03 第三章 植物次生物质研究进展ppt课件

1、第三章 植物次生物质研讨进展一、植物次生物质的性质和种类二、植物次生物质对植物的维护作用三、植物次生物质对害虫的防御作用四、植物次生物质的提取技术五、植物次生物质的化学构造和植物源杀虫剂的开发与运用八、基因工程技术提高药用植物次生物质产量研讨进展六、植物细胞培育技术合成次生代谢物质研讨进展七、植物的次生代谢途径研讨进展.一、植物次生物质的性质和种类在植物的新陈代谢过程中产生了各种各样的化学物质，其中有些化合物是维持植物生命活动所必需的，称为初生代谢产物primary metabolites，如：蛋白质、糖类、脂类、核酸等。还有一些有机物质，如：单宁、苷类、有机酸、生物碱、香豆素、木质素、蒽醌等

2、，这些物质与植物正常的生长发育没有直接关系，通常以为是次生代谢产物(secondary metabolites)，称之为植物次生物质。 .植物体内含有大量无明显生理功能的次生代谢产物，但在调理植物本身顺应其生态环境方面却起着重要作用。昆虫是植物生态环境中的一部分，对植物次生性化合物质的演化有直接影响；同时，植物所含的这些化合物质也对昆虫为害施加制约。植物在同昆虫为害的斗争过程中产生了一套防御机制，其中最重要的是化学物质，其次是形状构造。.植物次生物质的种类主要有：萜类 terpene 或类萜 terpenoid 单萜、倍半萜、双萜、三萜、四萜、多萜，酚类 phenol简单苯丙酸类、苯丙酸内酯、

3、苯甲酸衍生物类、木质素、类黄酮类、鞣质，含氮次生化合物生物碱、含氰苷、非蛋白氨基酸以及聚乙炔类等。其中种类繁多的是生物碱、黄酮类、萜类等。这些物质对昆虫的化学防御作用，主要是忌避作用、抑制取食、抑制生长发育、激素效应、毒杀作用等。.二、植物次生物质对植物的维护作用1. 防治病害 2. 防治虫害 3. 防治杂草，提高植物种间竞争才干.1. 防治病害 棉花中存在酚类化合物可抗黄萎病菌，洋葱等作物表皮层中含有的儿茶酚和儿茶酸等次生物质是抵抗病菌侵染的重要成分，松属植物中含量很高的抗菌物质赤松素能有效地防止心材腐烂。水杨酸能诱导植物对病毒、真菌及细菌等病原物的抗性，还能诱导植物抗热、抗冷、抗旱以及抗紫

4、外线辐射等。植物感染病原微生物后，木质化作用加强，添加木质素以阻止病原菌进一步扩展。植物凝聚素能防治病害，如：小麦、大豆和花生的凝聚素能抑制多种病原菌的菌丝生长和孢子萌生，水稻胚中的凝聚素能使稻瘟病的孢子凝聚成团，甚至破裂。.2. 防治虫害 有些次生物质对昆虫表现为毒杀、忌避、拒食、抗产卵、抑制昆虫生长等作用。 目前许多国家研制和开发的以烟碱、苦参碱、鱼藤酮、苦皮藤素为代表的植物次生物质已胜利地运用于农林害虫的防治，毒芹、狼毒大戟、北乌头等植物茎叶的丙酮提取物对食叶害虫杨扇舟蛾、舞毒蛾、黄褐天幕毛虫都有毒杀作用。生物碱、非蛋白氨基酸、类黄酮、多炔和强心甙等是大多数昆虫的拒食剂。此外,植物也可产

5、生非毒性但能降低营养价值和忌避昆虫的次生物质以减少被害，如胜红蓟次生物质对小菜蛾田间种群具有明显的控制造用，主要是避忌小菜蛾成虫产卵及降低其生殖才干。 .许多萜类化合物对多种昆虫有驱避、拒食和毒杀作用，如从黄杜鹃花中分别出的四环二萜化合物对斜纹夜蛾和甜菜夜蛾等都具有剧烈的拒食作用和毒杀作用，还对小菜蛾有显著的产卵忌避作用和较明显的杀卵作用。羊蹄甲、细叶桉、飞杨草、假连翘、花椒、荷花玉兰、烟草的乙醇提取物对小菜蛾成虫产卵有较好的驱避效果，驱避率达 80%以上，一品红、构树、艾蒿、茶枯垂柳、飞杨草、羊蹄、狗尾草的乙醇提取物对小菜蛾幼虫有较好的拒食作用，48小时拒食率达 80%以上。非洲山毛豆、飞机

6、草、大桉的乙醇提取物对荔枝蒂蛀虫产卵的驱避作用效果在 80%90%之间。.3. 防治杂草，提高植物种间竞争才干植物能经过产生和释放次生物质，抑制临近的其他植物的生长发育。 如水稻叶片中的 P香豆酸含量与水稻抑制稗草生长的关系亲密。黑胡桃分泌的胡桃醌能将生长于临近或其树冠下的番茄和苜蓿毒杀，白叶鼠尾草分泌的桉树脑和樟脑等，能抑制雀麦、狐茅的生长。大豆、黄瓜的某些品系分泌的次生物质能抑制其周围杂草的生长。番茄的根能分泌单宁等次生物质，它会对临近的作物生长发育产生不良的影响。苹果和梨释放的萜类挥发性物质，能抑制马铃薯的发芽。 .植物的次生物质不仅能防治病、虫、杂草的危害，还能防治其他植食性动物的危害

