《基因工程概论》课件chapt3

1、基因工程概论第一章 导 论第二章 基因操作的工具酶第三章 基因克隆的载体第四章 基因克隆的策略第五章 克隆基因的表达第六章 基因工程的基本技术第三章 基因克隆的载体引 言（introduction）第一节 质粒载体（plasimid vectors）第二节 噬菌体载体（phage vectors）第三节 柯斯质粒载体（cosmid vectors） 第四节 人工染色体载体（B/Y/HAC）引 言基因克隆的本质是使目的基因在特定的条件下得到扩增和富集，而目的基因本身在体外无法进行复制，必须借助于“载体”及其“寄主细胞”来实现。作为基因克隆的载体必须具备以下特性：能在寄主细胞中进行独立的复制和表达

2、；具有1-2个选择标记基因，如对抗生素的抗性基因等；具备多克隆位点（MCS），而且可携带外源DNA片段的长度范围较宽。自身分子量较小，在寄主细胞中的拷贝数高，易于操作和DNA的制备。Characteristics of vectors for gene cloningMCSMarkerForeign gene第三章 基因克隆的载体引 言（introduction）第一节 质粒载体（plasmid vectors）第二节 噬菌体载体（phage vectors）第三节 柯斯质粒载体（cosmid vectors） 第四节 人工染色体载体（B/Y/HAC）第一节 质粒载体（plasmid vect

3、ors）1、质粒载体的生物学特性2、质粒载体相关知识介绍1.质粒载体的生物学特性（1）质粒是一种广泛存在于细菌细胞中染色体以 外的能自主的复制的裸露的环状双链DNA分子，比病毒更简单。在霉菌、蓝藻、酵母和一些动植物细胞中也发现了质粒，目前对细菌的质粒研究得比较深入，特别是大肠杆菌的质粒。1.质粒载体的生物学特性（2）质粒的大小差异很大，最小的只有1kb,只能 编码中等大小的2-3种蛋白质分子，最大的达到 200kb。（3）质粒的生存在寄主细胞中“友好”地“借居”，离开了寄主它本身无法复制，它可以赋予寄主一些非染色体控制的遗传性状，以利于寄主的生存。比如，对抗菌素的抗性，对重金属的抗性等。1.质

4、粒载体的生物学特性（4）质粒的复制类型一种质粒在宿主细胞中存在的数目称为该质粒的拷贝数。据拷贝数将质粒分为两种复制型：“严紧型”质粒（stringent plasmid）,拷贝数为1-3；“松弛型”质粒（relaxed plasmid）,拷贝数为10-60。不过，即使是同一质粒，其拷贝数在不同的寄主细胞间也可能有很大的变化。（5）质粒的不亲和性两种亲缘关系密切的不同质粒不能在同一宿主细胞中稳定共存，属于同一个不亲和群，如pMB1或ColE1的派生质粒。已鉴别出25个以上大肠杆菌质粒的不亲和群，它们之间是相容的。1.质粒载体的生物学特性（6）质粒的存在形式 有超螺旋、开环双螺旋和线状双螺旋三种。

5、在琼脂糖凝胶电泳中，不同构型的同一种质粒DNA，尽管分子量相同，仍具有不同的电泳迁移率。其中走在最前面的是SC DNA，其后依次是L DNA和OC DNA。双螺旋共价闭合环（超螺旋SC构型）开环双螺旋（一个裂口， OC构型）线状双螺旋（两个裂口，L构型）第一节 质粒载体（plasimid vectors）1、质粒载体的生物学特性2、质粒载体相关知识介绍质粒：是一种裸露的双链闭环DNA分子，它们在寄主细胞中能够独立地自我复制从而得到不断的繁殖。作为基因工程载体，质粒至少应该具备复制的起始区、选择标记基因区、多克隆位点等部分。多克隆位点：克隆载体中的一段用于插入外源DNA片段的特定区域，由一系列的

6、紧密相连的限制性内切酶位点组成，而且每个限制性内切酶位点应该在整个载体中是唯一的。选择标记基因：在基因工程中的一类用于选择转化细胞（菌）的抗性基因，通常是一些抗生素抗性基因，比如对氨苄青霉素、四环素、氯霉素、卡那霉素以及潮霉素等具有抗性的基因。这样，通过在培养基中加入特定的抗生素就可以选择得到转化的细胞（菌）。（1） -互补 (alpha-complementation) 大肠杆菌-半乳糖苷酶 可以和其底物X-Gal 相互作用并且释放出一种蓝色物质，当该酶的-片段和-片段分开时就失去了这种显色的功能。通常将编码该酶-片段的LacZ 基因插入到载体的多克隆位点的侧翼序列中，而在一些人工构建的大肠

