微生物的生长繁殖和影响因子关系和影响因素

1、微生物的生长繁殖和影响因子关系和影响因素主要内容： 微生物的生长繁殖 细菌的生长曲线 细菌生长曲线在污（废）水微生物处理中的应用 微生物的生存因子 不利环境因子对微生物的影响 微生物与微生物之间的关系 第一节 微生物的生长繁殖 一、生长繁殖的概念 (微)生物在适宜的环境条件下，不断吸收营养物质，按照自己的代谢方式进行新陈代谢活动。正常情况下，同化作用大于异化作用，微生物的细胞不断迅速增长，细胞长到一定程度时，就会由一个细胞分裂成细胞。 当发生个体数目的增加时，就称为繁殖。 单细胞生物的生长和繁殖 裂殖、芽殖、孢子繁殖等 多细胞生物的生长和繁殖 生长：个体体积的增加 繁殖：个体生长到一定阶段，通

2、过特定方式产生新 个体，即引起生命个体数量增加的生物学过程。在微生物学中提到的“生长”，一般均指群体生长，这一点与 研究大生物时有所不同。 细菌太小，往往讨论其群体生长。世代时间： 单细胞微生物的世代时间：两次细胞分裂之间的时间 多细胞生物的世代时间：两次繁殖之间的时间 世代时间的大小反映了一种微生物繁殖速度的快慢。 不同种的微生物，其生长繁殖速度不同。原核微生物的繁殖速度一般比真核微生物快。 从一般应用的角度，对于单细胞生物（如细菌），我们常常把生长=繁殖。二、研究微生物生长的方法 由于微生物个体太小，难以研究单个微生物，多数是通过培养研究其群体生长。常用的培养方法有：分批培养和连续培养。

3、（一）分批培养 分批培养是将一定量的微生物接种在一个封闭的、盛有一定量液体培养基的容器内，保持一定的温度、pH和溶解氧量，微生物在其中生长繁殖；结果会出现微生物数量由少变多，达到高峰后又由多变少，甚至死亡的变化规律。 用于培养微生物的摇床一般摇床都可以控制转速和温度生长曲线：细菌接种到定量的液体培养基中，定时取样测定细胞数量，以培养时间为横座标，以菌数为纵座标作图，得到的一条反映细菌在整个培养期间菌数变化规律的曲线。 微生物的生长曲线，可以细分为六个时期： 停滞期、加速期、对数期、减速期、稳定期和衰亡期 . 也可以粗分为四个时期（比较常用）包括：迟缓期、对数期、稳定期、衰亡期 一条典型的生长曲

4、线至少可以分为 迟缓期，对数期，稳定期和衰亡期等四个生长时期 细菌的生长曲线 下面按四个时期分别进行介绍。 1停滞期 （lag phase） 细胞分裂之前的准备，适应环境。 将少量菌种接入新鲜培养基后，在开始一段时间内菌数不立即增加，或增加很少，生长速度接近于零。也称延迟期、适应期。 少量细菌刚接入一定量的新鲜液体培养基中，并不立即生长繁殖，需要有一个适应过程（产生适应酶）。此时细胞物质开始增加，但数量不增加或增加很少。 延缓期特点： 细胞形态变大或增长，例如巨大芽孢杆菌，在迟缓期末，细胞的平均长度比刚接种时长6倍。一般来说处于迟缓期的细菌细胞体积最大； 细胞内RNA，尤其是rRNA含量增高，

5、合成代谢活跃，核糖体、酶类和ATP的合成加快，易产生诱导酶。 对外界不良条件反应敏感。 停滞的长短取决于某些因素：接种量、菌龄、营养等。如果种量大、菌龄小、营养和环境条件好，则停滞期就短。减少迟缓期时间措施： （1）遗传学方法改变种的遗传特性 （2）用对数生长期的做种子 （3）接种前后培养基成分不要相差太大 （4）适当扩大接种量 2.对数生长期（log phase） 这时的细菌代谢活性、酶活性稳定且高；大小一致；生活力强；用做种子和实验材料。 细菌的生长速度达到最大，细菌数以几何级数增加，在生长曲线上呈直线关系。 处于对数期的细菌，得到丰富的营养，代谢活力最强，细菌旺盛生长。此时的细菌比较整齐

6、（群体内比较一致）健壮。对不良环境条件的抗性也比较强。 第一节 微生物的生长繁殖(续）计算世代时间G : 已知：t1、t2、X1、X2， X2= X12n n=3.31(lg X2-lg X1) 由G=( t2- t1)/n 可得：G=( t2- t1)/3.31(lg X2-lg X1) 另一种方法是假设：dX/dt=K1X 其中K1为微生物的生长速度常数 ln(X2/X1)= K1(t2- t1) 令X2=2 X1，则t2- t1=G 代入，得：G=ln2/ K1 即1 3.稳定期（stationary phase） 生长率为0，菌数最多并维持稳定，积累代谢产物的好时期。 由于对数期的细菌