7、。如广泛存在于植物界的含氰苷本身无毒，但植物破碎后就会释放出有挥发性的毒物氰化氢 HCN ，植食性动物如蛇、蛞蝓取食后，产生 HCN，呼吸就会被抑制。鞣质有毒，植食性动物吃后明显抑制生长。 .三、植物次生物质对害虫的防御作用1. 植物次生物质的拒食、驱避作用2. 植物次生物质对昆虫生长、生殖及存活的抑制造用3. 植物次生物质对昆虫的毒杀作用.1. 植物次生物质的拒食、驱避作用许多害虫有时虽能接近甚至附着在某些植物体上，但却不能取食或者很少取食，其缘由是这些植物体内含有抗拒昆虫取食的次生物质。植物体内对昆虫具有拒食作用的次生物质较多，其中常见的有生物碱、类黄酮和萜内脂等。 1拒食作用.楝科植物的

8、提取物及印楝素、川楝素等对褐稻虱具有拒食和忌避作用，对斜纹夜蛾大龄幼虫表现出剧烈的拒食作用，5%的苦楝种核乙醇提取物对水稻叶夜蛾5龄幼虫拒食率高达99.8%，2%印楝油对白脉粘虫5龄幼虫拒食率达92% 。楝科植物大叶桃花心木和毛麻楝甲醇提取物对稻蝗的拒食率分别为87.4%和86.9%。.杜鹃花 花中西施闲折两枝持在手，细看不是人间有。 花中此物是西施，芙蓉芍药皆嫫母.杜鹃花被称作为杀虫植物，存在于黄杜鹃花中的闹羊花素 rhodojaponin- 、grayantotoxin-I、和kalmanol等成分对马铃薯甲虫、草地夜蛾、杂拟谷盗、菜粉蝶幼虫和斜纹夜蛾等害虫均有显著的拒食作用；其中，闹羊花

9、素-的拒食作用最强，它对马铃薯甲虫4龄幼虫和草地夜蛾3龄幼虫的PC50分别为2.8g/mm2 和6.4g/mm2。 黄铃杜鹃 .紫背金盘甲醇提取物对菜青虫、斜纹夜蛾和粘虫均表现显著的拒食作用，其中对菜青虫5龄幼虫的非选择性拒食率为80.6%。紫背金盘氯仿提取物氯仿提取物的拒食效果高于甲醇提取物。紫背金盘 .辣蓼，全草有毒，其中的天然产物蓼二醛具有很好的昆虫拒食活性。 .萝藦科马利筋属马利筋提取物用作催吐剂及泻药，叶乳汁可治肠内寄生虫，果乳汁可止血。 粗提物对玉米叩甲有剧烈拒食作用。 .苦槛蓝科苦槛蓝氯仿萃取物对菜粉蝶4龄、5龄幼虫非选择性拒食率均在94%以上。叶、茎的甲醇和石油醚浸提物对3-5

10、龄菜青虫的各龄试虫均有较好拒食活性；其中，对3龄试虫的24h非选择性拒食率均在90%以上，对4龄试虫的拒食率均在80%-87%之间，而对5龄试虫的拒食率相对较低，为46.49%-63.31%。苦槛蓝病虫害极少，顺应性和抗逆性都很强。 .唐古特瑞香甲醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿、苯的抽提物，具有明显的拒食和胃毒活性，对斜纹夜蛾3龄幼虫的拒食率均在80%以上；其中，苯抽提物拒食活性最高，其次是氯仿抽提物。.1. 植物次生物质的拒食、驱避作用2植物次生物质的驱避作用植物体内经过次级代谢产生驱避性物质，在抗拒植食性昆虫为害方面很胜利。通常植物产生一些挥发性次生物质，可以引起昆虫负趋向运动和无定向挪动，从而

11、可防止或抵御昆虫取食。.将柳薄荷、迷迭香、撒尔维亚、亚里香等唇形科植物和豆科植物白荷蓝翘摇间作到蔬菜地内，可以减轻小菜蛾的为害。这5种植物乙醇提取物和精油对小菜蛾产卵有显著的驱避作用。甘蓝乙醇提取物对菜粉蝶有显著的产卵驱避作用，但其水提取物没有驱避作用。非寄主植物的已烷提取物对菜粉蝶产卵有极显著的驱避作用，但水提取物的驱避作用较弱。 .万寿菊粗提物对小菜蛾成虫产卵有剧烈的忌避作用，在室内的非选择性产卵忌避率为97.33%，室外为56.48%。番茄枝叶的甲醇和水溶性乙醇提取物对菜粉蝶有显著的产卵忌避作用，其中第1天的忌避率分别为、87.45%、85.1%、50.0%，均到达差别显著程度；番茄枝叶

12、乙醇提取物不仅能显著地忌避菜粉蝶产卵，而且还剧烈地干扰其产卵行为。 .闹羊花素- 和黄杜鹃花乙酸乙酯萃取物对小菜蛾有产卵忌避作用，在非选择性和选择性实验处置72h，闹羊花素- 质量浓度0.5g/L的产卵忌避率分别为77.54%和80.13%，EtOAc萃取物质量浓度5g/L的忌避率分别为55.86%和66.01%。 .2.植物次生物质对昆虫生长、生殖及存活的抑制造用有些植物可以在体内合成一些抑制昆虫生长发育的次生物质苯甲酸、水杨酸、棉子酸、芸香酸等，昆虫吞噬后，生活周期延伸，添加了暴露给捕食生物、寄生物、病原微生物和不利气候条件的时间，从而减少昆虫的数量，减轻取食压力；或者植物体内含有各种昆虫

