《基因工程》课件第六章（3）动物基因工程

1、第八章 哺乳动物基因工程Green fluorescent mouse高等哺乳动物基因工程高等哺乳动物细胞基因表达技术高等哺乳动物转基因技术转基因动物个体动物工程细胞哺乳动物遗传性状改良药物筛选研究评价模型人体基因治疗蛋白多肽物质大规模生产药物筛选研究评价模型研究哺乳动物基因功能的基础： 第一，必须能通过克隆分离出基因。； 第二，必须能在试管里操作基因序列； 第三，必须能够将改变过的基因重新送入细胞里以确定它是如何发挥功能的。其中第三方面以多种形式形成阻止人们前进的障碍。第一节 哺乳动物基因转移的遗传选择标记常用的选择基因有： 胸苷激酶基因（tk）、二氢叶酸还原酶基因(dhfr)、氯霉素乙酰转

2、移酶基因(cat)、细菌的黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶基因(Eco-gpt)、细菌的新霉素磷酸转移酶基因(Eco-neo)等。嘌呤嘧啶的生物合成二氢叶酸还原酶腺嘌呤磷酸核糖基转移酶次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸转移酶黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸转移酶次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸转移酶二氢叶酸还原酶胸苷激酶 互补选择的分子基础： 适当的使用这些抑制物，我们可以选择性的控制某一个合成途径。这就是说，当细胞的一种代谢途径发生缺陷时，可以从另一种代谢途径得到补偿，从而能继续存活，因此容易得到突变体；但是，另一种代谢途径也被一种特殊的药物所阻断时除非导入野生型基因取代突变的基因，否则细胞就会死亡。 另一方面，有一些对抑制补救合成

3、途径的药物呈抗性的基因，在没有补救前体合成的情况下，也可以用作显性选择标记。选择原理： tk(thymidine kinase)基因及hprt基因的筛选：受体细胞必须是相应的tk-或hprt-，将细胞培养在含HAT（H：hypoxanthine黄嘌呤，A：aminopterin氨甲喋呤，T：thiymidine胸苷）的培养基中。在A存在下，核苷酸的从头合成途径被阻断，不能合成AMP、TMP及GMP。这三中核苷酸的合成只能有补偿途径合成，必须具有tk或hprt基因的存在细胞才可生长。 5-磷酸核糖-1-焦磷酸（PRPP）次黄嘌呤核苷一磷酸（HMP）次黄嘌呤核苷（HR）GMPAMP嘌呤核苷酸生物合

4、成途径次黄嘌呤磷酸核糖转移酶（HPRT）氨甲喋呤（AP）氨甲喋呤（AP）从头合成途径补救合成途径尿嘧啶核苷一磷酸（UMP）胸腺嘧啶核苷一磷酸（TMP）胸腺嘧啶核苷（TR）嘧啶核苷酸生物合成途径（TK）胸腺嘧啶核苷激酶 dhfr（dihydrofolate reductase，二氢叶酸还原酶）基因的筛选：受体细胞必须是dhfr- ，将细胞培养在含HT的培养基中。 真核细胞核苷酸的合成需要四氢叶酸提供甲基。 7,8二氢叶酸+NADPH+H+ 5,6,7,8四氢叶酸+NADP+ DHFR氨甲喋呤抑制哺乳动物受体细胞常见的遗传选择标记遗传标记编码产物筛选药物作用机理APH- 氨基糖苷磷酸转移酶 G41

5、8 APH灭活G418DHFR 二氢叶酸还原酶 氨甲喋呤 DHFR变体抗氨甲喋呤 HPH- 潮霉素B磷酸转移酶潮霉素B HPH灭活潮霉素B TK- 胸腺嘧啶核苷激酶氨基喋呤 TK合成TMPXGPRT- 黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 霉酚酸 XGPRT合成GMPADA- 腺嘌呤核苷脱氨酶 腺嘌呤木酮糖苷 ADA灭活Xyl-A 第二节 哺乳动物的载体系统一、 SV40病毒载体二、反转录病毒载体三、其他的病毒载体 目前使用的哺乳动物基因载体大多由哺乳动物病毒经改造而成。用得比较多的病毒有猴空泡病毒（SV40）、单纯疱疹病毒（HSV）、Rous肉瘤病毒、EB病毒等。 在哺乳动物细胞内表达的载体必须考虑以