7、迅速生长繁殖，消耗了大量的营养物质，同时代谢产物的大量积累对细菌本身产生毒害作用；另外，pH 、溶解氧、氧化还原电位等条件也变得不利。结果造成细菌的生长速率逐渐下降，甚至到零。 在静止期，细菌总数达到最大，新生数与死亡数大致相等，保持动态平衡。此时的细菌开始积累贮存物质，芽孢菌形成芽孢。对数期到稳定期的转变是细胞重要的分化调节阶段： 1）开始储存糖原等内含物； 2）形成芽孢或建立自然感受态（芽孢杆菌） 3）发酵过程积累代谢产物的重要阶段； 某些放线菌抗生素的大量形成也在此时期生产上延长稳定期的方法： 补充营养物质（补料）或取走代谢产物； 调节pH、调节温度； 对好氧菌增加通气、搅拌或振荡4.衰

8、亡期（death phase） 营养物质被耗尽，细菌进入内源呼吸阶段（微生物消耗自身的贮存物质进行呼吸）。有害物质大量积累，不利于细菌的生长繁殖，此时，死亡率增加，活菌数减少。细菌常出现畸形或衰退型。特点： 细菌代谢活性降低； 细菌衰老并出现自溶； 产生或释放出一些产物；如氨基酸、转化酶、外肽酶或抗生素等。 菌体细胞也呈现多种形态，有时产生畸形，细胞大小悬殊； 有些革兰氏染色反应阳性菌此时会变成阴性反应 从根本上说，细菌的不同生长时期，是由外界提供的营养物的量决定的，即所谓的负荷（F/M）。 采取一定措施使微生物以恒定比生长速率生长 并持续。 培养过程中不断的补充营养物质和以同样的速率移出培养

9、 物是实现微生物连续培养的基本原则。 （二）连续培养dN dt=N 菌数增加速率dN dt=DN 菌数减少速率D：稀释率，即培养基每小时流过培养容器的体积数 D，细菌数会增加，营养物消耗和代谢产物积累 导致细菌停止生长。 D，维持平衡 D，菌被稀释 连续培养两种类型： 恒化器连续培养、恒浊器连续培养 恒化：某种营养物质维持恒定 恒浊：菌恒定 1恒浊连续培养是一种使培养液中细菌的浓度恒定，以浊度为控制指标的培养方式。按试验目的，首先确定培养液的浊度保持在某一恒定值上。调节进水(含一定浓度的培养基)流速，使浊度达到恒定(用自动控制的浊度计测定)。当浊度较大时，加大进水流速，以降低浊度;浊度较小时，

10、降低流速，提高浊度。发酵工业采用此法可获得大量的菌体和有经济价值的代谢产物。恒浊器连续培养 连续发酵优点： 缺点：一般用于菌体以及与菌体生长平行的代谢产物生产的发酵工业 缩短发酵周期，提高设备利用率； 便于自动控制； 降低动力消耗及体力劳动强度； 产品质量较稳定；杂菌污染和菌种退化2恒化连续培养是维持进水中的营养成分恒定(其中对细菌生长有限制作用的成分要保持低浓度水平)，以恒定流速进水，以相同流速流出代谢产物，使细菌处于或低于最高生长速率状态的培养方式。 在连续培养中 ，微生物的生长状态和规律与分批培养中的不同。它们往往处于相当分批培养中生长曲线的某一个生长阶段。 恒化器连续培养 恒化连续培养

11、中，必需将某种必需的营养物质控制在 较低的浓度，作为限制性因子，而其他营养物均过量。 限制性因子必须是机体生长所必需的营养物质，如aa和氨等氮 源，或G、麦芽糖等碳源或者是无机盐，一定浓度范围内决定 细菌生长速率。生物反应器（用于微生物的连续培养或分批培养，可以控制温度、溶解氧、pH等多项指标）三、细菌生长曲线在污（废）水微生物处理中的应用 在污水生物处理过程中，如果条件适宜，活性污泥的增长过程，与纯种单细胞微生物的增值过程大体相仿，也可以存在停滞期、对数期、静止期和衰老期。但由于活性污泥是多种微生物的混合群体，其生长受废水性质、浓度、水温、pH、溶解氧等多种环境因素影响，因此，在处理构筑物中

12、通常仅出现生长曲线中的某一、二个阶段。且处于不同阶段时的污泥，其特性有很大的区别。 由于废水生物处理（活性污泥）实际是连续运行，其微生物生长规律不同于分批培养时的规律，它只能是处于生长曲线的某一阶段。 一般把活性污泥生长曲线的划分成三个阶段： 生长上升阶段、生长下降阶段和内源呼吸阶段。 对于常规活性污泥法，是利用静止期（生长下降阶段）的微生物，这时因为：对数期的微生物生长繁殖快，代谢活力强，能大量去除废水中的有机物，但是相应地要求进水有机物浓度要高，而出水有机物浓度也相应提高，不易达到排放标准；又因为对数期的微生物生长旺盛，没形成荚膜和粘液层，不易形成菌胶团，沉淀性能差，降低出水水质。而处于静

