酶联免疫吸附测定法（ELISA）在抗生素残留检测中的应用(-47)

1、酶联免疫吸附测定法ELISA)在抗生素残留检测中的应用 药物残留快速检测试剂盒 实验操作指导1、酶联免疫吸附测定法ELISA简介1.1、根本概念：抗原、抗体、抗原抗体的特性1.2、ELISA方法简介：1.3、ELISA方法的原理1.4、ELISA方法的分类2、ELISA试剂的组成2.1、 ELISA试剂盒的组成、已包被抗原或抗体的固相载体免疫吸附剂，俗称酶标板；、酶标记的抗原或抗体酶标记物；、酶的底物；、参考标准品定量测定；、酶标记物及样本的稀释液；、洗涤液；、酶反响终止液。 2.2、各ELISA组成试剂的作用、固相载体、免疫吸附剂、酶标记物、酶的底物、洗涤液、反响终止液、参考标准品 3、EL

2、ISA实验过程3.1 、试剂的准备3.2 、加样3.3 、保温3.4、 洗涤3.5 、显色和比色4、ELISA试验的质量控制4.1、分析前质控、人员培训、仪器质控、标本采集及处理过程的质控4.2、分析中质控4.3、几种常用的质控方法、灰区概念、外添加回收率试验方法、确证阳性样品质控、室间质评的方法 ：发质控物进行调查 5、胶体金试纸5.1、免疫层析法简介及特点5.2、免疫层析法的结构及原理二、培训内容操作局部6、操作过程演示7、计算软件应用说明1、酶联免疫吸附测定法ELISA简介1.1、根本概念：抗原：抗原是指进入人或动物机体后，可刺激机体免疫系统发生免疫应答，从而引起动物产生抗体或形成致敏淋

3、巴细胞，并能和抗体或致敏淋巴细胞发生特异性反响的物质。抗体：是由抗原刺冲动物的免疫系统后，由免疫系统产生分泌的能和相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白。抗原抗体的根本特性：a、反响的特异性；b、反响的等比例性1.2、ELISA方法简介：ELISA属于标记免疫学技术的一种，1971年由荷兰和瑞典的学者提出，由于其操作过程简单易行并可以定量，从而使其在食品平安和卫生检测中得到了广泛的应用。目前市场上有多种基于ELISA方法开发的用于食品中抗生素检测的试剂盒产品。 返回1.3、ELISA方法的原理基于抗原抗体反响的特异性和等比例性，以96孔的聚苯乙烯塑料微孔板又称酶标板为载体，在适当的技术条件下使抗原

4、或抗体包被吸附在酶标板微孔的内壁上成为所谓的包被固相抗体或抗原，没有被吸附游离的抗原或抗体通过洗涤除去，然后直接参加酶标记抗体或抗原或先参加适当的抗体或抗原与包被抗原或抗体反响后，再参加相应的酶标记抗体或抗原，形成酶标记的抗原抗体复合物固定在微孔内，没有吸附的酶标记物洗涤去除，参加底物溶液于微孔中，复合物上的酶催化底物使其水解、氧化或复原成为有色的底物。在一定的条件下，复合物上酶的量也反映了固定化的抗原抗体复合物的量和酶产物呈现的色泽成正比，因此可以用分光光度计进行测定，从而计算出参与反响的抗原和抗体的量。这就是ELISA的原理。 返回1.4、ELISA方法的分类ELISA可以分为直接法、间接

5、法和夹心法等几种。直接法：直接法是指酶标抗原或抗体直接与包被在酶标板上的抗体或抗原结合形成酶标抗原抗体复合物，参加酶反响底物，测定产物的吸光值，计算出包被在酶标上的抗体或抗原的量。见图2-17a间接法：是将酶标记在二抗上，当抗体一抗和包被在酶标板的抗原结合形成复合后，再以酶标二抗和复合物结合，通过测定酶反响产物的颜色可以间接反响一抗和抗原的结合情况，进而计算出抗原或抗体的量。见图2-17b夹心法：是先将未标记的抗体包被在酶标板上，用于捕获抗原，在用酶标的抗体与抗原反响形成抗体-抗原-酶标抗体复合物；也可以象间接法一样应用酶标二抗和抗体-抗原-抗体复合物结合，形成抗体-抗原-抗体-酶标二抗复合物