6、下几个表达元件： 启动子与增强子 终止信号与加尾信号 剪接识别信号 复制与选择元件1、SV40的生物学特性 SV40属于乳多瘤病毒科多瘤病毒属，呈小型二十面体，由VP1、 VP2、VP3三种衣壳蛋白包装而成，基因组为5224bp的双链环状DNA. SV40可以与所有哺乳动物宿主细胞中的组蛋白H2、H3、H4结合，从而使其DNA形成类似核小体的微型染色体结构。 SV40感染猴细胞时呈裂解型，不致癌；但感染啮齿类动物后，便发生非同源整合而致癌。SV40 DNAoriVP2TVP3VP1t一、 SV40病毒载体 t / T基因编码病毒的小抗原和大抗原与病毒的致癌作用密切相关。SV40在裂解宿主细胞前

7、的晚期状态时，每个宿主细胞含有105个病毒DNA拷贝，因此十分适合用于高效表达外源蛋白。早期表达： 两个6聚体的T抗原结合在SV40 DNA的复制起始点上，分别向相反方向移动，将双链DNA解螺旋。 随后单链DNA结合蛋白（ssB）与解开的单链DNA结合维持解旋状态。2、SV40基因组的改造 晚期表达: 在DNA复制一段时间后表达，产物是VP1、VP2和VP3三种外壳蛋白。 SV40有严格的包装限制。如果插入的外源基因过大，就无法包装。 去掉T抗原基因的病毒，保留晚期复制启动子。不能复制，但能包装。提供外壳蛋白。 去掉VP基因，插入外源基因的病毒，保留早期表达启动子。不能包装，但能复制。3、SV

8、40（猿猴空泡病毒）病毒载体： 两种类型： 1. 取代型的重组病毒载体： 外源基因直接插入在缺陷的病毒基因组上，由于插入的外源片断，在大小上被取代的病毒基因组区段是等同的，因此形成的重组体DNA能够在哺乳动物的受纳细胞中增值，并被包装成病毒颗粒。但为补充这段被取代的病毒基因组DNA的功能必须使用一种与之互补的辅助病毒。 感染细胞，整合提供VP外壳蛋白提供T抗原包装成的病毒颗粒中，既有含外源基因的重组型，又有助手型DNA。COS细胞 用复制起点有缺陷的SV40病毒侵染的猴细胞株CV-1得到的。所以称COS（CV-1，Origin, SV40）。 有SV40的T抗原，有利于SV40来源的载体复制。

9、 病毒不能复制，但能产生T抗原（类似重组型SV40）。DNA整合到猴染色体上。所以COS细胞中只有T抗原，无游离的SV40 DNA。 病毒基因组部分只留下维持哺乳动物细胞中进行复制所必须的有关序列，但它融合了一个细菌质粒，因而还能够在大肠杆菌细胞中进行复制和增值。这种重组体分子没有被包装成病毒颗粒不会出现裂解感染的情况，它实际上是一种类似于质粒的DNA分子载体。2. 重组的病毒-质粒载体 重组的SV40 DNA分子必须经过包装后才具有感染能力，因此插入的外源DNA片段不能太大。为了尽量提高SV40的装载量，必须删除一些基因片段，因此重组的SV40分子必须与野生型病毒共感染受体细胞，才能形成有感

10、染力的重组病毒颗粒。 保留SV40的复制起始区（ori）、早期区域（T抗原）的启动子、Poly A化位置以及t抗原的内含子。 如pSV2:b区：324-3369bp，pBR322的复制起始区、氨苄青霉素抗性基因。 c区：3370-4217bp，t抗原内含子（拼接信号）、 Poly A化位置。 d区：外源基因插入位置。a区: 1-323bp，SV40的复制起始区、T抗原启动子、转录起始区。不需要包装，可插入10kb以上的外源基因。 既能在大肠杆菌中增殖，又能转染哺乳动物细胞。 受感染的动物细胞不会裂解，能建立稳定的细胞株。pSV2的特点不能在猴细胞中复制（没有T抗原）。 在哺乳动物中存在的途径是