13、止期的微生物虽然代谢活力略低，但仍能较好地去除水中的有机物，且微生物体内积累了大量的贮存物，形成荚膜等，强化了微生物的生物吸附能力，自我絮凝、聚合能力强，在二沉池泥水分离效果好，出水水质好。 当然也有利用其他阶段微生物的废水生物处理方法，如高负荷活性污泥法是利用对数期（生长上升阶段）和减速期（生长下降阶段），延时曝气法是利用衰亡期（内源呼吸阶段）等等。微生物代谢速率与负荷的关系四、微生物生长量的测定方法 大致有以下几种： 1.测定微生物总数 如计数器直接计数，或测定菌浊液的光密度值等。 2.测定活细菌数 平板菌落（CFU）计数、薄膜过滤计数等。 3.计算生长量 测定细胞干重，测定某一组份（如含

14、氮量、DNA）或生理指标。1、稀释平板计数法 对样品进行适当稀释 单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖 肉眼可见的菌落 对菌落数目的计数推测样品中的微生物细胞数 以数量变化对微生物生长情况进行测定 2、涂布平板法 使用较多的常规方法，但有时涂布不均匀！（一般）以数量变化对微生物生长情况进行测定 同一稀释度三个以上重复,取平均值； 每支移液管及涂布棒只能接触一个 稀释度的菌液； 样品充分混匀；每个平板上的菌落数目合适，便于 准确计数； 要求：每ml活菌数同一稀释度平均数稀释倍数5 注意：要三个以上重复平板平均计数；不适合丝状菌3.显微镜直接计数法 采用细菌计数板或血球计数板，显微镜下

15、直接计数 （计算一定容积里样品中微生物的数量）。 以数量变化对微生物生长情况进行测定 每ml原液含菌数每小格平均菌数400 1000 稀释倍数显微镜直接计数法缺点： 不能区分死菌与活菌； 不适于对运动细菌的计数； 需要相对高的细菌浓度； 个体小的细菌在显微镜下难以观察； 以生物量为指标测定微生物的生长 1、比浊法 在一定波长下，测定菌悬液的光密度，以光密度 (optical density, 即O.D.)表示菌量。 注意： 测量应在菌浓度与O.D.成正比的线性范围内，否则不准 2、重量法 以干重、湿重直接衡量微生物群体的生物量； 通过样品中蛋白质、核酸含量的测定间接推算微生物群体的生物量； 测

16、定多细胞及丝状真菌生长情况的有效方法 以生物量为指标测定微生物的生长 3、 生理指标法 呼吸强度 耗氧量 酶活性 与其群体的规模成正相关 生物热 样品中微生物数量多或生长旺盛，这些指标愈明显， 因此可以借助特定的仪器如瓦勃氏呼吸仪、微量量热 计等设备来测定相应的指标。 以生物量为指标测定微生物的生长 第二节 微生物的生存因子 环境对生长影响1.营养物质 2.水活性 3.温度 影响：酶活性、CM流动性、物质溶解度 4.pH 5.氧 微生物除需要营养外，还需要合适的环境生存因子。如果环境因子不正常，会造成微生物生命活动不正常，甚至变异或死亡。 一、温度 影响：酶活性、CM流动性、物质溶解度微生物的

17、生长要求有一定的温度范围：最低温度、最适温度、最高温度。 根据细菌最适温度的不同，可把细菌分为：嗜冷菌（5-10）、嗜中温菌（25-40）、嗜热菌（50-60）和嗜超热菌（70-105）。大多数菌为嗜中温菌。 不同微生物对温度的要求不同，同一微生物在生长的不同时期对温度的要求也会不同。 第二节 微生物的生存因子 温度对微生物的影响二、pH 微生物的生命活动、物质代谢与pH有密切关系。不同微生物对pH的要求有不同。微生物对pH的要求也存在最高、最低和最适三个点。常见的四大类微生物中，对pH的最适（范围）要求分别是，细菌：（4-10）；放线菌：7-8（5-10）；霉菌：3-6（）；酵母菌：5-6（

18、）。 在废水生物处理中，pH一般在（6-9）。生物处理的主体是细菌，它要求pH略为偏碱。过高的pH会使原生动物呆滞，菌胶团解体，影响去除效果，而过低的pH，会使霉菌大量繁殖，造成污泥膨胀。第二节 微生物的生存因子(续）三、氧化还原电位 氧化环境具有正电位，还原环境具有负电位。各种微生物对氧化还原电位的要求不同，一般好氧微生物要求Eh在+300+400mV；专性厌氧的微生物要求在-200-250mV；而兼性微生物，在+100mV以上时进行好氧呼吸，在+100mV以下时进行无氧呼吸。 环境中的氧化还原电位受到氧分压和pH等因子的影响。 四、溶解氧 微生物可分为：好氧微生物、兼性厌氧微生物和厌氧微生