13、激素或类似物质如蜕皮激素、保幼激素、抗保幼激素等，昆虫吞噬后可干扰原来的激素调理机制，使昆虫不能正常发育，甚至死亡。.昆虫的保幼激素起着调理昆虫生长发育的作用。许多植物精油成分是合成保幼激素的重要中间体，例如橙花醇和香叶醇是合成17个碳原子的保幼激素的中间体。另外，菖蒲油能抑制昆虫性腺的发育。双稠哌啶类生物碱有引起昆虫产卵量和卵孵化率下降的作用及印楝提取物有抑制产卵和孵化的作用。.有人用1.0g/mm2剂量的黄华碱和野靛碱处置的构树枝分别喂饲桑天牛，黄华碱不表现拒食作用，但野靛碱表现出显著的拒食作用。同样剂量条件下，2种生物碱均能使桑天牛的产卵量和孵化率显著下降，但没有引起死亡。.用8.010

14、-2、4.010-2、2.010-2、5.010-3 g/mm2剂量的印楝提取物处置的构树枝喂饲桑天牛，前2种剂量引起100%死亡率；2.010-2的量引起80%的死亡率，并导致雌虫不产卵；而后2种剂量的死亡率分别为30%和0%，并导致产卵量和卵孵化率较对照急剧下降。用乙醚、丙酮、乙醇3种有机溶剂浸提苦瓜叶片提取液涂抹白菜叶豢养小菜蛾幼虫。结果阐明，3种有机溶剂提取液不同浓度饲喂试虫，随浓度增高，其取食逐渐减少，生长速率减慢，存活率显著下降，其中质量分数50%的乙醚提取液作用最强。 .用苦槛蓝氯仿萃取物处置菜粉蝶4龄幼虫后，试虫平均体重的增长显著低于对照，处置后4d，经质量浓度1%氯仿萃取物处

15、置的平均体重仅为对照的36.74%。经质量浓度1%氯仿萃取物处置幼虫后，羽化率仅为3.33%，发育抑制率为88.89%。用苦槛蓝叶氯仿和甲醇萃取物处置4龄虫72 h后，LC50分别是质量浓度6.3、13.9g/L。质量浓度10g/L的苦槛蓝叶氯仿萃取物处置菜粉蝶5龄幼虫4d 后，试虫平均体重为对照的36.05%、羽化率为4.00%、发育抑制率达86.15%。胡美英和Ali Al-Bashari等人实验阐明，苦槛蓝萃取物对菜青虫子的生长发育有显著的影响。 .姜黄油对赤拟谷盗既有忌避作用还能干扰其正常的繁衍和发育，使大多数幼虫不能化蛹而死亡，或发育成畸形蛹、畸构成虫。闹羊花素- 和黄杜鹃花乙酸乙酯

16、提取物对亚洲玉米螟3龄幼虫具有剧烈的生长抑制造用，其致死中浓度LC50质量分数分别为9.30和39.64mg/kg。 .3. 植物次生物质对昆虫的毒杀作用植物中含氮次生物质多能引起昆虫中毒，概括起来主要有生物碱如番茄苷、尼古丁等、除虫菊酯类、鱼藤酮类。此外，一些多糖、生氰物质、皂苷、特异氨基酸、不饱和异干基酰胺类，也都是常见的对昆虫有毒杀作用的物质。.华南农业大学昆虫毒理研讨室从80年代开场讨论川楝素的杀虫作用。在三化螟内吸毒杀实验中发现川楝素具有强的内吸拒食及毒杀活性；在其它实验中，又发现川楝素对白脉粘虫、小菜蛾、亚洲玉米螟均表现出强的拒食及毒杀活性。.肖春旺研讨东方粉蝶幼虫对经过不同烟碱浓

17、度喷洒过的结球甘蓝、大白菜、蕹菜和莴苣菜4种蔬菜的寻食行为，以及不同烟碱浓度对东方粉蝶幼虫的毒害作用。研讨结果阐明：在同一烟碱浓度下，东方粉蝶幼虫对4种蔬菜寻食行为及毒害致死时间差别不显著；不同烟碱浓度显著影响东方粉蝶幼虫对4种蔬菜的寻食量和存活时间；烟碱浓度与东方粉蝶幼虫的寻食数量和对东方粉蝶幼虫的存活时间呈显著的负相关。.罗万春等报道，苦豆子的次生代谢物质为喹诺里西定生物碱类，该生物碱中的野靛碱对萝卜蚜虫有很高的毒杀作用，对其无翅成蚜的致死中浓度LC50为432.592.12mg/L，优于著名的杀蚜生物碱毒黎碱和烟碱。.据2000年焦懿汇总，目前知对植食性昆虫具有驱避、拒食、抗生、毒杀作用