6、，见图2-17C。前者称为直接夹心法，后者称为间接夹心法。 返回ELISA原理及分类图2-17上述三种方法又可以分为竞争法和非竞争法。由于我公司的试剂盒产品绝大局部属于直接法中的竞争法。下面对直接法中的酶标抗原竞争法作重点说明。在进行测定时首先将包被了抗体的酶标板的微孔分为测定孔和对照孔，在对照孔中参加系列标准品溶液和酶标记物；在测定孔中同时参加酶标记物和非酶标抗原通常来自于待测样品，酶标记物和样品互相竞争包被抗体的结合点，经过温浴后，没有结合到包被抗体上的酶标记物和样品经过洗涤去除。拍干后参加底物溶液，经温育后洗涤拍干，显色、终止，用酶标仪测定吸光度值。其反响原理如图2-18 返回竞争法EL

7、ISA原理图2-18如下图.在进行测定时首先将包被了抗体的酶标板的微孔分为测定孔和对照孔，在对照孔中参加浓度的系列标准品溶液和酶标记物；在测定孔中同时参加酶标记物和待检样本抗原，酶标记物和样品互相竞争包被抗体的结合点，形成酶标记的抗原抗体复合物固定在微孔内，没有吸附的酶标记物通过洗涤去除，参加底物溶液于微孔中，复合物上的酶催化底物使其水解、氧化复原成为有色的产物。当测定孔内的样本不含抗原时，固相上的抗体将和酶标记物结合参加底物后呈色较深，当样本含有抗原时，样本中的抗原和酶标记物共同竞争抗体的结合位点，酶标抗原的比例越高，结合在固相抗体上的酶标抗原就越多，酶标抗原的比例越低，结合在固相上的抗体就

8、越少，而在一定的条件下，复合物上酶的量也反映了固定化的抗原抗体复合物的量和酶产物呈现的色泽成正比，因此可以用分光光度计进行测定，从而计算出参与反响的抗原和抗体的量，从而进一步得知样本中抗原的多少。这就是竞争法ELISA的原理。測定孔EEEEE酶标记物底物溶液对照孔EEEEEEEEEEEEEEE酶标记物底物溶液參考液(不含抗原)EE樣本(含抗原)竞争法ELISA原理简述 如下图.在进行测定时首先将包被了抗体的酶标板的微孔分为测定孔和对照孔，在对照孔中参加浓度的系列标准品溶液和酶标记物；在测定孔中同时参加酶标记物和待检样本抗原，酶标记物和样品互相竞争包被抗体的结合点，形成酶标记的抗原抗体复合物固定

9、在微孔内，没有吸附的酶标记物通过洗涤去除，参加底物溶液于微孔中，复合物上的酶催化底物使其水解、氧化复原成为有色的产物。当测定孔内的样本不含抗原时，固相上的抗体将和酶标记物结合参加底物后呈色较深，当样本含有抗原时，样本中的抗原和酶标记物共同竞争抗体的结合位点，酶标抗原的比例越高，结合在固相抗体上的酶标抗原就越多，酶标抗原的比例越低，结合在固相上的抗体就越少，而在一定的条件下，复合物上酶的量也反映了固定化的抗原抗体复合物的量和酶产物呈现的色泽成正比，因此可以用分光光度计进行测定，从而计算出参与反响的抗原和抗体的量，从而进一步得知样本中抗原的多少。这就是竞争法ELISA的原理。样本浓度的计算所获得的

10、每个浓度标准溶液或样本吸光度值的平均值B 除以第一个标准O 标准的吸光度值B 。再乘以100 % ，即百分吸光度值。百分吸光度值% ) = ( B / BO ) / 100 % 公式中B 为样本溶液的平均吸光度值，B0为0PPb标准溶液的平均吸光度值。以克伦特罗浓度的半对数值为x 轴，百分吸光度值为Y 轴，绘制标准曲线图，标准曲线如图一相对应每一个样品中残留的克伦特罗的浓度可以从标准曲线上读出，在实际的计算中只需用酶标测出标准品和样品的吸光值，其他过程可通过专用的计算软件完成。 返回2、ELISA试剂的组成2.1、完整的ELISA试剂盒应包含以下各组分：1已包被抗原或抗体的固相载体免疫吸附剂，