19、物。第二节 微生物的生存因子(续）1好氧微生物 O2的作用有两个，一是作为最终电子受体，二是参与甾醇类和不饱和脂肪酸的合成。 微生物只能利用溶解于水中的O2，即溶解氧（DO）。DO与水温、大气压等因素有关，温度越高，氧的溶解度越小。 在好氧生物处理中，DO是个十分重要的因子，要求提供充足的氧，一般曝气池中的DO要求控制在34mg/L。 2兼性微生物 即能在有氧条件下生存，又能在无氧条件下生存。但两者所表现的生理状态是很不同的。 3厌氧微生物 只有在无氧条件下才能生存。对于专性厌氧微生物，要求绝对无氧的条件，氧的存在会使微生物死亡；另一些厌氧微生物，氧的存在与否对它没有影响，既不利用氧，也不中毒

20、。 第二节 微生物的生存因子(续） 五、太阳辐射 辐射包括：可见光（380-760nm）、紫外辐射（280-380nm）、近红外（760-3000nm）、热红外（6000-15000nm）及微波（1-几厘米）。另外还有电离辐射等。 可见光和红外辐射对进行光合作用的微生物有影响，能作为光合作用的能源。 六、水的活度与渗透压 水的活度aw是用来衡量水的被吸附和溶液因子对水的可利用性的影响的指标，表示在一定温度（如25）下，某溶液或物质在与一定空间空气相平衡时的含水量与饱和空气水量的比值。大多数微生物在aw为时生长最好。第二节 微生物的生存因子(续）渗透压是在半透性膜两边的不同浓度的溶液之间产生的压

21、力差。 微生物在不同渗透压的溶液中呈不同的反应： 等渗溶液，周围溶液=体内（0.5-0.85%的NaCL溶液，也被称为生理盐水） 微生物生长良好； 低渗溶液，周围体内（如20%的NaCL溶液） 细胞内的水分子大量渗出，使细胞发生质壁分离。 微生物在不同渗透压溶液中的反应第二节 微生物的生存因子(续）七、表面张力 表面张力是作用在物体表面单位长度上的收缩力。不同物质表面的表面张力不同，会对微生物的生长、繁殖及形态产生影响。 有些物质的加入，会改变溶液的表面张力，如表面活性剂能降低表面张力，从而对微生物产生影响。 第三节 其他不利环境因子对微生物的影响 一、紫外辐射和电离辐射对微生物的影响 紫外线

22、：对微生物有致死作用，可用以杀菌，但穿透力较差，只能用于空气和物体表面的消毒； 电离辐射：低剂量时，有促进生长的作用；高剂量时，则有致死作用。 常用来进行诱变育种。第三节 其他不利环境因子对微生物的影响(续）二、超声波对微生物的影响 超声波是频率超过20000HZ的声波，人耳听不见。超声波具有强烈的生物学效应，能破坏细胞。常用来破坏细胞壁，制成细菌裂解液。 三、重金属对微生物的影响 汞、银、铜、铅及其化合物，能使蛋白质发生沉淀变性，使酶失去活性，而可以用来作为杀菌和防腐。第三节 其他不利环境因子对微生物的影响(续）四、极端温度对微生物的影响 极端温度分高温和低温，影响有所不同。 高温的影响 在

23、高温时，微生物的蛋白质会发生凝固变性，呈不可逆的变性，导致微生物的死亡。 通常，可以利用高温对微生物的影响来达到杀灭微生物的目的。 四、生长繁殖控制控制（有害）微生物的生长速率或消灭不需要的微生物， 在实际应用中具有重要的意义。 抑制：亚致死剂量因子作用使生长停止 死亡：生长能力不可逆丧失 防腐：理化因素防止或抑制微生物生长 消毒：杀死或灭活所有病原微生物 灭菌：杀死包括芽孢在内的所有菌 化疗：选择毒性化学物质对生物体内部感染组织 或细胞进行治疗，对机体本身无毒害作用。第三节 其他不利环境因子对微生物的影响(续） 高温灭菌的方法有：灼烧、干热灭菌和湿热灭菌。 灭菌的效果取决于细菌中最耐热的结构

24、芽孢。 高温消毒的方法：煮沸 巴氏消毒法：60-85处理15秒至30分钟实验室所用高压蒸汽灭菌锅第三节 其他不利环境因子对微生物的影响(续）2低温的影响 低温下，微生物的代谢活力低，生长缓慢或停止，但不致死。处于低温下的微生物一旦获得适宜的温度，即可恢复活性。 利用这一特性，各种冰箱成为生物实验中保存生物样品或试剂的重要手段。 一般冰箱的温度在4零下18，可以用于保存一般的生物样品。而有的样品需要比较低的温度，甚至低达零下70，或更低（如使用液氮，可以达到零下196）第三节 其他不利环境因子对微生物的影响(续）五、极端pH对微生物的影响 过高或过低的pH对微生物的影响： （1）影响蛋白质的解离