11、整合到染色体上。 pV2-GPT是一种SV40 DNA与大肠杆菌质粒DNA杂合的载体，其中gpt为细菌来源的谷氨酸-丙氨酸转氨酶基因，用于筛选重组子。该载体曾被成功地用于在猴肾细胞中表达有生物活性的兔-珠蛋白。Aproriviral genegptSV40 oripV2-GPTpBR322pBR322SV40 4218bp利用SV40 DNA载体表达外源基因的程序SV40 载体病毒晚期基因启动子筛选标记ori缺陷的SV40 辅助病毒去除细菌序列插入外源基因重组分子分离病毒DNA转化筛选增殖感染pcDNA3.1CATCAT：Chloramphenicol Acetyl Transferase（氯

12、霉素乙酰转移酶;用于分析表达量）二、反转录病毒载体 反转录病毒是单链RNA病毒，它侵染细胞后可通过自身的反转录酶以RNA为模板在寄主细胞染色体中反转录成DNA。1、反转录病毒(retroviruses) 反转录病毒是一类含单链RNA的动物病毒。它的基因组含有2条相同的正链RNA分子，包装成二倍体病毒颗粒。除此之外，在其病毒颗粒内部还包含有tRNA引物分子、反转录酶、RNaseH和整合酶等组分。 反转录病毒的生命周期 迄今已经在鸟类及哺乳类动物中发现了许多种反转录病毒，例如鸟类的脾坏死病毒(SNV)、鼠类的乳腺肿瘤病毒(MMTV)，莫洛尼氏小鼠白血病病毒(Moloney murine leuke

13、mia virus，MoMLV)等等，但其中研究得最为详尽的则是劳斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus，RSV)。RSV病毒感染了鸡之后，就会诱发产生肿瘤。从感染细胞中分离出来的反转录病毒的DNA，是一种有用的动物细胞的基因载体。 反转录病毒具有许多优点，便于发展作为动物基因克隆载体：第一，在大多数情况下，反转录病毒的肿瘤基因(oncogene，onc)都能够在正常的细胞中转录。第二，反转录病毒的寄主范围相当广泛，包括无脊椎动物和脊椎动物。第三，反转录病毒具有强启动子，克隆此类载体上的外源基因有可能得到有效的表达。第四，反转录病毒不但感染效率高，而且通常还不会招致寄主细胞的死亡，被

14、它感染的或转化的动物细胞能够持续许多世代，保持正常生长和形成感染性病毒颗粒的能力。2、反转录病毒载体 病毒复制所需要的RNA(DNA)序列可以严格地区分为顺式元件和反式元件两类，且这两类可以分开。这一特点便于将它改造成不能自我复制的重组病毒，用作基因转移载体。 基因组的中心部分是病毒基因组的反式元件由gal、pol和env三个病毒基因的编码序列组成。反式元件的两翼是它的顺式元件研制反转录病毒载体的基本原则：去掉反式序列而保留所有的顺式序列，这样的载体具有反转录病毒基因组的全部功能，但不能包装蛋白质，其自身不能成为侵染细胞的病毒粒子。同时，把病毒RNA的包装信号去掉，转入适当细胞系后制成受体细胞

15、。受体细胞（如PA317细胞）具备野生病毒的全部功能，但不能将病毒RNA包装到膜蛋白中。 反转录病毒质粒载体 利用DNA体外重组技术，将克隆在大肠杆菌pBR322质粒载体的原病毒DNA，移去gag、pol和env等3个基因的大部或全部序列，保留下5-LTR、3-LTR序列以及PBS-ve、PBS+ve和包装位点psi。然后将一种作为选择标记的外源基因，例如neo、gpt、dhfr或hprt等插入其中，构成重组的反转录病毒质粒载体。在选择标记基因插入时，要使它的起始密码子ATG恰好是安放在病毒gag基因的原来位置上。这样，插入的选择标记基因才会在5-LTR指导下转录，并且也才会从正确的ATG密码