11、俗称酶标板；2酶标记的抗原或抗体酶标记物；3酶的底物；4系列参考标准品定量测定；5酶标记物及样本的稀释液；6洗涤液；7反响终止液。 返回 2.2、ELISA试剂的作用、固相载体：固相载体在ELISA测定过程中作为吸附剂和容器，不参与化学反响。可作ELISA中载体的材料很多，最常用的是聚苯乙烯。ELISA载体的形状主要有三种：微量滴定板、小珠和小试管。以微量滴定板最为常用，专用于EILSA的产品称为ELISA板，国际上标准的微量滴定板为812的96孔式。2.2、免疫吸附剂：已包被抗原或抗体的固相载体，是ELISA方法中的核心试剂。 返回2.3、酶标记物：即酶标记的抗原或抗体，是ELISA中最关键

12、的试剂。良好的酶标记物应该是既保有酶的催化活性，也保持了抗体或抗原的免疫活性。酶标记物中酶与抗体或抗原之间有恰当的分子比例，在酶标记物中应尽量不含有或少含有游离的未结合的酶或游离的抗体或抗原。此外酶标记物还要有良好的稳定性。在ELISA中，常用的酶为辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)和碱性磷酸酶(alkaline phosohatase, AP)。 返回2.4、酶的底物、HRP的底物HRP催化过氧化物的氧化反响，最具代表性的过氧化物为H2O2，其反响式如下：DH2+ H2O2 D+ H2O上式中，DH2为供氢体，H2O2为受氢体。在ELISA中，DH2一般

13、为无色化合物，经酶作用后成为有色的产物，以便作比色测定。常用的供氢体有邻苯二胺(O-phenylenediamine,OPD)、四甲基联苯胺(3,3,5,5-tetramethylbenzidine,TMB) OPD氧化后的产物呈橙红色，用酸终止酶反响后，在492nm处有最高吸收峰，灵敏度高，比色方便，是HRP结合物最常用的底物。OPD本身难溶于水，OPD2HCL为水溶性。曾有报道OPD有致异变性，操作时应予注意。OPD见光易变质，与过氧化氢混合成底物应用液后更不稳定，须现配置现用。在试剂盒中，OPD和H2O2一般分成二组分，OPD可制成一定量的粉剂或片剂形式，片剂中含有发泡助溶剂，使用更为方

14、便。过氧化氢那么配入底物缓冲液中，有制成易保存的浓缩液，使用时用蒸馏水稀释。先进的ELISA试剂盒中那么直接配成含保护剂的工作浓度为0.02% H2O2的应用液,只需参加OPD后即可作为底物应用液。TMB经HRP作用后产物显蓝色，目视比照鲜明。TMB性质较稳定，可配成溶液试剂，只需与H2O2溶液混和即成应用液，可直接作底物使用。另外，TMB又有无致癌性等优点，因此在ELISA中应用日趋广泛。酶反响用HCL或H2SO4终止后，TMB产物由蓝色呈黄色，可在比色计中定量，最适吸收波长为450nm。AP的底物AP为磷酸酯酶，一般采用对硝基苯磷酸酯(p-nitrophenyl phosphate,p-N

15、PP)作为底物，可制成片剂，使用方便。产物为黄色的对硝基酚，在405nm波长处有吸收峰。用NaOH终止酶反响后，黄色可稳定一时间。 AP也有发荧光底物磷酸4-甲基伞酮，可用于ELISA作荧光测定，敏感度较高于用显色底物的比色法。 返回2.5、洗涤液洗涤液多为含非离子型洗涤剂的中性缓冲液。聚苯乙烯载体与蛋白质的结合是疏水性的，非离子型洗涤剂既含疏水基团，也含亲水基团，其疏水基团与蛋白质的疏水基团借疏水键结合，从而削弱蛋白质与固相载体的结合，并借助于亲水基团和水分子的结合作用，使蛋白质回复到水溶液状态，从而脱离固相载体。洗涤液中的非离子型洗涤剂一般是吐温20，其浓度可在0.05%-0.2%之间，高