18、的植物次生化合物有13000余种，它们的化学构造已清楚，分别为：含氮化合物生物碱类、非蛋白氨基酸类、生氰苷类约6000种，萜类和类萜类单萜类、倍半萜内酯类、二萜类、三萜类、强心苷类约6000种，醌酚类复合单宁、水解单宁、酚类、黄酮类、醌类约2000种，其它多聚炔类、糖苷类、香豆素类、木聚糖类约为1000种。.四、植物次生物质的提取技术1. 溶剂萃取技术2. 蒸汽萃取技术3. 超临界萃取技术目前，在植物次生物质的提取中，运用得较多的是以下3种萃取技术： .1. 溶剂萃取技术借助液体萃取技术，从植物资料中分别出次生物质。首先，对植物资料进展预处置，以获取可观的萃取量。传统方法是分别、切碎、枯燥和破

19、碎。新的方法是致冷碾磨，这使产品具有较大的外表积和由于低温操作而挥发物损失较少，可产生更有效的萃取。萃取的完成需求运用食用油及一些有机溶剂(如正乙烷、醚、氯仿、苯、醇类)。萃取后，对溶剂进展简单的蒸发就能得到最终产品。.2. 蒸汽萃取技术运用气态萃取技术比液态更好地穿过预处置的资料，产生有效的接触面积，并且，小分子的化合物在气态中的分散度比液态要高，因此，在气态萃取过程中，次生代谢产物的回收率要超越液态萃取过程。蒸汽蒸馏是气态萃取最普遍的方式。这种萃取技术，将装有植物资料的流动床放在多孔的支持物上，随着蒸汽延续流动，植物资料中的挥发性有机化合物由于用低的分配蒸汽气压作用于气态中被带走，而后，被

20、这种蒸汽流携带的化合物，经过降低溶解度而很容易分别出来。.3. 超临界萃取技术在低溶解度的气体中，需求在提高压力与温度的条件下进展气态萃取。当气体紧缩与加热后，它能聚集成没有显著气液的形状，这称作 “超临界气体。其提高的溶解特性可与液体相比，而它存在的分散系数又相当于天然气体，超临界气体也具有气体一样的粘度，这意味着在超临界中植物资料的接触面积与气体中是一样的。当超临界气体压力下降时，萃取的有机化合物很容易从气态中分别出来。通常选择超临界CO2作为萃取介质，这主要有以下优点：萃取过程不会破坏萃取物的特性；属惰性气体，不会发生氧化反响；无毒；低极性；组分易分别。采用CO2作超临界萃取出的产物比蒸

21、汽蒸馏高温萃取更近似于原始资料。.目前，植物性杀虫剂的研讨中所用的提取方法普通都是索氏、冷浸等比较传统的溶剂提取方法。这些方法存在一些缺乏之处，如需求耗费大量有机溶剂、易引起人员中毒等。当今新兴流行的是超临界流体萃取，具有快速、提取杂质少等优点，逐渐被运用。.五、植物次生物质的化学构造和植物源杀虫剂的开发与运用1. 植物次生物质的化学研讨2. 植物源杀虫剂的开发与运用植物源杀虫剂的优点是：普通选择性强，对天敌及人、畜毒性低，无残留污染，在环境中易降解；作用方式独特，害虫不易产生抗药性；开发本钱相对较低。植物源杀虫剂的活性成分普通都是植物产生的次级代谢物质，包括生物碱类、糖苷类、萜类、甾类、醌类

22、、酚类、香豆素类、奎宁类、木质类、多炔类、噻吩类等。随着化学合成杀虫剂在运用中产生的 “3R问题，即残留Residue、抗性Resistance及害虫再猖獗Resurgence日益突出，人们高度注重开发防止产生“3R问题的杀虫剂。.1. 植物次生物质的化学研讨钟平对印楝杀虫剂的杀虫作用和机理进展了报道，发如今印楝种子和叶片的提取物中，至少有9种化学活性物质可以影响昆虫的活动，而azadirschtin、salannin、meliantriol和mimbin 4种成分起主要作用，这4种物质的化学构造目前曾经研讨清楚。从构造上看，这4种活性成分主要为三萜类物质，构造与类固醇、甾类有机化合物等激素类

23、物质相类似。当害虫汲取这些印楝活性成分后，本身内激素平衡被破坏，内分泌系统运转失常，新陈代谢和生长发育失调，大脑及身体各部分功能紊乱，以致生殖功能失常，不能繁衍后代，最终使昆虫群体数量下降。这些活性成分作用的主要方式有：使害虫对植物产生厌恶和排斥感；阻止或降低雌虫产卵；妨碍害虫取食与正常发育；使昆虫成虫产卵下降，并使卵不育。.乐海洋对菊科杀虫植物的化学和毒理学进展报道，指出菊科植物含有2类独有的天然产物构造类型，即是倍半萜内酯和许多不同类型的炔类化学物。倍半萜内酯化合物的构造有一个共同的特点：都含有不饱和的内酯环，这种构造能否和活性有关，还有待于进一步研讨，但这类化学物对昆虫具有较强的拒食作用