25、，从而影响细胞表面的电荷，影响营养物质的吸收； （2）影响营养物质的离子化，影响其进入细胞； （3）影响酶的活性； （4）降低抗热性。第三节 其他不利环境因子对微生物的影响(续）六、干燥对微生物的影响 干燥能使微生物体内的蛋白质变性，引起代谢活动的停止，所以干燥会影响微生物的活性以至生命力。 不同微生物对干燥的抗性差别很大，细菌的芽孢、藻类和真菌的孢子及原生动物的胞囊抗性较强。 也可以用干燥的方法来保存微生物样品。第三节 其他不利环境因子对微生物的影响(续）七、若干有机物对微生物的影响 1醇 醇是脱水剂和脂溶剂，可使蛋白质脱水、变性，溶解细胞质膜的脂类物质，进而杀死微生物机体。 体积分数为70

26、%左右的乙醇杀菌力最强 。 原因：第三节 其他不利环境因子对微生物的影响(续）2甲醛 甲醛是很有效的杀菌剂，对细菌、真菌及其孢子和病毒均有效。甲醛是气体，质量浓度为370-400g/L的甲醛水溶液称为福尔马林。 3表面活性剂 常用的有酚、新洁尔灭、合成洗涤剂及染料等。第三节 其他不利环境因子对微生物的影响(续）八、抗生素对微生物的影响 许多微生物在代谢过程中产生能杀死其他微生物或抑制其他微生物生长的化学物质，即抗生素。 抗生素有广谱和狭谱之分。氯霉素、金霉素、土霉素和四环素可抑制许多不同种类的微生物，叫广谱抗生素。青霉素只能杀死或抑制革兰氏阳性菌，多粘菌素只能杀死革兰氏阴性菌，叫狭谱抗生素。

27、抗生素对微生物的影响有以下四方面：(1)抑制微生物细胞壁合成；(2)破坏微生物的细胞质膜；(3)抑制蛋白质合成；(4)干扰核酸的合成。 第四节 微生物与微生物之间的关系 微生物不仅与环境因素密切相关，而且与其他生物之间也有密切关系。其实对于一个（或一种）生物而言，其他生物个体（或种）就是它的环境因素。根据两种生物种之间的关系（有利、不利或中性），可形成多种类型的相互关系。下面介绍几种常见的生物（微生物）之间的相互关系： 第四节 微生物与微生物之间的关系(续）一、竞争关系 不同的微生物对于资源发生竞争，互相受到不好的影响，如对营养物质、空间地位等等。如在活性污泥中，菌胶团细菌和丝状菌会发生对溶解

28、氧或营养的竞争。第四节 微生物与微生物之间的关系(续）二、原始合作关系（互生关系） 两种可以单独生活的微生物共存，互为有利。这是一种可分可合，合比分好的相互关系。 如在植物根部生长的根际微生物与高等植物之间存在着互生关系，在人体肠道中，正常菌群与人之间也存在着互生关系。 又如在氧化塘中的藻类和细菌。第四节 微生物与微生物之间的关系(续）三、共生关系 两种不可以单独生活的微生物共存，互为有利，彼此分离就不能很好地生活。地衣就是微生物间共生的典型例子，它是真菌和蓝细菌或藻类的共生体。 叶状地衣 （南极石耳） 壳状地衣 （南极中国长城站海边崖岩上的地衣群落） 壳状地衣 （南极丽石黄衣，红色和赤星衣，

29、米黄色） 壳状地衣 （南极的瘿茶渍衣）根瘤菌第四节 微生物与微生物之间的关系(续）四、偏害关系（拮抗关系） 拮抗关系是指一种微生物在其生命活动中，产生某种代谢产物或改变环境条件，从而抑制其他微生物的生长繁殖，甚至杀死其它微生物的现象。 可分为特异性偏害和非特异性偏害。如乳酸菌对其他细菌的影响，产生抗生素的微生物（如青霉菌产生青霉素）对其他微生物的影响（如革兰氏染色阳性菌）等。第四节 微生物与微生物之间的关系(续）五、捕食关系 一种微生物吞食另一种微生物，如原生动物吞食细菌等。 六、寄生关系 寄生指的是小型生物生活在较大型的生物体内或体表，从后者获得营养，进行生长、繁殖，并使后者蒙受损害甚至被杀

30、死的现象。前者为寄生菌，后者为寄主或宿主。如噬菌体与细菌的关系。寄生型的放线菌照片金黄色葡萄球菌的生长为本来在平板上不能生长的嗜血流感菌 提供生长因子，后者在其菌苔周围形成卫星菌落。第五节 菌种的退化、复壮与保藏 性状稳定的菌种是微生物工作最重要的基本要求，否则生产或科研都无法正常进行。 影响微生物菌种稳定性的因素： a）变异；b）污染；c）死亡一、 菌种的衰退和复壮在微生物的基础研究和应用研究中，选育一株理想的菌株是一件艰苦的工作，而欲使菌种始终保持优良性状的遗传稳定性，便于长期使用，还需要做很多日常的工作。实际上，由于各种各样的原因，要使菌种永远不变是不可能的，菌种衰退是一种潜在的威胁。只