16、于0.2%时，可使包被在固相上的抗原或抗体解吸附而减低试验的灵敏度。 返回2.6酶反响终止液常用的HRP反响终止液为硫酸，其浓度按加量及比色液的最终体积而异，在板式ELISA中一般采用2mol/L。2.7参考标准品定量测定的ELISA试剂盒应含有制作标准曲线用的参考标准品，应包括覆盖可检测范围的4-5个浓度，一般均配入含蛋白保护剂及防腐剂的缓冲液中。 返回3、ELISA实验过程3.1 试剂的准备按试剂盒说明书的要求准备实验中需用的试剂。ELISA实验中应用蒸馏水或去离子水，。自配的缓冲液的PH应用pH计进行较正。从冰箱中取出的试验用试剂应待温度与室温平衡后使用。试剂盒中本次试验不需用的局部应及

17、时放回冰箱保存。 返回3.2 加样在ELISA实验中一般有5次加样步聚，即加标准品、加样本、加酶标记物、加底物、加反响终止液。加样时应将所加物加在LEISA板孔的底部，防止加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。加样时一般用微量加样器，按规定的量参加板孔中。每次加标本应更换吸嘴，以免发生交叉污染。加酶结合物应用液和底物应用液时可用定量多道加液器，使加液过程迅速完成。 返回3.3 保温在ELISA中一般加标本和加酶标记物后会有一次抗原抗体反响。抗原抗体反响的完成需要有一定的温度和时间，这一保温过程称为温育(incubation)。 ELISA属固相免疫测定，抗原、抗体的结合只在固相外表上发生

18、。参加板孔中的标本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗结合的时机，只有最贴近孔壁的一层溶液中的抗原直接与抗体接触。这是一个逐步平衡的过程，因此需经扩散才能到达反响的终点。在其后参加的酶标记抗体与固相抗原的结合也同样如此。这就是为什么ELISA反响总是需要一定时间的温育。温育常采用的温度有43、37、室温和4冰箱温度等。为了便于操作目前绝大局部的试剂盒均采用室温进行温育反响，操作时的室温应严格限制在规定的范围内，标准室温温度是指20-25，但具体操作时可根据说明书的要求控制温育。室温温育时，ELISA板只要平置于操作台上即可。应注意温育的温度和时间应按规定力求准确。3.4 洗涤洗涤在ELISA过

19、程中虽不是一个反响步骤，但却也决定着实验的成败。ELSIA就是靠洗涤来到达别离游离的和结合的酶标记物的目的。通过洗涤以去除残留在板孔中没能与固相抗原或抗体结合的物质，以及在反响过程中非特异性地吸附于固相载体的干扰物质。聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的，而在洗涤时又应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。可以说在ELISA操作中，洗涤是最主要的关键技术，应引起操作者的高度重视，操作者应严格按要求洗涤，不得马虎。洗涤的方式除某些ELISA仪器配有特殊的自动洗涤仪外，手工操作主要为浸泡式，过程如下： a.吸干或甩干孔内反响液；b.用洗涤液过洗一遍将洗涤液注满板孔后，即甩去；c.浸泡，即将洗涤液

20、注满板孔，放置1-2分钟，间歇摇动，浸泡时间不可随意缩短；d.吸干孔内液体。吸干应彻底，可用水泵或真空泵抽吸，也可甩去液体后在清洁毛巾或吸水纸上拍干；e.重复操作c和d，洗涤3-4次或按说明规定。在间接法中如本底较高，可增加洗涤次数或延长浸泡时间。3.5 显色和比色、 显色显色是ELISA中的最后一步温育反响，此时酶催化无色的底物生成有色的产物。反响的温度和时间仍是影响显色的因素。在定量测定中，参加底物后的反响温度和时间应按规定力求准确。底物显色一般在室外温或37反响20-30分钟后即不再加深，约40分钟将到达显色的顶峰，再延长反响时间，可使本底值增高。底物液受光照会自行变色，显色反响应避光进