24、。 .李晓东等报道，已从楝科植物中分别出来的次生代谢物质种类繁多。从简单的芳香化合物到香豆素类、黄酮、蒽酮、蒽醌、甾醇、单萜、二萜以及复杂的三萜化合物等，植物来源不同，化学成分差别很大。楝科植物次生化合物中有杀虫活性的主要集中于三萜类，其中以其衍生物柠檬素类的活性更高。目前，曾经分别鉴定的柠檬素类化学物有300多种，其它多种植物次生代谢产物活性成分的组分和化学构造还在研讨中。.2. 植物源杀虫剂的开发与运用从植物中寻觅新型生理活性物质，判明构造，并以此为模板合成一些化学物质，是创制新的农药种类的重要途径。当今农药市场中的两大杀虫剂种类氨基甲酸酯类和拟除虫菊酯类的开发胜利就是从毒扁豆和除虫菊这2

25、种杀虫植物的研讨开场的。.目前，拟除虫菊酯农药的用量占世界农药总用量的2/3。近年来令人瞩目的天然植物杀虫剂当属“印楝素，1968年初次分别胜利，1988年弄清化学构造。目前，美国已开发成商品印楝素制剂“Margosan-0作为家庭花卉害虫防治剂，印度也有印楝素制剂“Neemmark上市。据报道，印楝素至少对71种昆虫具有拒食、忌避、生长发育抑制造用，是目前国际上公认的最具潜力的植物性杀虫剂。韩国、日本、尼日利亚、意大利、瑞典、芬兰、英国等均正在研讨天然药用植物性杀虫剂。.截止到1998年底，我国正式登记注册的植物农药种类到达16种之多，消费厂家达40家，种类包括烟碱、苦参碱、印楝素、鱼藤酮、

26、茴蒿素、藜芦碱、苦皮藤素、川楝素、毒藜碱、茶皂素、乙蒜素等。目前，植物农药在我国已开展成为一类重要农药。 .六、植物细胞培育技术合成次生代谢物质研讨进展在人类知的 30 000种天然产物中 80%来源于植物，知化学构造的植物源次生代谢物数量是微生物源的 4倍。一些药品售价不匪，如抗心肌炎药物辅酶 Q 104 000 /kg,抗癌药物紫杉醇 600 000 /kg,抗肿瘤药物喜树碱 430 000/kg,抗心脑血管药长春新碱更是到达 2 000 000/kg,每年此类药品的买卖额达 30亿美圆，直到今天全世界有 121种临床运用的处方药来源于植物，大约有75%的世界人口要依赖传统的植物药剂。这些

27、物质平安、高效、无污染且不易被化学方法合成，在人们的日常生活及各种行业中正扮演着越来越重要的角色。.六、植物细胞培育技术合成次生代谢物质研讨进展6植物细胞培育技术运用前景5生物转化研讨4固定化培育技术3毛状根培育技术的运用(后述)2植物细胞培育技术消费次生代谢物的增产战略1植物细胞培育技术消费次生代谢产物的研讨历史及现状.1植物细胞培育技术消费次生代谢产物的研讨历史及现状1植物细胞培育技术特点2植物细胞培育技术研讨历史与现状植物次生代谢的概念是在 1891年由 Kosszel首先明确提出的。植物细胞培育技术源于德国著名植物学家 Haberlandt 1902 提出的细胞全能性学说。 .1植物细

28、胞培育技术特点1可以保证产物在一个限定的消费系统中延续、均匀消费，不受病虫害、地理和季节等各种环境要素的影响;2可以在生物反响器中进展大规模培育，并经过控制环境条件得到超越整株植物产量的代谢产物;3所获得的产物可从培育体系内直接提取，并快速、高效的回收与利用，简化了分别与纯化的步骤;与其它的方法相比，运用植物细胞培育技术消费次生代谢产物具有以下优点：.4有利于细胞挑选、生物转化，合成新的有效成分;5有利于研讨植物的代谢途径,还可以利用某些基因工程手段探求与发明新的合成道路，得到价值更高的产品; 6节省大量用于种植原料的农田，以便进展粮食作物的消费。.2植物细胞培育技术研讨历史与现状1956年

29、ROUTIOR和 NIKZELL初次提出运用植物细胞培育技术商业化消费植物化合物的想象；1967年 KAUL和 STABA采用多升发酵罐对 Ammvisnaga进展了细胞大量培育的研讨，并初次用此方法得到了药用成分呋喃色酮，使这一想象变为现实。1984年日本的 Mitsui (三井)公司利用紫草消费紫草宁规模到达 750L,产物最终浓度到达 1 400mg/L。.20世纪 90年代至今，利用植物细胞进展天然产物的消费进入了一个崭新的开展阶段,它与基因工程、快速繁衍构成了新世纪生物技术领域的三大主流。迄今为止，全世界曾经有 1 000多种植物进展过细胞培育的研讨。利用植物细胞培育技术消费的次生代

30、谢产物被人类广泛运用，一些天然成分如紫杉醇、紫草宁、迷迭香酸和人参皂甙等已进入工业化消费阶段。同时探求出了悬浮培育、两相培育、固定化培育、毛状根培育、冠瘿培育、反义技术等先进的培育方法。据 1996年报道，国际上经过植物细胞和组织培育的方法进展食品成分商业化消费最胜利者是日本。.下面列出几个利用植物培育技术工业化消费有用代谢物的例子，如紫杉醇的消费，自从 1991年 CHRISTEN等人恳求有关红豆杉组织培育的专利以来,在培育体系紫杉醇含量已提高 100多倍，到达 153mg/L,美国的 Phytoncatalytic公司已在德国进展了 75 t发酵罐的实验;其他如日本三井石油公司消费紫草宁和