31、有掌握了菌种衰退的某些规律，才能采取相应的措施，尽量减少菌种的衰退或使已衰退的菌种得以复壮。一、菌种的衰退 菌种衰退（degeneration）是指由于自发突变的结果，而使某物种原有的一系列生物学性状发生量变或质变的现象。 纯菌种自发突变突变个体传代增殖原始个体不纯菌种衰退菌种（一）菌种衰退的现象 菌落和细胞形态改变 生长速度缓慢，产孢子越来越少 代谢产物生产能力下降，即出现负突变 致病菌对宿主侵染能力下降 对外界不良条件的抵抗能力下降等（二）菌种衰退的原因 基因突变主要原因 1、有关基因发生负突变导致菌种衰退 2、表型延迟造成菌种衰退 3、质粒脱落导致菌种衰退 连续传代加速衰退 不适宜的培养

32、和保藏条件加速衰退（三）菌种衰退的防止 控制传代次数 创造良好的培养条件 利用不易衰退的细胞移种传代 采用有效的菌种保藏方法 讲究菌种选育技术 定期进行分离纯化二、菌种的复壮 狭义的复壮消极的措施 是指在菌种已经发生衰退的情况下，通过纯种分离和测定典型性状、生产性能等指标，从已衰退的群体中筛选出少数尚未退化的个体，以达到恢复原菌株固有性状的相应措施。 广义的复壮积极的措施 是指在菌种的典型特征或生产性状尚未衰退前，就经常有意识地采取纯种分离和生产性状测定工作，以期从中选择到自发的正突变个体。 菌种复壮的主要方法纯种分离法 菌落纯（“菌种纯”）细胞纯（“菌株纯”） 通过纯种分离,可将衰退菌种细胞

33、群体中一部分仍保持原有典型性状的单细胞分离出来,经扩大培养,就可恢复原菌株的典型性状。宿主体内复壮法 对于寄生性微生物的衰退菌株，可通过接种到相应昆虫或动植物宿主体内来提高菌株的毒性。 淘汰法 将衰退菌种进行一定的处理（如药物、低温、高温等），往往可以起到淘汰已衰退个体而达到复壮的目的。遗传育种法 把退化的菌种重新进行遗传育种，从中再选出高产而不易退化的稳定性较好的生产菌种。 二、 菌种的保藏 菌种是重要的生物资源，研究和选择良好的菌种保藏方法具有重要的意义。（一）菌种保藏的目的 菌种保藏的重要意义就在于尽可能保持其原有性状和活力的稳定，确保菌种不死亡、不变异、不被污染，以达到便于研究、交换和

34、使用等诸方面的需要。二、菌种保藏的原理首先应该挑选典型菌种的优良纯种来进行保藏，最好保藏它们的休眠体，如分生孢子、芽孢等。其次应人为地创造环境条件（如：干燥、低温和缺氧），使微生物长期处于代谢不活泼、生长繁殖受抑制的休眠状态。尽可能多的采用不同的手段保藏一些比较重要的微生物菌株三、菌种保藏方法各种微生物由于遗传特性不同，因此适合采用的保藏方法也不一样。一种良好的有效保藏方法，首先应能保持原菌种的优良性状长期不变，同时还须考虑方法的通用性、操作的简便性和设备的普及性。 斜面低温保藏法 石蜡油封藏法 砂土管保藏法 麸皮保藏法 甘油悬液保藏法 冷冻真空干燥保藏法 液氮超低温保藏法 宿主保藏法（一）斜

35、面低温保藏法常用保藏法将菌种接种在适宜的斜面培养基上，待菌种生长完全 后，置于4左右的冰箱中保藏，每隔一定时间（保藏 期）再转接至新的斜面培养基上，生长后继续保藏， 如此连续不断。此法广泛适用于各大类微生物菌种的短期保藏此法的主要保藏措施是低温。一般可保存16 个月左右。优点是简便易行，容易推广，存活率高；缺点 是菌株仍有一定程度的代谢活动能力，保藏期 短，传代次数多，菌种较容易发生变异和被污 染。（二）石蜡油封藏法此法是在无菌条件下，将灭过菌并已蒸发掉水分的液体 石蜡倒入培养成熟的菌种斜面（或半固体穿刺培养物） 上，石蜡油层高出斜面顶端1cm，使培养物与空气隔绝， 加胶塞并用固体石蜡封口后，

36、垂直放在室温或4冰箱内 保藏。此法广泛适用于各大类微生物菌种的中期保藏不适用于保藏某些能分解烃类的菌种。 此法的主要保藏措施是低温、阻氧。一般可保 存12年左右。（三）砂土管保藏法一种常用的长期保藏菌种的方法，适用于产孢子的 微生物及形成芽孢的细菌，对于一些对干燥敏感的 细菌及酵母则不适用。砂土管法兼具低温、干燥、隔氧和无营养物等 诸条件，故保藏期较长、效果较好，且微生物 移接方便，经济简便。它的保藏期约110年。 该法是将砂与土分别洗净、烘干、过筛，按一定比例分装于小试管中，砂土的高度约1cm，121蒸汽灭菌1，间歇灭菌3次。50烘干后经检查无误后备用。将待保藏的菌株制成菌悬液或孢子悬液滴入