7、杆菌株系中却只能编码产生该酶的片段。这样一来，含有功能性完整的LacZ 基因的载体导入到这类寄主细胞中时，载体编码的 -片段就能和寄主编码的片段发生互补并具有了对底物X-gal的作用功能（发生显色反应），这种现象被称为是 alpha-complementation.2. 质粒载体相关知识介绍 所以含有这类载体的菌落就很容易在含有底物X-Gal和诱导物IPTG的平板上分辨出来。因为这类菌落中释放出的蓝色物质可以将整个菌落染成蓝色，非常容易辨别。2. 质粒载体相关知识介绍（2）pBR322 研究最广泛，使用最早的质粒之一。 大小为4363 bp ，带有两个抗性基因（氨苄青霉素和四环素）。 带有下列

8、限制酶切位点。 pBR322 generally does not give such a high yield of plasmid DNA as modern vectors such as pUC, pGEM and pBluescript2. 质粒载体相关知识介绍pBR3224363bp连接加反应液2. 质粒载体相关知识介绍（3）pUC是在pBR322基础上发展起来的克隆载体。大小为2.7 kb，带有复制起始位点，ampicillin 抗性基因和lacZ 基因。2. 质粒载体相关知识介绍（4）pGEM-3Z 带有 LacZ 基因，大小为2.9 kb ，氨苄青霉素抗性基因，高拷贝。在多克

9、隆位点侧翼带有两个启动子SP6 和T7. 2. 质粒载体相关知识介绍（5）pBluescript SK pBluescript SK 同 pGEM 类似，另外还带有线状噬菌体f1 的复制起始位点。 可以产生单链DNA。如果寄主细胞带有质粒，f1噬菌体可以感染产生包含有质粒DNA的噬菌体。2. 质粒载体相关知识介绍（6）pET pET 载体可以产生蛋白质。 在EcoRI 和 BamHI酶切位点前面， pET-5 有一个可以编码产生11个氨基酸组成的蛋白质的区域。在这个位点插入DNA可以产生融合蛋白。使用NdeI 酶切不能产生融合蛋白。2. 质粒载体相关知识介绍第三章 基因克隆的载体引 言（int

10、roduction）第一节 质粒载体（plasimid vectors）第二节 噬菌体载体（phage vectors）第三节 柯斯质粒载体（cosmid vectors） 第四节 人工染色体载体（B/Y/HAC）第二节 噬菌体载体（phage vectors）1、噬菌体的生物学特性2、 噬菌体载体3、M13噬菌体的生物学特性4、M13噬菌体载体1. 噬菌体的生物学特性 噬菌体由正二十面体的蛋白质头部和中空管状的蛋白质尾部组成。头部包含线状染色体DNA，侵染寄主时将自己的DNA注入寄主细菌。 噬菌体属温和噬菌体。1. 噬菌体的生物学特性 噬菌体的生长周期可分为溶菌周期和溶源周期两种类型。前者指

11、噬菌体将DNA注入寄主细胞后很快环化，然后进行自我复制、蛋白衣壳合成和新噬菌体颗粒的组装，最后使寄主细胞破裂而释放出大量的子代噬菌体。在溶源周期中，注入寄主细胞的噬菌体DNA是整合到寄主细胞染色体上并可以随着寄主细胞的分裂而进行复制。只有溶菌生长周期的噬菌体被称为烈性噬菌体 。只有溶源周期的噬菌体被称为温和噬菌体（temperate phage ） 。整合了一套完整的噬菌体基因组的细菌被称为溶源性细菌（lysogen ） 。在溶源性细菌内存在的整合或非整合的噬菌体DNA被称为原噬菌体（prophage ）。 1. 噬菌体的生物学特性 DNA为线状双链DNA分子，长度为48502bp，在分子两端