31、小檗碱750L、日本日东电工公司消费人参皂甙和花样素500L、西德 A. Nattermann&Gie. GmbH公司消费迷迭香酸75 000L、英国的辣椒素消费、美国的香子兰代谢物消费、加拿大的血根碱消费等。.2植物细胞培育技术消费次生代谢物的增产战略1挑选高产细胞系2调控营养程度3前体饲喂4优化培育环境5诱导作用6浸透作用7产品转移8-环糊精包衣法.1挑选高产细胞系如在紫草的培育体系中，经过对无性繁衍系广泛的挑选最终使紫草宁的产量添加1320倍。挑选植物高产细胞系常用的方法有目视法、放射免疫法RIA、酶联免疫法ELISA、高效液相色谱法HPLC等。目前国外还采用一种突变种挑选法，其原理是把

32、一些细胞毒性抑制剂如 p - 氟苯丙氨酸PFP、5 - 甲基色氨酸、草苷磷、维生素 H等参与到要挑选的细胞培育体系中，那些耐药性强且经过一段时间培育生长正常的细胞系就能够是所要求的高产细胞系。例如从欣赏辣椒提取辣椒素和牛舌草提取迷迭香酸的细胞系挑选就运用了 PFP并获得胜利。.2调控营养程度1糖程度 2氮盐程度 3磷酸盐程度 4生长调理物质 .3前体饲喂前体添加已成为植物细胞培育中添加次生代谢物质的有效手段，其原理就是对于任何一种前体化合物，它都是生物体代谢途径中的中间体，在培育体系中参与这种外源中间体将有利于终端产物的合成。 .4优化培育环境1温度 2光照 3pH值 4振荡与通气 .5诱导作

33、用植物消费次生代谢产物实践是对外界病原体侵袭的一种防御反响，所产生的次生代谢产物统称为植保素。当被类似于病原体的诱导子侵染时植物也会作出一样的反响。诱导子是触发次生代谢物合成的一种信号，为了回应这种外界压力次生代谢途径被启动。在植物细胞培育中运用的诱导子包括生物诱导子如真菌、细菌、酵母菌等的菌丝体匀浆和非生物诱导子如多糖、凝乳聚糖、壳聚糖、寡聚糖、花生四烯酸、水杨酸、甲基茉莉酮酸MJA和重金属盐类 硝酸铈銨、硝酸银等，目前运用最多的真菌诱导子，.6浸透作用即产品释放技术。在很多情况下，植物细胞培育产生的代谢产物大多储存于细胞液泡内，如何使其从液泡中释放出来是需求处理的另一问题。细胞的透性可以经

34、过测定初生代谢过程中酶的活性来监控，这些酶包括己糖激酶、葡萄 - 6 -磷酸脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶、苹果酸和柠檬酸合成酶等。为了坚持细胞的活性及在较短时间内大量的基质与目的产物出入细胞,一些浸透试剂如异丙醇、二甲亚砜、多糖、壳聚糖等被运用以添加酶的活性及激发胞内储存物质的释放，其它的浸透方式包括超声波降解法、电穿孔法、离子电泳法、高电场脉冲及超高压在获取次生代谢物方面也有报道。.7产品转移一些酶或非酶的降解物及产生的挥发性物质在细胞中积累对目的产物的合成有反响抑制的作用。经过在培育体系中加水溶性或脂溶性的有机物或有吸附作用的多聚化合物如大孔树脂、木炭、琥石树脂等，使培育体系构成上、下两相或三相

35、，细胞在其中一相生长与合成次生物质，而这些产物又经过自动或被动运输方式释放到细胞外，并被另一相所吸附，从而在细胞外发明一个次生代谢物的储存单元。该法可减轻产物本身对细胞代谢的抑制造用，并可维护产物免受培育基中催化酶或酸对产物的影响，此外由于产物在固相或疏水相中的积累简化了下游处置过程,所以可大幅度降低消费本钱。.8-环糊精包衣法许多植物细胞培育根本不能改动前体物质以有机相存在的形状，而这种有机态往往导致细胞活力显著降低，很难到达增产的目的。经过在体系中参与一种叫环糊精的物质可以处理此问题。详细来说就是把环糊精作为一种包衣剂改动前体的存在形状，前体被包埋于环糊精的空腔内，环糊精分子的部分官能团那

36、么被培育体系中的初生或次生化合物经过取代反响所修饰，这种被修饰的环糊精配合体结合了非极性系统和水溶性系统的优点，比天然形状有更好的溶解性，这样参与培育体系中的前体可被最大限制的利用。.3毛状根培育技术的运用后述.4固定化培育技术该技术是将细胞固定于载体上在固定化反响器中培育的方法。普通来讲次生代谢物的含量与细胞组织的分化程度成正比,细胞聚集与分化程度越高其含量越高。固定化培育的细胞的聚集化和部分组织化为提高细胞次生代谢物的产量提供了两个条件:1固定化细胞的组织化程度越接近整体植株程度，越能以与整体植株一样的方式对环境因子的刺激起反响;2通常固定化细胞的生长速度普通低于悬浮培育细胞的生长速度，而