37、砂土管中，放线菌和霉菌也可直接刮下孢子与载体混匀，而后置于干燥器中抽真空约24h，用火焰熔封管口(或用石蜡封口)，置于干燥器中，在室温或4冰箱内保藏。 （四）麸皮保藏法又称曲法保藏。即以麸皮作载体，吸附接入的孢子，然 后在低温干燥条件下保存。其制作方法是，将麸皮与水 以一定的比例拌匀，装量为试管体积2/5，湿热灭菌后经 冷却，接入新鲜培养的菌种，适温培养至孢子长成。将 试管置于盛有氯化钙等干燥剂的干燥器中，于室温下干 燥数日后移入低温下保藏；干燥后也可将试管用火焰熔 封，再保藏，则效果更好。此法适用于产孢子的霉菌和某些放线菌，保藏 期在1年以上。因操作简单、经济实惠，工厂较 多采用。（五）甘油

38、悬液保藏法此法是将菌种悬浮在甘油蒸馏水中，置于低温下保藏，本法较简便，但需置备低温冰箱。保藏温度若采用20，保藏期约为1年，而采用70，保藏期可达10年。将拟保藏菌种对数期的培养液直接与经121蒸汽灭菌20min的甘油混合，并使甘油的终浓度在1015，再分装于小离心管中，置低温冰箱中保藏。基因工程菌常采用本法保藏。（六）冷冻真空干燥保藏法又称冷冻干燥保藏法，简称冻干法。它通常是用保护剂制备拟保藏菌种的细胞悬液或孢子悬液于安瓿管中，再在低温下快速将含菌样冻结，并减压抽真空，使水升华将样品脱水干燥，形成完全干燥的固体菌块。并在真空条件下立即熔封，造成无氧真空环境，最后置于低温下，使微生物处于休眠状

39、态，而得以长期保藏。 此法适用于各大类微生物。 此法的主要保藏措施是低温、干燥、缺氧、有 保护剂，保藏期一般长达515年，存活率高， 变异率低，是目前被广泛采用的一种较理想的 保藏方法。 该法操作比较烦琐，技术要求较高，且需要冻 干机等设备。（七）液氮超低温保藏法简称液氮保藏法或液氮法。它是以甘油、二甲基亚砜等作为保护剂，在液氮超低温（196）下保藏的方法。其主要原理是菌种细胞从常温过渡到低温，并在降到低温之前，使细胞内的自由水通过细胞膜外渗出来，以免膜内因自由水凝结成冰晶而使细胞损伤。此法适用于各种微生物菌种的保藏。此法的主要保藏措施是超低温、有保护剂，保藏期一般可达到15年以上，是目前公认

40、的最有效的菌种长期保藏技术之一。此法的优点是操作简便、高效，且可使用各种培养形式的微生物进行保藏。其缺点是需购置超低温液氮设备，且液氮消耗较多，操作费用较高。（八）宿主保藏法此法适用于专性活细胞寄生微生物（如病毒、立克次氏体等）。植物病毒可用植物幼叶的汁液与病毒混合，冷冻或干燥保存。噬菌体可以经过细菌培养扩大后，与培养基混合直接保存。动物病毒可直接用病毒感染适宜的脏器或体液，然后分装于试管中密封，低温保存。在上述的菌种保藏方法中，以斜面低温保 藏法、石蜡油封藏法、宿主保藏法最为简 便；砂土管保藏法、麸皮保藏法和甘油悬 液保藏法次之；以冷冻真空干燥保藏法和 液氮超低温保藏法最为复杂，但其保藏效

41、果最好。应用时，可根据实际需要选用。美国ATCC采用冷冻干燥保藏法和 液氮保藏法来保藏所有菌种。我国CCCCM采用斜面低温保藏法、 冷冻干燥保藏法和液氮保藏法进 行菌种保藏。*中国微生物菌种保藏委员会（CCCCM)，*中国典型培养物保藏中心（CCTCC），*美国典型菌种保藏中心（ATCC）等 ATCC采用的两种保藏方法的优点示意图第六节 纯培养与显微技术培养物纯培养物混合培养物纯培养能较好地得到重复结果 ， 是微生物研究的重要技术之一一、微生物的分离和纯培养无菌技术（aseptic technique) 分离、转接、纯化时防止其他微生物污染的技术试管、烧瓶、培养皿等常用器皿 灭菌方法有：高压蒸

42、汽灭菌、高温干热、煮沸一、微生物的分离和纯培养微生物培养常用器皿及灭菌 接种针或接种环分离或将微生物从一个培养器皿转 接到另一个，无菌操作。火焰旁边或无菌箱或无菌室 进行。 接种针采用迅速加热和冷却的镍铬合金制备 液体培养物用无菌移液管或移液枪一、微生物的分离和纯培养接种操作，最基本技术一、微生物的分离和纯培养无菌操作台火焰旁无菌区用固体培养基分离纯培养 各种菌落一、微生物的分离和纯培养菌落(colony)：单个微生物在固体 培养基或内层）生长繁殖形成肉眼 可见的，有一定形态结构的子细胞 生长群体。 菌落连成片为菌苔（lawn）一、微生物的分离和纯培养不同微生物在特定培养基上生长形成的菌落或菌

