铁皮石斛茎节离体培养的研究

1、铁皮石斛茎节离体培养的研究【摘要】目的通过无菌茎段实现铁皮石斛快速繁殖。方法将铁皮石斛试管苗茎节接种于不同NAA浓度的S培养基上诱导腋芽萌发，并在含不同激素配比和有机添加物的培养基上继代和诱导生根。结果NAA0.4g/L，6-BA5g/L时铁皮石斛腋芽萌发率达93.33%；NAA0.3g/L，6-BA2g/L时丛苗的生根率达96.67%，香蕉汁和土豆汁可以显著促进丛生芽的增殖和壮苗生根。结论建立了合适铁皮石斛茎段离体培养的快速繁殖体系。【关键词】铁皮石斛无菌茎节离体培养激素浓度有机添加物Abstrat:bjetiveTdevelparapidprpagatinfDendrbiuandiduus

2、ingtheaseptindalsegentsfshts.ethdsAxenindalsegentserefirstgerinatednurashigeandSkg(S)basalediusuppleentedithdifferentnentratinNAA.Theseedlingseresubulturedandrtedntheediuntainingdifferentnentratinhrnesandrganisusbstane.Results93.33%ftheaxenindalsegentsfDendrbiuandidugerinatedntheediuithNAA0.4g/L,6-B

3、A5g/Land96.67%fexplantrtedntheediuntainingNAA0.3g/L,6-BA2g/L.Thegrthfexplantasprtedbytheextratfbananaandptat.nlusinTheinvitrprpagatinfDendrbiuandidufraxenindalsegenthasbeenestablished.Keyrds:Dendrbiuandidu；Axenindalsegents；Invitrprpagatin；nentratinfhrne；rganisusbstane石斛最早见于?山海经?，药用始载于?神农本草经?，其后，历代诸家

4、本草均予录述。在?本草纲目?中被列为上品。至今石斛仍是中医常用的滋阴清肺、生津止渴、养胃除烦之要药，其应用范围更有扩大之势。近年研究发现石斛中含有石斛多糖1、生物碱24、鼓槌菲和毛兰素5等化合物，以及7种人体必需氨基酸6和多种微量元素。现代药理说明石斛具有抗肿瘤7、抗衰老、增强免疫力8等功能，对心血管、消化系统、呼吸系统和眼科疾病均有明显的治疗作用9。铁皮石斛Dendrbiuandidu是现行版?中国药典?收载的5种常用石斛之一，是石斛类药材的上品。铁皮石斛又名黑节草、铁皮吊兰、铁皮兰，属兰科石斛属附生植物。加工后的铁皮石斛又被称为铁皮枫斗，市场价格昂贵，是一种经济价值和医用价值都很高的名贵中

5、药。然而由于近年来过度采伐、生态环境破坏等原因，铁皮石斛野生资源日渐匮竭，而其对生境要求苛刻、自然繁殖率低等因素进一步将铁皮石斛推向灭绝的边缘，如今已被列为濒危保护的中药品种10。利用铁皮石斛体外快繁是解决目前铁皮石斛资源与需求矛盾的重要途径。目前关于铁皮石斛的研究主要集中在原球茎增殖、分化等方面11,12，以茎节为材料，实现铁皮石斛体外快繁的研究尚鲜见报道。本研究拟通过无菌茎段的离体培养，建立合适铁皮石斛的快速繁殖体系。1材料与方法1.1材料选择与处理以本实验室培养保存的生长旺盛、茎节粗壮的铁皮石斛试管苗为材料，切成长度为11.5带12个腋芽的小茎段。1.2腋芽萌发将无菌茎段接种于添加30g