21、行，显色反响结束时参加终止液终止反响。产物用各类酸性终止液终止后会使蓝色转变成黄色，此时可用特定的波长450nm测读吸光值。3.5.2 比色比色前应先用洁净的吸水纸拭干板底附着的液体，然后将板正确放入酶标比色仪的比色架中。比色结果的表达以往通用光密度oplical density，OD，现按规定用吸光度absorbence，A，两者含义相同。通常的表示方法是，将吸收波长写于A字母的右下角，如TMB的吸收波长为450nm，表示方法为A450nm或OD450nm。3.6.3 酶标比色仪酶标比色仪简称酶标仪，通常指专用于测读ELISA结果吸光度的光度计。针对固相载体形式的不同，有特制的适用于板、珠和

22、小试管的设计。许多试剂公司配套供给酶标仪。酶标仪的主要性能指标有：测读速度、读数的准确性、重复性、精确度和可测范围、线性等等。优良的酶标仪的读数一般可精确到0.001，准确性为1%，重复性达0.5%。举例说，假设某孔测得的A值为1.083，那么该孔相对于空气的真实A值应为1.0830.011.0731.093，重复测定数次，其A值均应1.0830.051.0781.088在之间。酶标仪的可测范围视各酶标仪的性能而不同。酶标仪的检测范围一般在0.0003.000之间，甚至更高。超出可测上限的A值常以*或over或其它符号表示。酶标仪不应安置在阳光或强光照射下，操作时室温宜在1530，使用前先预热

23、仪器15-30分钟，测读结果更稳定。测读A值时，要选用产物的敏感吸收峰，用单波长进行测读。也可用双波长进行测读，即每孔先后测读两次，第一次在最适波长W1，第二次在不敏感波长W2，两次测定间不移动ELISA板的位置。例如TMB用450nm为W1，625nm为W2，最终测得的A值为两者之差W1-W2。双波长式测读可减少由容器上的划痕或指印等造成的光干扰。各种酶标仪性能有所不同，使用中应详细阅读使用说明书。 返回4.ELISA试验的质量控制4.1、分析前质控、人员培训实验人员操作的技巧及熟练程度直接影响到检验结果，因此检验人员需经过培训，熟练掌握相关的技术知识和操作要点：检验工程的根本原理 ELIS

24、A原理；熟悉检测技巧，了解实验的关键环节及操作要点；熟悉检测试剂性能包括试剂盒组成，包被片段及其组成；、仪器质控 为使仪器保持最正确工作状态应建立维护和校正仪器的标准操作程序SOP，所要控制的仪器包括移液器加样枪，水浴箱温箱，洗板机和酶标仪。移液器：ELISA加样量小5-100l，其准确性直接影响实验结果，利用称重法检查：吸取刻度指示量的水，万分之一天平称重后计算吸量是否准确，一般应在2%以内；水浴箱：经常检查水浴箱温度计所示的温度和水中或温箱内实测温度是否一致，允许有1的误差；洗板机：每个厂家设置洗板后的残留液有各自的规定一般不超过2ul ，人工扣板时，垫纸不湿，定期检查管孔是否堵塞；酶标仪

25、：经常维护其光学局部，防止滤光片霉变，定期检测校正，使其保持良好的工作性能。 、标本采集及处理过程的质控取样：保证取样有代表性，即要遵循一定的取样方法又要保证一定的取样比例如：随机多点取样、四分法等样品选取过程中需要防止产生交叉污染。如：处理不同批次的样品时应更换使用的工器具或对使用的工具进行彻底的清洗。4.2、分析中质控ELISA实验的结果受操作影响很大，每个步骤包括加样，温育，洗涤，显色，酶标仪读数均应认真负责才能充分发挥ELISA的高灵敏，强特异的优点。因此,应建立实验工程的标准操作程序(SOP)。加样加样应用微量移液器加样枪)按规定的量参加微孔板的底部防止加在孔壁上部，并注意不可溅出，