12、各有12个碱基的单链互补粘性末端。当其注入到寄主细胞中后，可以迅速通过这两个粘性末端的互补作用形成双链的环形DNA分子。上述通过粘性末端互补形成的双链区被称为cos位点（cohesive end site）. DNA至少包括61个基因，其中一部分为噬菌体生命活动的必须基因，另一部分可以被外源基因取代而不会影响到噬菌体的正常功能。第二节 噬菌体载体（phage vectors）1、噬菌体的生物学特性2、 噬菌体载体3、M13噬菌体的生物学特性4、M13噬菌体载体2. 噬菌体载体（1）Insertion vectors 插入型载体能插入10 kb左右的DNA片段， Lambda phage 不能包

13、装超过本身长度(48kb)的105 %。 所以插入型载体中不必要的基因要去掉。 选择重组噬菌体的方法是使用cI基因插入失活， cI基因的表达可以促进噬菌体进入溶源状态, cI产物受影响会促进噬菌体进入裂解循环。 cI+ 噬菌体在大肠杆菌的寄主菌中产生模糊的噬菌斑， 而cI-噬菌体则产生清晰的噬菌斑。（1） Insertion vectors selecting recombinant phage via insertional inactivation of the cI genecI+cI-Lysogenic cycleLytic cycleclear plaquescloudy plaqu

14、es（1） Insertion vectorsLambda gt10 Lambda gt10 载体可以克隆较小的DNA片段, 尤其是 cDNA。 载体上包含有EcoRI酶切位点，可接受7.6 kb长的外源片段。外源DNA的插入可以使lambda 抑制基因(gene i434)失活，从而产生清晰的噬菌斑。 b527 Lambda基因组上缺失的一部分。A . J 是结构基因。 （1） Insertion vectorsLambda gt11 Lambda gt11 在EcoRI位点能接受超过7.2 kb长的DNA片段，在E. coli LacZ附近。这就可以通过Lac 启动子产生融合蛋白。 重组噬

15、菌体可以通过抗体和在包含X-Gal/IPTG的平板上检测LacZ基因的失活进行检测。 nin5 is a deletion of the Lambda genome.（1） Insertion vectorsLambda ZAP 这类载体设计用来克隆cDNA文库。在6个克隆位点的任何一个位点，可以接受大于10 kb 的外源DNA。 克隆进这些位点后导致LacZ基因插入失活，从而可以X-Gal/IPTG平板上检测出重组体。还可以在启动子下表达蛋白质通过特异抗体进行检测。（2） Replacement vectors2. 噬菌体载体（2） Replacement vectors 构建噬菌体载体的另

16、一种方法是切去一部分中间填充片段。可以克隆 20-25 kb长度的DNA。这些载体专用于构建哺乳动物的基因文库。 这种载体被限制酶酶切时, 可以除去“stuffer” 片段，只留下左臂和右臂。通过乙醇沉淀法去除“stuffer” 片段，再用同一种限制酶连接外源DNA和两臂。 Lambda DNA 有粘性末端，可以相互连接成cos 位点。 重组分子用体外包装系统进行包装。为了有效地包装，两个cos位点之间的距离要在38kb和52 kb之间。续前一页（2） Replacement vectorsEMBL 3 and 4 Lambda EMBL载体用来克隆9到23kb的片段. 多克隆位点位于stuf

17、fer 片段的一侧。克隆位点的顺序EMBL 3 和EMBL 4相反。 用EMBL 3载体克隆时用双酶切EcoRI 和 BamHI 可以阻止 中间填充片段和两臂重新连接。第二节 噬菌体载体（phage vectors）1、噬菌体的生物学特性2、 噬菌体载体3、M13噬菌体的生物学特性4、M13噬菌体载体3. M13噬菌体的生物学特性 M13是线状的大肠杆菌噬菌体，颗粒内含有6047个核苷酸的闭合环状单链DNA基因组，其单链的基因组DNA经改造后可作为单链的DNA载体。 因为M13单链DNA的复制型（RF，replicative form）是呈双链环形，此时的DNA可以像质粒DNA一样进行提取和体