6、L-1蔗糖、8.0gL-1琼脂、pH为5.6的S培养基上。其中6-BA5gL-1，并参加不同浓度的NAA00.8gL-1。培养温度为25，光照强度为2000lux，光照时间为12hd-1。定期观察不同浓度生长素对铁皮石斛腋芽萌发的作用。1.3丛生芽增殖将已萌发的腋芽接种于S+30gL-1蔗糖+NAA0.4gL-1+6-BA5gL-1，并添加200gL-1的香蕉、土豆、西瓜、豆芽的增殖培养基上，并以不加天然添加物的培养基为对照，pH均为5.6，考察不同提取物对丛生芽增殖的影响。培养条件同上。1.4壮苗生根将生长强健，株高为2左右的丛生苗接种于S+30gL-1蔗糖+8.0gL-1琼脂，激素浓度分别

7、为NAA0.1，0.3，0.5gL-1和6-BA2，4gL-1或S+30gL-1蔗糖+NAA0.3gL-1+6-BA2gL-1+8.0gL-1琼脂，添加200gL-1不同提取物的生根培养基上，进展诱导生根和壮苗试验。培养条件同上。1.5统计试管苗生长状况试管苗接种培养50d后，分别观察统计芽诱导率、芽增殖数、株高、根诱导率、生根数、根长、植株强健度及褐化程度。2结果2.1不同生长素浓度对茎段腋芽的诱导作用在6-BA为5gL-1时，不同浓度的NAA诱导茎段腋芽萌发的结果如表1所示。由表1可知NAA对铁皮石斛茎段腋芽萌发的作用与其浓度有关。当参加浓度较低时，NAA可以显著促进腋芽萌发，NAA浓度为

8、0.4gL-1时，腋芽萌发率、增殖倍数到达最高，分别为93.33%和1.97，而且叶色黑绿，茎粗壮，形成大量丛生芽。而NAA浓度继续升高时，腋芽萌发率及增殖倍数均明显下降，而且由于局部材料坏死，导致实验中的总芽数减少。实验中还发现当NAA浓度过高时，局部腋芽萌发后，发生畸变，分化为花芽，并逐渐枯萎死去。结果说明低浓度的NAA可以促进铁皮石斛腋芽萌发，诱导芽的分化，植株生长强健。但NAA的浓度过高时，那么会抑制腋芽的萌发和植株生长，并促进花芽形成，更适于欣赏石斛的培养。根据实验结果，以NAA0.4，6-BA5gL-1为继代培养基，对试管苗进展继代培养，结果生长良好、植株强健、增殖倍数高到达3.2

9、倍。表1NAA对铁皮石斛腋芽萌发的影响略2.2不同提取物对芽增殖的影响不同提取物对铁皮石斛芽增殖的作用显著不同。香蕉、土豆、西瓜均能显著进步芽增殖倍数，其中参加香蕉汁最有利于铁皮石斛的芽增殖，到达4.98倍，其次是土豆，为4.90倍。香蕉汁和土豆汁不仅可以促进芽的分化，同时也有利于芽的生长，平均芽长分别到达1.30和1.39，植株非常强健。豆芽汁对芽增殖和生长没有促进作用，植株强健程度一般，不宜用于铁皮石斛培养。此外，在培养过程中空白组、香蕉组、西瓜组的培养基均出现不同程度褐化，材料根部变黑等现象，但土豆组的培养基未出现任何褐化现象。结果见表2。表2不同提取物对铁皮石斛芽增殖的影响略2.3不同

10、激素配比对铁皮石斛生根的影响将丛生苗接种于不同激素配比的生根培养基中，15d后可以观察到少数几瓶有根形成，到20d时，第2组的生根率到达58%，40d时已经到达96.67%，之后生根率不再增长。不同的激素配比诱导铁皮石斛丛生苗生根的才能明显不同。较低浓度的6-BA有利于石斛生根；而NAA在低浓度时，其促进生根的才能与浓度呈正相关，当浓度过高时0.5gL-1，其促进生根的才能减弱。当NAA0.3gL-1，6-BA2gL-1时，铁皮石斛的生根率最高，到达96.67%，此时株高、根数、根长及强健度都最好，但芽增殖倍数较低。因此以诱导生根为目的时，最适激素配比为NAA0.3gL-1，6-BA2gL-1