26、不可产生气泡。加样枪的枪头不要触及微孔的内壁。每次加样应更换吸嘴，做到一样一吸头，以免发生交叉污染。温育大多数的试剂盒抗原抗体反响需要在室温度下，经过一定的时间才能到达反响的平衡点ELISA边缘效应是由温育形成的。所以温育一般采用能 使反响液温度迅速到达平衡的水浴法。一种放在水浴箱的隔板上，另一种是放在温箱的湿盒里。水要浸至板条的1/3处，不可将板条叠加放置。洗涤ELISA是靠洗涤来到达别离结合与未结合抗原抗体复合物及酶标记物的目的，同时洗涤也可将非特异吸附的蛋白质的干扰以及血球、细菌中的酶干扰去除掉。手工洗涤一般采用浸泡方法：1甩去孔内反响液； 2用洗涤液过洗一遍即注满孔后即甩去； 3微孔重

27、新注满洗液后浸泡2-3分钟，间歇摇动； 4甩去孔内液体，拍板，用纸吸干。 重复以上操作至少5次。注意各种试剂盒的洗涤液尽量不要混用。洗板机洗板一定要预先把板架放平，使洗板机上的每个放液和吸液纤孔都能一致地插入孔底，将孔内液体全部吸干，同时要设置一定的浸泡时间。如出现机洗后拍板有较多残留液时应再用手工洗2次以上。关机前要用蒸溜水冲洗管道，防止堵孔。显色HRP催化底物是一步呈色反响，同样需要一定的时间和温度，一定要按照说明书规定的时间温度一般为室温C，15-20分钟。到达规定的反响时间后需要立即终止。酶标仪判读结果显色反响终止后应立刻比色一般在30分钟内有效。 常见的显色系统有OPD和TMB二种，

28、以后者最为常见，而TMB酸不易终止因此必须尽快比色以免影响结果。TMB终止后显黄色，测定波长为450nm， 参比波长为630nm。使用双波长的优点可以消除反响板条上的划痕手印的干扰。同时要注意反响孔底部应用纸吸干后才能置酶标仪中比色，否那么吸光度易出现负值或损坏滤光片。 返回4.3、几种常用的质控方法、灰区概念 把定量分析的正常值范围引入定性分析建立灰区概念，即将CO值上下的一段区域定为阳性可疑，需重复实验或换试剂重测以确定其阴阳性，如仍落在灰区范围内那么报告+阳性。灰区的设置方法为：C.O1CVCV为该试剂的批内CV (一般为510%；、外添加回收率试验方法A、什么是外添加回收率外添加回收率

29、是指向阴性样中参加一定浓度的标准溶液，使之到达某一确定浓度称为加标样，然后将其与该阴性样同时测定，进行对照试验，以观察参加的标准品的量能否认量回收，以回收率表示。B、如何添加标准品原那么上我们建议使用较高浓度的标准溶液进行外添加，下面以我公司的试剂盒为例进行说明：假设使用4.05ppb标准品进行添加，一般鱼肉的检测下限为0.1ppb，建议将鱼肉添加到0.1ppb作为回收样品进行检测。所以假设需要添加X ml 4.05ppb的标准品于1克鱼肉中，得到0.1ppb的鱼肉样本。按公式(1)计算X值1+X0.1=4.05X (1)那么X即为所添加的4.05PPb标准溶液的体积。C、如何计算回收率添加前

30、的阴性鱼肉设为样品A，添加后的鱼肉设为样品B，将A和B同时进行检测，其检测结果分别为CA、CB，按公式(2)进行计算回收率回收率=CB CA/0.1100% (2)D、外添加回收率的意义。外添加回收率的意义在于，通过外添加一定浓度的标准品，从而验证试验方法的稳定性和有效性。、用确证样品质控选取与被测样本性质接近的经过确证的样本为质控样本，在每次进行检测时将该样本同时进行检测，通过判断该样品检出值与确证值之间的变异度来判断检验结果的有效性。、室间质评的方法 ：发质控物进行调查 这是国内外室间质评的常用形式。有关管理部门或相关的行业检验协会采用定期发放质控物至各实验室，各实验室在规定的日期进行检验，并将检验结果报至部管理中心。由管理中心进行统计分析，将评价结果寄回各实验室。通过评价，各实验室了解本室工作质量，发现差距，并设法改进，以不断提高检验质量。 返回 5、胶体金