18、外操作。不论是双链还是单链的M13 DNA均能感染寄主细胞。而且M13的颗粒不受包装的限制，根据DNA的多寡其噬菌体的颗粒可大可小。 M13噬菌体将DNA正链注入寄主细胞后与单链DNA 结合蛋白结合，随后以小RNA链为引物合成负链而转变成RF。 正链和负链出现不对称性积累：当RF积累到100-200个拷贝后，噬菌体DNA编码的正链特异结合蛋白很快就阻止了负链的进一步生成，但以负链为模板的正链合成并未受到影响。大量游离的正链DNA很快参入到外壳蛋白中形成了大量新的噬菌体颗粒。 新组装的噬菌体颗粒并不会发生溶菌现象，只是从寄主细胞中挤压出去。但噬菌体的大量繁殖也干扰了寄主细菌的正常生长，所以仍可产

19、生模糊的噬菌斑。 在M13基因组中有一段507bp的基因间隔区，该区可以接受外源DNA的插入而不会影响到噬菌体的活力。这是该噬菌体能用于单链DNA载体的重要前提。3. M13噬菌体的生物学特性3. M13噬菌体的生物学特性 SS RF 1-1RF RF 1-20RF SS 20以上The typical life cycle of M13第二节 噬菌体载体（phage vectors）1、噬菌体的生物学特性2、 噬菌体载体3、M13噬菌体的生物学特性4、M13噬菌体载体4. M13噬菌体载体 后表现不稳定，在噬菌体增殖过程中容易发生缺失。所以一般克隆的片段在1kb之内，克隆300-400bp的

20、片段十分稳定。 载体中含有LacZ基因及位于其中的多克隆位点，所以能通过互补在X-Gal/ IPTG平板上识别重组体。这类载体包括了 M13mp8、9 和 M13mp18 、 19等。 这类载体的突出优点在于其既可以提供单链DNA，也可以提供双链的DNA。其最大的不足在于插入大的DNA片段 噬菌粒载体噬菌粒载体（phagemid vector或phasmid vector）是一种新型的载体，具有质粒和丝状噬菌体的优点，其特点是：分子较小，约为3kb，可克隆10kb的外源DNA片段；既具有质粒的复制起始点，又具有M13噬菌体的复制起点，在宿主细胞内可按质粒双链的DNA分子形式复制。当辅助噬菌体存

21、在时，复制按M13噬菌体的滚环复制模型进行复制，产生单链DNA分子；具有多种功能，例如：外源DNA片段的克隆、产生单链模板DNA用于基因定点突变、直接测定插入外源DNA片段的序列、对外源基因进行体外转录和翻译等。第三章 基因克隆的载体引 言（introduction）第一节 质粒载体（plasimid vectors）第二节 噬菌体载体（phage vectors）第三节 柯斯质粒载体（cosmid vectors） 第四节 人工染色体载体（B/Y/HAC）第三节 柯斯质粒载体（cosmid vectors）柯斯质粒载体的特点 柯斯质粒是一类人工构建的含有DNA的cos序列和质粒复制子的特殊类

22、型的质粒载体，cosmid是cos site carrying plasmid的缩写。柯斯质粒的大小为4-6kb，由3部分组成： A.多克隆位点区 B. 含有cos位点的DNA区 C. 复制起始位点和抗性标记区pHC79OriMarkerMCScosDNA第三节 柯斯质粒载体（cosmid vectors）柯斯质粒（粘粒）载体的特点1、具有噬菌体的特性 柯斯质粒连接上适宜长度的外源DNA后可以在体外包装成噬菌体颗粒，并能高效转导寄主细胞。进入寄主细胞的DNA也能环化和复制，但是不会形成新的噬菌体颗粒，也不能发生溶菌现象。2、具有质粒载体的特性 能像质粒一样在寄主细胞内复制，且带有抗性选择标记基

23、因，有些还带有插入失活型的多克隆位点，为重组体的筛选提供了方便。3、高容量的克隆能力 cos质粒本身很小（5-10kb），只有复制起点、选择标记和cos位点等构成，所以其克隆上限可达42kb左右。不过由于包装的限制，其克隆片段至少要达到33kb。第三节 柯斯质粒载体（cosmid vectors）柯斯质粒载体的应用噬菌体的位点特异切割体系末端酶（terminase）体系要求两个cos位点间要保持38-52kb的距离。 下面的操作中缺点是：cosmid自我重组、外源DNA片段串联 后重组。OriMarkerMCScosDNA第三节 柯斯质粒载体（cosmid vectors）柯斯质粒载体的应用1