16、子启动转译。反转录病毒的基因组能够承载数个外源基因，最大的插入片段可达6kb左右，这样重组的反转录病毒仍能正常地增殖。而如果在包装之前能通过剪辑作用使基因组长度缩短，那么插入的外源DNA则可增加到20kb。由此可见，反转录病毒基因组具有相当大的克隆能力。现在已经发展出许多种反转录病毒的表达载体。反转录病毒表达载体- 插入在反转录病毒表达载体上非选择的外源基因，是利用自己的启动子进行表达的，因此文献中有时也称这种载体为内部启动子载体(internal promoter vector)。另外一种表达载体，则是利用反转录病毒LTR启动子表达外源基因的，由于在这种载体中同时插入两个外源克隆基因，所以有

17、时也称之为双基因表达载体(dual expression vector)，简称DE载体。1、痘苗病毒载体 痘苗病毒(Vaccinia virus)具有双链DNA 基因组，同天花的病原体大花病毒（Variolavirus)的亲缘关系十分密切。当人们接种了痘苗病毒之后，便可获得对天花的高度免疫性。在DNA重组技术发展之后不久，就有人将外源DNA片段插入到痘苗病毒的基因组中，得到了具有生物活性的重组病毒。根据这一发现，基因工程学家便设想构建能够表达多种病原体抗原的重组痘苗病毒，作为预防这些病原体感染的活疫苗。三、其他的病毒载体2、乳头瘤病毒载体 乳头瘤病毒(Papilloma viruses)能够感

18、染包括人类在内的多种脊椎动物，产生上皮肿瘤。但是只有完全分化的扁平的上皮细胞(epitelial cell)，才能产生感染性的乳头瘤病毒，迄今为止还没有办法在培养的细胞中增殖这种病毒。 然而有几种乳头瘤病毒的DNA能够转化培养的细胞，而且在转化的细胞内，病毒的基因组仍然保持游离的多拷贝的状态、每个分离后的细胞可达50200份。利用乳头瘤病毒基同组这种非整合的特性，克隆在它上面的外源基因的复制与表达，则可免受染色体的控制，而得到大量的扩增，同时又不会导致寄主细胞的裂解死亡。从这点考虑，乳头瘤病毒载体比上面所讨论的整合性载体具有突出的优点，因而在近年很受人们的关注。 感染了牛乳头瘤病毒的转化细胞，

19、丧失了接触抑制特性，在细胞长满之后仍可维持分裂生长。于是便会在未转化的死亡的单层细胞背景上，形成一堆肉眼能够辨认的或是在显微镜下可以观察到的多层的细胞群，即所谓的转化灶(focus)。因此，我们可以依据此种形态学特征上的变化检测被BPV转化的细胞。 一种典型的简单的牛乳头瘤病毒载体，是由pBR322质粒载体和BPV-69T片段重组构成。 单层培养细胞一般具有“接触抑制”特性（当细胞长满整个平皿之后，通常就不再分裂生长，此时继续培养就会导致细胞的死亡）。简单的载体穿梭载体实验的过程中偶然地发现，将人-珠蛋白基囚插入到BPV-pBR322重组体结构上，可以刺激其转化效率提高大约500倍。这种刺激效

20、应，显然是由于人-珠蛋白基因的DNA片段所致。 根据这一发现，构建了一种既能在大肠杆菌细胞中又能在哺乳动物细胞中复制的BPVI穿梭载体pBPV-BV1。这种载体在每个细胞中的拷贝数可保持在1030份之间。转化到大肠杆菌细胞之后，可以迅速回收到载体DNA。利用这个载体克隆人-干扰素，在许多细胞系中都获得了大体相等水平的表达。3、腺病毒 (Adenoviruses)载体 腺病毒是一群无囊膜的20面体的病毒，所含的双链DNA的分子大小约为36kb。腺病毒具有很大的潜力，可发展为真核基因的表达体系。这首先是因为可插入较大的外源DNA片段，而且还可以在寄主细胞中大量地增殖。其次，能最大限度地合成病毒编码