37、许多证听阐明，生长速度的降低与次生代谢产物产量的提高之间有相关性，固定化的植物细胞既到达组织化要求又限制了生长，因此提高了次生代谢物质的产量。.要想实现固定化培育必需满足以下先决条件:1目的产物的合成与细胞生长属于半偶联或非偶联;2细胞的生长要被抑制，即生长缓慢，防止培育体系中基质的衰变，呵斥对培育进程的破坏;3被固定的细胞应坚持耐久的生活力和生物合成才干;4目的产物能从细胞中释放出来而进入介质中。.自1979年 BRODELIUS等初次利用藻酸钙凝胶固定化培育毛地黄和长春花消费次生代谢产物以来，目前已胜利固定化了几十种植物细胞。根据载体的不同，可将固定化反响器类型分为胶粒固定化反响器和膜反响

38、器。目前最根本、最普遍采用的方法是包埋法，由于该方法操作相对简单且无毒性。即采用海藻酸钙凝胶固定细胞，除此以外，其它凝胶还有琼脂、琼脂糖、明胶、鱼叉藻聚糖、聚丙烯酰胺等，在气升式反响器、流化床反响器或填充床反响器中进展培育；膜反响器运用的支撑物有中空纤维膜和聚乙烯泡沫等。.5生物转化研讨1培育体系必需有所需求的酶系;2底物或前体等原料对培育体系没有毒性;3底物可以进入相应的细胞区室内;4新物质的合成速率一定要比它本身的新陈代谢快。利用生物体系产生的酶对外源化合物进展的酶催化反响。为了胜利实现生物转化以下先决条件必需求满足:.到目前为止，国内外有一些生物转化规模化的例子，但总体较少。如在食品领域

39、，在固定化葡萄糖异构酶的作用下规模化消费高果糖玉米糖浆；在制药行业，第一个利用生物转化技术规模化消费的物质是在被固定化的盘尼西林酰基转移酶的作用下消费盘尼西林；另外还有甲基毛地黄毒苷的 12-羟基化转化为甲基地高辛，它是在20L或 300L的细胞悬浮培育体系实现的，研讨结果显示在 20L的气升式反响器中葡萄糖含量到达8%时基质中地高辛的转化率到达 80%；此外还有桔梗细胞悬浮培育体系对斑蝥素catharidin的生物转化研讨，原先毒副作用较大的该物质被转化为无毒副作用的一对差向异构体 1-羟基斑蝥素a 和 1-羟基斑蝥素b。.6植物细胞培育技术运用前景1挑选高产细胞系;2利用基因工程手段，对次

40、生代谢中的关键酶基因进展修饰和改造，提高次生代谢物的产量;3与工程技术相结合，针对不同的培育体系，研制高效的生物反响器系统。随着这几方面研讨的不断深化，植物细胞培育这种方兴未艾的技术将在消费有价值的植物天然成分方面发扬越来越大的作用。展望未来，植物细胞培育技术要想实现真正意义的工业化，必需从以下几方面努力:.七、植物的次生代谢途径研讨进展1酚类合成代谢2萜类合成代谢3含氮化合物苯丙烷代谢途径异戊二烯代谢途径生物碱合成途径.1酚类合成代谢主要包括黄酮类、简单酚类和醌类等。黄酮类化合物是色原烷chromane或色原酮chromone的2-或3-苯基衍生物，泛指由 2个芳香环 A和 B 经过中央三碳

41、链相互衔接而成的一系列化合物，可以将黄酮类化合物分为 14种主要类型；简单酚类是含有一个被羟基取代的苯环化合物；醌类是由苯系多环烃碳氢化合物如萘、蒽等衍生的芳香二氧化合物，根据其环系统可分为苯醌、萘醌和蒽醌。1酚类合成代谢途径 2酚类合成代谢调理 .酚类化合物主要是经过苯丙基类生物合成途径合成的。苯丙烷合成途径中，苯丙氨酸经过多次酶促反响，可分别合成香豆素、木质素、芪、类黄酮和异黄酮等多酚类代谢产物。1酚类合成代谢途径.植物次生代谢物的合成途径通常是以不同类别的次生代谢物合成途径为单位即代谢频道metabolic channel的方式存在。不同代谢频道分布在植物不同的器官、组织、细胞或细胞内不

42、同的细胞器即分隔compartment内，不同代谢频道 QTL quantitative trait loci能够分布在不同的染色体上，它们受发育进程的调控，分别在植物不同发育阶段启动，也可以受不同的诱发因子作用而启动。2酚类合成代谢调理 .特定代谢频道的启动及其相关的特定次生代谢物的合成由代谢频道中的关键酶的表达来决议，而合成量那么取决于限速酶的表达情况。其中的关键酶或限速酶往往是多基因家族编码的同功酶中的特定成员，担任特定次生代谢物的合成。代谢频道内的有关酶可以多酶复合体的方式存在于细胞内的不同部位并可协同表达，代谢频道内的多个酶活性的协同提高，可显著地提高次生代谢物的产量。.苯丙烷中央代

43、谢途径、类黄酮和异黄酮合成支路均以代谢频道存在。例如，拟南芥细胞中的查尔酮合成酶CHS、查尔酮异构酶CHI、黄烷酮-3-羟化酮酶F3H和二氢黄酮醇复原酶DFR酶之间相互联络，这些酶在空间上呈现球形陈列，CHS不仅与 CHI 均与内质网膜相互联络相连，而且还与 F3H和 DFR相连，在这些多酶复合体中， F3H、肉桂酸-4-羟基化酶C4H、阿魏酰-5-羟基化酶等细胞色素 P450酶多充任细胞膜“锚 的作用，将相关的酶组装固定在内质网膜上,由它们组成代谢频道。苯丙氨酸裂解酶 PAL、肉桂酸 - 4-羟基化酶C4H、4-香豆酰-CoA-衔接酶4CL是苯丙烷类代谢途径中的关键酶，也是合成途径中的限速酶