24、981年Ish-Horowics和Burke设计的特殊的基因组克隆方案，选用 MboI或Sau3A进行基因组DNA的酶切。不仅是因为它们是4碱基识别位点的酶，而且它们和BamHI是同尾酶。cosHindIIIBamHISal ISal IHindIII磷酸化酶Sal IBamHIBamHIHindIIIBamHIBamHISal IHindIIISau 3A磷酸 化酶32-47 kb第三章 基因克隆的载体引 言（introduction）第一节 质粒载体（plasimid vectors）第二节 噬菌体载体（phage vectors）第三节 柯斯质粒载体（cosmid vectors） 第四

25、节 人工染色体载体（B/Y/HAC）第四节 人工染色体载体（B/Y/HAC）用于DNA 片段克隆的载体系统( vector) 一直是分子生物学中的重要工具， 前面介绍的质粒、噬菌体、粘粒等载体系统在分子生物学研究中都有着广泛的应用。但质粒系统容量小( 15 kb) ，很少用于DNA 文库(DNA library) 的构建， 尤其是真核生物的文库构建。噬菌体载体的克隆能力也超不过25kb，粘粒容量虽较大( 45 kb) ， 但对一些较大的基因簇(gene cluster) 的研究仍然无能为力。人工染色体载体系统复杂基因组研究中不可缺少的工具。 The sister chromatids of a

26、 mitotic pair each consist of a fiber (30 nm in diameter) compactly folded into the chromosome. Photograph kindly provided by E. J. DuPraw.The eukaryotic chromosome as a segregation device端粒(Telemere, TEL ) , DNA 复制起始点(Autonomously replicating sequence, ARS)和 着丝粒(Centromere, CEN ) 是维持染色体正常功能所不可缺少的三类

27、原件。将这三类原件及必要的选择标记克隆到大肠杆菌(E. Coli ) 质粒pBR 322中就构成了YAC载体质粒, 通过双酶切形成左右两臂, 同外源大片段DNA 连接后构成了YAC 分子。转入酵母细胞后即为YAC 克隆。右图是以pYAC4 为载体的YAC 分子构建程序。YAC载体的构建和应用1987 年，克隆容量可达几百至几千kb 的酵母人工染色体( YAC) 问世，并可以通过同源重组的方式在酵母菌中对携带有基因组插入大片段的YAC 进行操作（Burke DT , Science, 1987, 236: 806 811）。1993 年，Schedl 等首次报道用显微注射法制备得到含35kb 酪

28、氨酸酶基因以及侧翼序列的转基因鼠，并在后代中检测到酪氨酸酶的表达。同年， Yale 大学医学院Forget 教授随即在美国科学院院刊(PNAS)上以“YAC transgenes ：bigger is probably better”为题发表述评，对这类大片段的转基因研究给予了高度评价。遗憾的是，YAC 内部存在嵌合及重组等现象，即在一个YAC 克隆里含有两个本来不相连的独立片段；某些克隆不稳定，在转代培养时可能会缺失或重排其中的片段；此外，由于YAC 与酵母染色体具有相似的结构，因此YAC 很难与酵母染色体区分开，并且在转基因操作时必须特别小心，否则将难以保持YAC DNA 的结构完整，进而

29、导致大片段转基因研究失败。上述易于发生重组， 缺乏稳定性及制备工艺的繁琐等不足极大地制约了以YAC 为基础的大基因和大基因簇的转基因研究。BAC载体的构建和应用1992 年, Shizuya 等构建成功细菌人工染色体 (BAC) ，尽管BAC 克隆容量(350 kb) 较YAC 小， 但是，它具有容量大、遗传特性稳定、易于操作等优点。在基因文库构建和基因功能分析等方面有广泛的应用。BAC 构建的基础是E. coli 及F因子。 研究表明，F 因子在E. coli 中复制受到严格控制而且保持低拷贝，一般为每细胞单拷贝或两个拷贝，此外， F因子具有携带1Mb 插入片段的潜能，这就使得以此为基础、构建具有大容量克隆能力的BAC载体成为可能 。BAC 的复制子来源于单拷贝质粒F 因子，故BAC 在宿主菌内只有极少数拷贝数，可稳定遗传，无缺失，重组和嵌合现象。BAC 以E. coli 为宿主，所以转化效率较高，常规方法(碱裂解) 即可分离BAC：蓝白斑，抗生素，菌落原位杂交等均可用于目的基因筛选；而且， 可对