21、的蛋白质。 腺病毒的基因组线性DNA长约35kb，其突出特点是带有反向的末端重复序列，而且在每一条单链的5-末端还共价地连接着一种分子量为5.5103dal的蛋白质分子。腺病毒DNA末端结构的另一个特点是，当它从病毒颗粒中分离出来之时，便会自发地环化起来，尔后许多环形分子又聚合成多聚体。腺病毒载体的构建由于在腺病毒的两段反向末端重复序列中，只要有一段是完整的，另一段的缺失也就能够得到恢复。因此，可以利用靠近5-末端的E1早期基因区克隆外源基因。如果通过这种办法将外源基因插入在E1早期基因区，也就必须提供辅助功能才能完成感染周期。现在通常是用能表达E1功能的人细胞系(293细胞)提供这种辅助功能

22、的。 腺病毒感染人细胞时呈裂解型，不致癌；但对啮(nie)齿目动物来说，绝大多数的腺病毒成员均能致癌。 目前，复制缺陷性的重组腺病毒是在基因治疗临床试验领域中比较常用的病毒载体。第三节 转基因导入细胞内的方法一、物理方法二、化学方法三、生物方法一、物理方法 利用物理方法转化高等哺乳动物细胞的主要优点是外源基因表达盒中不含任何病毒基因序列，这对外源基因表达产物的分离纯化减轻了负担。但外源基因表达盒进入受体细胞后，往往以多拷贝的形式随机整合在染色体DNA上，导致受体细胞基因灭活、外源基因不表达。1、裸露DNA直接注射适合于基因表达技术2、电穿孔（Electroporation）3、显微注射 （1）

23、裸露DNA直接注射适合于基因表达技术 肌肉注射、肝脏、甲状腺、心肌、脑、泌尿器官组织间隙、肿瘤内注射。虽然转染的裸DNA分子通常并不整合于染色体，但目的基因的表达也可以持续几个月，但效率不高。 电穿孔通过将细胞暴露在短暂的高场强电脉冲中转导分子。将细胞悬浮液置于电场中会诱导沿细胞膜的电压差异，据认为这种电压差异会导致细胞膜暂时穿孔。电脉冲和场强的优化对于成功的转染非常重要，因为过高的场强和过长的电脉冲时间会不可逆地伤害细胞膜而裂解细胞。一般，成功的电穿孔过程都伴随高水平（50%或更高）的毒性。（2）电穿孔 （Electroporation）（3）显微注射 显微注射是借助显微操作仪，将外源DNA

24、分子导入受精卵的雄原核内，通过DNA在复制或修复过程中造成的缺口，把外源DNA整合到胚胎基因组中。然后再将受精卵植入假孕的动物体内，使其生长发育。出生的子代作DNA检测筛选出转入基因整合和表达的子代。它是哺乳动物最常见的转基因方法，效果稳定，导人时不受DNA分子量的限制。但是，这种方法操作复杂，转基因效率低。显微注射显微操作仪器Production of Transgenic Mice by Microinjection（1）磷酸钙沉淀受二价金属离子能促进细菌吸收外源DNA的启发 将氯化钙，DNA和磷酸缓冲液混合，沉淀形成包含DNA且极小的不溶的磷酸钙颗粒。磷酸钙-DNA复合物粘附到细胞膜并通

25、过胞饮进入目的细胞的细胞质。沉淀物的大小和质量对于磷酸钙转染的成功至关重要。在实验中使用的每种试剂都必须小心校准，保证质量，因为甚至偏离最优条件十分之一个pH都会导致磷酸钙转染的失败。 利用磷酸钙共沉淀法转化肿瘤病毒DNA，可使正常细胞转化为癌细胞，这是人们对肿瘤发生机制的最早理解。二、化学方法（2）DEAE-葡聚糖 带正电的（二乙基乙醇胺 ）DEAE-葡聚糖或和带负电的DNA分子使得DNA可以结合在细胞表面。通过使用DMSO或甘油获得的渗透休克将DNA复合体导入。两种试剂都已成功用于转染。DEAE-葡聚糖仅限于瞬时转染。 （3）脂质体介导法 将待转化的DNA溶解与天然或人工合成的磷脂混合，后