11、。结果见表3。表3不同激素配比对铁皮石斛生根的影响略2.4不同提取物对铁皮石斛生根的影响不同提取物在不同方面对铁皮石斛壮苗生根培养具有显著作用。香蕉汁最有利于铁皮石斛壮苗生根，无论是芽增殖倍数、株高、生根率、根数、根长，添加香蕉汁都明显优于对照组，根粗壮，整齐，叶色浓绿，茎粗节短。土豆汁可以促进丛生苗的增殖和生长，有利于获得安康粗壮的试管苗，无褐化现象，但对诱导生根具有抑制作用。而西瓜汁的作用与土豆汁相反，它可以显著进步生根率和根数，但植株弱小，茎细叶少，根部局部叶变黄枯萎，根细而短，局部失去向地性。结果见表4。表4不同提取物对铁皮石斛生根的影响略3结论与讨论本实验说明，在适宜的培养条件下，铁

12、皮石斛无菌茎段可以高效萌发。在S+NAA0.4gL-1+6-BA5gL-1培养基上培养50d后，腋芽萌发率、增殖倍数最高，分别为93.33%和1.97，植株生长强健；以该培养基进展继代培养时，其增殖倍数到达3.2倍。以茎段为材料，实现铁皮石斛快速繁殖，可以拓宽组培材料来源，加快繁殖速度，促进大规模消费遗传形状稳定的试管苗。组织培养中常用的有机添加物如香蕉汁、西瓜汁和土豆汁等是一些富含氨基酸、激素和维生素等有机物且成分较为复杂的天然复合物，它们对细胞和组织的增殖和分化有明显的促进作用13,14。本研究说明，豆芽汁对铁皮石斛丛生芽增殖没有促进作用，不合适作为铁皮石斛增殖培养的有机添加物。香蕉、西瓜

13、、土豆对丛生芽增殖均有促进作用。其中香蕉汁对丛生芽增殖、根的发生均有不同程度的促进，有利于培养壮苗。土豆汁可以显著进步芽增殖倍数，但对根的生成有抑制作用。在植物快繁中，培养基本钱是消费本钱的重要局部13，利用土豆代替香蕉可以显著降低铁皮石斛工厂化消费的本钱。西瓜汁那么可以促进根的生成，进步根的数量，但根细而短小，局部失去向地性，竖直向上生长，植株生长较弱。秦改花等15发现单独添加有机物时，香蕉汁最有利于虎头兰原球茎的增殖，而同时添加香蕉汁和土豆汁时，效果更优于香蕉汁单独使用。不同有机物搭配使用是否可以获得类似效果尚有待于进一步研究。【参考文献】1黄民权，蔡体育.铁皮石斛多糖的提取，别离和分析J

14、.中草药,1994，25(3)：128.2金融鸾，孙继军，张远名.11种石斛的总生物碱的测定J.南京药学院学报，1981，1：9.3李亚芳，张晓华，孙国明.石斛中总生物碱和多糖的含量测定J.中国药事，2002，16(7)：426.4陈晓梅，肖盛元，郭顺星.铁皮石斛与金钗石斛化学成分的比拟J.中国医学科学院学报，2022，284：524.5马国祥，徐国钧，徐珞珊，等.反相高教液相色谱法翻定18种石斛类生药中htystxene，erianin及hrystxine的含量J.中国药科大学学报，1994，25(2)：103.6黄民权，阮金月.铁皮石斛氨基酸组分分析J.中药材，1997，201：32.7王天山，陆跃鸣.鼓槌石斛种化学成分对K562肿瘤细胞生长抑制作用体外试验J.天然产物研究与开发，1997，92：1.8黄民权，蔡体育.铁皮石斛多糖对小白鼠白细胞数和淋巴细胞挪动抑制因子的影响J.天然产物研究与开发，1996，8(3):39.9林萍，毕志明，徐红，等.石斛属植物药理活性研究进展J.中草药，2022，3411：附19.10淳泽.药用石斛的资源危机与保护对策J.资源开发与市场，2022，212：139.11唐凤，丁小余，丁鸽，等.锗对铁皮石斛原球茎的生长及抗氧化酶系的影响J.南京师大学报自然科学版，2022，284