44、，它们在植物苯丙烷次生代谢物合成途径中位于代谢支路的分叉口或位于次生代谢物合成途径的下游，担任合成酚类次生代谢物普通合成前体。.2萜类合成代谢萜类是一种广泛存在于自然界的天然产物。凡由甲羟戊二酸衍生、且分子式符合 C5H8通式的衍生物通称为萜类化合物或异戊二烯类化合物。1萜类合成途径 2萜类的代谢调理 .异戊二烯代谢途径可分别合成包括激动素、赤霉素、类萝卜素、甾醇、叶绿素等在内的单萜、倍半萜、二萜和多萜等生代谢物。1萜类合成途径 .植物异戊二烯代谢途径中也存在代谢频道。单萜合成途径并非倍半萜和二萜等高级萜类合成途径的分支，而是具有独特的酶促反响机制的单独合成途径。各种萜类次生代谢物的合成在细胞

45、内具有明显的分隔，其中倍半萜主要在细胞质内合成，而二萜和单萜那么在质体内合成。2萜类的代谢调理 .次生代谢物生物合成“代谢频道 的存在，有效地隔绝了次生代谢物合成过程的中间产物在细胞内分散，有利于底物与酶的有效结合和酶促反响的顺利进展，减少次生代谢途径中不同支路之间争夺底物的景象及有毒中间产物对细胞的损伤，并使细胞内多种类型次生代谢物的合成途径得以同时存在。其中3-羟甲基戊二酰-CoA复原酶HMGR、单萜复原酶MC、二萜环化酶DC、倍半萜环化酶SC、鲨烯合成酶是异戊二烯代谢途径中的限速酶。.3含氮化合物大多数含氮化合物是从普通氨基酸合成的，主要有生物碱、胺类、生氰苷、芥子油苷和非蛋白氨基酸等。

46、胺类通常由氨基酸脱羧或醛转氨而产生。生氰苷是一类由脱羧氨基酸构成的 O-糖甙，氰基来自于-碳和氨基。生氰苷是植物生氰过程中产生HCN的前体。生物碱是一类含氮的天然产物，现已深化研讨的有烟草的烟碱、吡咯啶生物碱、毒藜碱，毛茛科的小蘗碱，曼陀罗的茛菪碱、东茛菪碱等。1生物碱合成途径 2生物碱合成代谢调理 .植物生物碱主要有萜类吲哚生物碱、苄基异喹啉生物碱、茛菪碱和烟碱、嘌呤生物碱等，它们均有其特定的生物合成途径。1生物碱合成途径 .萜类吲哚生物碱苄基异喹啉生物碱茛菪碱和烟碱嘌呤生物碱.在植物细胞中，生物碱长春多灵生物合成过程分别在细胞质、液泡、液泡膜、内质网膜、类囊体膜等 5个以上细胞分隔区内完成

47、；苯基异喹啉生物碱的合成途径中除了小檗碱桥酶BBE外，其它主要酶均依赖于细胞色素 P450、位于内质网膜或内质网延伸膜分隔内。生物碱合成过程中的吲哚 -3-甘油磷酸酶BX1、STR、酪氨酸/多巴脱羧酶TYDC、BBE等能够是限速酶。2生物碱合成代谢调理 .八、基因工程技术提高药用植物次生物质产量研讨进展1. 用发根农杆菌诱导、培育毛状根2. 冠瘿组织的诱导与培育3. 转基因再生植物4. 反义RNA(micRNA)技术.1. 用发根农杆菌诱导、培育毛状根发根农杆菌(Agrobactirium rhizogeones)属革兰氏阴性细菌，能侵染大多数双子叶植物和少数单子叶植物及个别裸子植物。发根农杆

48、菌中的Ri质粒(root一inducing plasmid)能诱导毛状根的产生，并提高植物次生物质的产量。如缬草的毛状根培育物中缬草三醋的含量显著高于未转化的根培育物，最高可达干重的10.3%。黄芪毛状根16天内可增殖404倍。从银杏原叶体及悬浮细胞获得的转化根其药物成分分别达干重的0.065%和0.087%。.毛状根培育技术的特点1毛状根培育不需加外源激素和暗培育的情况下生长迅速、分枝多;2毛状根培次生代谢物质含量普通远高于细胞悬浮培育且含量稳定;3利用毛状根进展生物转化研讨，可以产生某些新奇的化合物，为制药提供新的试材;4毛状根易于分别且容易获得再生植株，对于获得转基因药用植物或把外源基因转到可由根再生的植株具有重要的意义;5毛状根培育消费药物类次生代谢产物同样也受营养成分、诱导子、前体和基因操作等要素的影响。.由于毛状根培育的技术优势，目前被以为是极好的获得植物次生代谢产物的原资料。同时许多过去被以为运用细胞培育技术难以合成的次生代谢物质经过毛状根技术实现了消费。近年来经过培育珍贵药用植物毛状根来获取次生代谢产