入饮水注射给药(by injection)：肌肉注射(im)、静脉注射(iv)（输注,infusion）、腹腔注射(ip)、皮下注射(sc)、皮内注射等 皮肤给予(topical)：包括开放、半封闭、封闭给药 其他：瘤内注射 、舌下给药 4、给药频率 ：理想的给药频率及给药间

9、隔尽量与人拟用方式一致原则上应每天给药，给药期限长（3个月或以上）的药物每周至少应给药6天。根据具体药物的特点设计给药频率5、给药期限 ：与拟定的临床疗程、临床适应症和用药人群有关四、检测指标：涉及全身各系统：血液、免疫、肝脏、肾脏、呼吸、神经行为、心血管、消化、内分泌、生殖、眼、耳、皮肤、粘膜等。对应的检测指标：一般观察指标、血液学、血液生化学、病理解剖学及病理组织等方面。1、一般状况的观察：最基本、最重要的内容体重、摄食量：是非特异性指标，可用作全身毒性反应的初步反映。一般症状观察：笼旁观察，每天两次，观察动物是否出现死亡。按症状观察表进行详细的检查和记录。2 心血管功能检查动物：大动物检

10、测时间：试验开始前、试验期间、试验结束指标：描记心电图，测量血压、心率特别注意：Q-T间期心血管、神经功能检查3 血液学指标 内容：红细胞计数(RBC) 、血红蛋白(HB) 、白细胞计数(WBC) 及分类、血小板计数(PLT) 、凝血酶原时间(PT) 、网织红细胞计数(Ret) 。意义：贫血、溶血、红细胞生成减少、化疗、肾上腺皮质激素 、肝脏受损、骨髓抑制4 血液生化学指标 内容及意义：肝胆功能：丙氨酸氨基转换酶 (ALT)天门冬氨酸氨基转换酶 (AST)-谷氨酰转移酶 (GGT)碱性磷酸酶 (ALP)胆碱脂酶（CHE） 肾功能尿素氮（BUN） 肌酐（CRE） 蛋白:总蛋白（TP） 、白蛋白（

11、ALB） 糖(GLU)脂类:甘油三酯（TG) 、总胆固醇（TCHO） 、高密度脂蛋白胆固醇（HDL）、低高密度脂蛋白胆固醇（LDL)总胆红素(T-BIL)、直接胆红素(D-BIL)肌损伤：乳酸脱氢酶（LDH） 、肌酸激酶（CK） 离子：Ca2+、IP、K+、Na+、Cl-其他特征性指标5、骨髓检查意义：观察骨髓细胞数量是否波动，细胞构成比例的变化，特异细胞是否异常增殖或减少和消失，出理异常形态的细胞。6、尿液分析指标内容：尿液外观、比重（SG） 、pH值（pH） 、尿糖（GLU） 、尿蛋白（PRO） 、尿胆红素（BIL） 、尿胆原（UBG） 、酮体（KET）、亚硝酸盐（NIT）、潜血（BLD）

12、 、白细胞（LEU）检测仪器7、组织病理学检查 给药结束后，应对动物（除恢复期观察动物）进行全面的大体解剖，主要脏器应称重并计算脏器系数。脏器系数 (%) = (脏器重量体重)100病理仪器组织病理学检查是长期毒性试验的核心内容之一，对判断动物的毒性靶器官或靶组织具有重要的意义，是发现毒性和描述毒性的“证据”。旨在：全面细致反映组织结构状态提供重要的形态学依据判断毒性损伤部位程度性质寻找毒性靶器官探讨毒性作用机理。8、恢复期观察给药结束后对部分动物（1/3-1/2）进行恢复期观察，以了解毒性反应的可逆程度和可能出现的延迟性毒性反应。在此期间除不给予受试物外，其它的观察指标，各项检测指标及病理学

13、检查与给药期相同。第四节 实例讨论本节讨论内容以下几类药物的长期毒性试验方案要点：抗癌药紫杉醇制剂中药复方小儿止咳糖浆治疗型乙肝疫苗重组人胰岛素抗癌药紫杉醇制剂方案要点：受试物：理化性质制剂？给药途径？抗癌药：药效用法动物、给药时间抗癌药：作用机理毒性靶器官检测指标中药复方小儿止咳糖浆方案要点：中药、糖浆：处方（成分）糖浆（浸膏）经口小儿止咳：药效用法动物、给药时间止咳：作用机理毒性靶器官？检测指标治疗型乙肝疫苗方案要点：疫苗：理化性质制剂？给药途径？治疗型：药效用法动物、给药时间乙肝疫苗：作用机理毒性靶器官检测指标特殊性：免疫原性，何时取血检测？何时解剖动物？重组人胰岛素方案要点：受试物：来源（重组人用蛋白）制剂？给药途径？胰岛素：药