43、苔一般都具有稳定的特征 （形状、颜色等），是微生物分类、鉴定的重要依据。一、微生物的分离和纯培养同一细菌在不同的培养平板上形成不同的特征菌落 一、微生物的分离和纯培养克隆（clone)：一个单细胞繁殖形成的菌落，即一个纯种细胞群或克隆。 固体培养基：琼脂或其他凝胶物质固化的培养基。 平板：即培养平板（culture plate)。融化的固体 培养基倒入无菌平皿冷却凝固后即为平板， 用于分离、培养微生物。 一、微生物的分离和纯培养稀释平板法（pour plate method) 将细菌或其他微生物无菌水梯度稀释，取少量与冷却至50固体培养基混合，摇匀，倒入培养皿，凝固，倒置培养24小时，就会出现

44、菌落。 一、微生物的分离和纯培养常用固体分离纯培养方法： 一、微生物的分离和纯培养稀释平板法涂布平板法（spread plate method) 稀释平板法因为细菌与50培养基混合导致某些热敏感菌死亡，及好氧菌埋在培养基中缺乏氧气影响生长，所以更常用涂布平板法。一、微生物的分离和纯培养常用固体分离纯培养方法： 一、微生物的分离和纯培养涂布平板法平板划线分离法（streak plate method） 接种环沾取少许微生物，在无菌平板扇形、平行等划线，随划线次数增加而分散开，得到单菌落。 平板划线分离一、微生物的分离和纯培养稀释摇管法(dilution shake culture method）

45、 厌氧微生物可用此法进行纯培养分离。 操作：盛培养基试管加热融化，冷却至50， 待分离材料用这些试管梯度稀释 ，摇匀，冷凝，石蜡封口 一、微生物的分离和纯培养厌氧微生物分离装置：一、微生物的分离和纯培养厌氧罐厌氧手套箱液体培养基分离纯培养：一、微生物的分离和纯培养有些微生物液体培养基分离纯培养，原生动物、藻类。 方法稀释法： 接种物在液体培养基中顺序稀释，高度稀释，每个试管中分配不到一个。若稀释后同一梯度的平行试管中大多数（95）没有，那么有微生物的可能是纯培养，否则可能性下降。显微分离法直接分离单细胞或单个个体培养获得纯培养一、微生物的分离和纯培养单细胞（单孢子）显微分离：稀释法缺点分离的优

46、势菌显微操作仪，专业程度高对某微生物生长需要了解后，设计适合其生长繁殖的培 养基，抑制其他菌生长，即使该微生物在混杂群体中很 少也可分离。 一、微生物的分离和纯培养选择培养分离方法：选择培养基直接分离 一、微生物的分离和纯培养选择培养分离方法：如：耐高温菌采用高温筛选； 蛋白酶产生菌加牛奶筛选； 抗抗生素可采用加抗生素筛选待分离的微生物生长，其它微生物的生长被抑制一、微生物的分离和纯培养选择培养分离方法：富集培养 特定的环境条件仅适应于该条件的微生物旺盛生长待分离微生物在群落中的数量大大增加从自然界中分离到所需的特定微生物根据微生物的特殊要求，从自然界分离出特定已知微生物种类；分离培养在特定环

47、境中能生长的微生物；富集培养 二、显微镜和显微技术决定显微观察效果重要因素：分辨率和 反差 分辨率：辨别两点之间最小距离的能力 反差：样品与背景区别程度 普通显微镜 机械装置：镜座、支架、载物台、 调焦螺旋 光学系统：物镜、目镜、聚光器 普通显微镜结构示意图显微镜种类和原理：二、显微镜和显微技术光学显微镜一般配置的最大放大倍数是多少？为什么？目镜：10 15 ；物镜： 100 ；总放大倍数10001500 ； 如何实现光学显微镜一般配置的最大放大倍数？其原理？使用油镜，即在100 物镜和载玻片之间滴加香柏油； 香柏油与玻璃折射率相近二、显微镜和显微技术 0.5 l 分辨率（最小可分辨距离）= n sin q 分辨率与所用波长成反比！二、显微镜和显微技术分辨率与所用波长成反比！N：玻片与物镜间介质的折射率空气（）、水（）、香柏油（）显微观察时可根据物镜的特性而选用不同的介质 二、显微镜和显微技术二、显微镜和显微技术光线在穿过折射率不同的介质时发生折射 二、显微镜和显微技术浸没油与玻璃的折射率相近很多原来由于在透镜及载片表面的反射和折射而损失的 光线可以进入物镜，使照明亮度提高，改善观察效果。暗视野显微镜二、显微镜和显微技术活细菌在普通显微镜下是透明，观察不清，采用暗视野显微镜，如：黑夜看星星就很清楚。 暗视野显微镜结构与照明示意图暗视