26、者在表面活性剂的存在下形成包埋水相DNA的脂质体结构。将这种脂质体悬浮液加入到细胞培养液中，便会与受体细胞膜融合，DNA随即进入胞质和核内。利用上述程序曾将外源基因成功地导入了小鼠的淋巴细胞和HeLa细胞。 以阳离子脂质体居多，目前已推出脂质体试剂，如Lipofection、SA、DOGS、DOTMA等商业化脂质体。阳离子脂质体试剂 在优化条件下将阳离子脂质体试剂加入水中时，其可以形成微小的单层脂质体。这些脂质体带正电，带负电的DNA自动结合到带正电的脂质体上，形成DNA-阳离子脂质体复合物。 细菌质粒和噬菌体载体只能将目的基因运载至细菌中扩增和表达。动物病毒载体是较理想的真核基因工程载体。

27、病毒DNA序列中有很强的启动子，可使其后方的外源基因高产量和高频率地表达。常用的有杆状病毒载体、SV40载体、痘苗病毒载体、逆转录病毒载体等。 以病毒DNA为载体可以将外源基因直接转染或与野生型病毒颗粒共转染特定的受体细胞。这种方法具有定向性好、实验重复性佳、导入效率高等优点，但也存在一定的缺陷，如目前常用的载体宿主范围有限，往往无法转染一些具有重要经济价值的家禽和牲畜细胞等。三、生物学方法动物病毒转染法 动物发育过程中分化了的细胞不能再产生完整的充分分化的个体。早在30 年代，著名的胚胎学家 Spemann 就已经提出“分化了的细胞核移入卵子中能否指导胚胎发育”这样的设想。用两栖类动物进行的

28、一些克隆实验表明，早期胚胎细胞核经移植可产生成熟的动物个体，而从蝌蚪及成体动物细胞中取出的细胞核经移植生成的克隆动物最晚只能发育至蝌蚪期。胚胎分割及胚胎细胞核移植克隆动物已在许多物种中获得了成功。体细胞克隆绵羊、小鼠、牛及山羊的成功，证明高度分化的细胞核仍具有全能性。第四节 转基因动物 转基因动物是指以实验方法导入外源基因，在染色体组内稳定整合并能遗传给后代的一类动物。 自1981年，第一次成功地将外源基因导入动物胚胎，创立了转基因的动物技术。1982年获得转基因小鼠。转入大鼠的生长激素基因，使小鼠体重为正常个体的二倍，因而被称为超级小鼠。以后相继在10年间报道过转基因兔、绵羊、猪、鱼、昆虫、

29、牛、鸡、山羊、大鼠等转基因动物的成功。Somatic nuclear transfer 乳腺反应器转基因动物的研究历史： 1974年，美国学者Jaenisch首次应用显微镜注射法获得转基因小鼠。 1981年，美国科学家成功地将外源基因导入动物胚胎，创立了转基因动物技术。 1982年获得转基因小鼠。 1987年，世界上第一只商业化转基因绵羊在英国著名的罗斯林研究所诞生。这只转基因母羊的乳汁中可以分泌抗胰蛋白酶，含量高达30毫克/升。 1997年2月，英国罗斯林研究所维尔穆特博士科研组公布体细胞克隆羊“多利”培育成功。 1999年2月，上海遗传研究所宣布转基因试管牛“滔滔”诞生，其体内被检测到带有

30、人的血清白蛋白基因，这项成果被评为当年“中国十大科技进展”之一。 1999年，意大利学者用精子作为载体转移目的基因，成功地获得了纯系转基因小鼠。 一、转基因技术的应用 1.基因功能分析 基因打靶（gene targeting） 2.基因表达调控研究 绿色荧光蛋白基因（GFP） 3.转基因育种 快速生长转基因鱼gene targeting 分子基础 20世纪80年代后期发展的基因打靶技术，通过转染细胞中发生的外源打靶基因与核基因目标基因之间的DNA重组，能够使外源基因定点地整合到核基因组的特定位置上，从而达到改变细胞遗传特性的目的。 两条具有同样或类似核苷酸序列的同源DNA分子之间发生的遗传信息的重组事件。（外源打靶基因与内源核基因组之间，必须存在一段适当长度的同源的DNA序列） 基本步骤：首先是将要整合到受体细胞核基因目标座位的外源靶基因，以及位于打靶基因两侧与内源目标基因同源的DNA片段，克隆在具有选择标记基因的载体分子上，构成专用的基因打靶载体；选用适当的核酸内切酶切割基因打靶载体，使之线性化后再用来转化受体细胞