禽流感防制知识讲座-禽流感间接ELISA诊断和治疗技术应用

1、禽流感防制知识讲座-禽流感间接ELISA诊断和治疗技术应用 禽流感AIV是影响养禽业开展的重要疾病之一，高致病性AIV被国际兽疫局列为I类烈性传染病,我国为一类动物疫病。1878 年首次报道于意大利，目前遍布全世界。近期得到前所未有的关注。禽流感做为一种人禽共患的政治、经济病，严重地威胁着我国养禽业的开展、对外贸易及人类健康。禽流感概况禽流感的病原 1901年别离到，1955年被确定为正粘病毒科、流感病毒属、A型流感病毒。负链单股RNA病毒，呈球形，直径为80120nm，平均为100nm。具囊膜，在囊膜外表有许多放射状的纤突。病毒基因组由8个独立片段组，分别编码10病毒蛋白：依赖性聚合酶蛋白P

2、A、PB1、PB2、核蛋白NP、非结构蛋白NS1、NS2、基质蛋白M1、M2及病毒外表的血凝素蛋白HA及神经氨酸酶蛋白NA。我国公开报道的禽流感的几个事件97香港流感事件， 18人感染H5N1亚型禽流感病毒，6人死亡，约150万只鸡、鸭、鹅和鸽子被扑杀，直接耗资6000万港币，用于对养禽业的补助达10亿港币。据估算，仅广东一省的损失达人民币15亿元以上。1999年3月，香港卫生署从2个生病儿童身上别离到H9N2亚型AIV。我国从人群中分出5株H9N2毒株。3. 2001年5月，香港再次发生5N1禽流感并展开杀鸡行动，港方销毁120万只家禽，涉及赔偿及有关开支金额达8000万元。随后，澳门市政部

3、门证实在一批禽鸟样本中发现两只鹅受到H5N1禽流病毒感染，展开了历年来首次的全澳门“杀鸡行动，销毁约二万只家禽。4. 2001年6月4日，韩国农林部宣布从中国上海大盈禽联公司出口的禽肉中检测出H5N1 HPAIV，禁止从中国进口家禽及禽类产品。6月8日，日本仅依据韩国提供的情况，也宣布暂停从中国进口禽类产品。5. 2002年2月，香港因发生禽流感第三次展开杀鸡行动，销毁约30多万只。6. 2003年1-2月，香港再次爆发禽流感，涉及22个禽场，共杀禽86万只。我国禽流感的流行情况禽流感的诊断 流行病学诊断 临床病症诊断 病理变化诊断 组织学病变诊断 病原学诊断 血清学诊断禽流感的流行特点 禽流

4、感是一种急性高度接触性传染病，一年四季均可发生，但以冬季和春季较为严重。 宿主广泛，鸡、火鸡、鸭、鹅、鹌鹑、雉鸡和鸽等多种类型的家禽和野禽均易感。但发病和危害最大的主要是鸡和火鸡，鸭、鹅、鸽多为隐性感染或带毒，但近年发现鸭、鹅出现由H5亚型病毒引起的严重疾病，死亡率很高。 水禽特别是野鸭、海欧、岸基鸟在流行病学中有十分重要的作用。 各种日龄的鸡均易感，但以40日龄左右的肉鸡、产蛋顶峰期的种鸡和商品蛋鸡较常发生。 传染源可以是临床表现正常的带毒水禽和海鸟，病毒可长期在污染的粪便、水中存活。禽类发病后，病毒大量繁殖，通过病禽的粪便、呼吸道分泌物，也可以通过污染的饲料、水、设备和垫草等传播。禽流感的

5、临床病症1.慢性型：非高致病性AIV毒株感染或高致病性毒株感染已有一定免疫力的家禽引起的。 主要表现为产蛋量突然下降，有时有轻微呼吸道病症，死亡率正常或略有上升。潜伏期长，最长可达21天。2. 急性型：多由H5、H7亚型HPAIV引起。-潜伏期短，病程12天，死亡率可达100%。有时没有明显病症即可见到鸡只死亡。-鸡冠发绀呈暗红色或紫黑色，头和颜面部水肿，脚鳞出现紫色出血斑。-局部病鸡及水禽出现头颈和腿部麻痹、抽搐等神经病症。禽流感的病理变化 剖检病变：HPAI主要表现为各脏器、粘膜广泛出血。 组织学病变：主要表现为皮肤及内脏器官肝、脾、胰、肺、肾的出血、充血和坏死。实验室诊断病原学诊断血清学

6、诊断病毒别离和鉴定技术PCR技术捕捉ELISA直接免疫荧光技术HI试验AGP试验间接ELISA斑点ELISA NASBA技术鸡新城疫与鸡禽流感的鉴别诊断及防治 鸡新城疫、鸡禽流感都是由病毒引起的具有高度传染性的疾病，一年四季均可发病，且都以冬春两季多发，现就其鉴别诊断介绍如下。 一、易感动物1鸡新城疫：是由副粘病毒引起，易感动物是鸡，死亡率高于鸡禽流感。 2鸡禽流感：由A型流感病毒引起，具有快速流行、持续时间长等特点，对禽类都有一定的互感性，鸡、鸭、鹅等禽类均易感染 二、临床病症1鸡新城疫：(1)呼吸有罗音，并发出咯咯喘鸣声；(2)腿部麻痹，头部颤抖；(3)食欲和饮水量下降，粪便呈绿色。 2鸡

7、禽流感：(1)头部肿大，鸡冠、肉髯发绀，脚鳞出现紫色出血斑；(2)腹泻，粪便呈绿色或黄绿色水样，死亡率5-30不等是特征性病症；(3)有的鸡群以呼吸障碍为主，呼吸有罗音且雏鸡的呼吸病症更严重。 三、剖检变化1鸡新城疫：(1)腺胃粘膜乳头出血；(2)十二指肠溃疡，小肠粘膜有圆形或枣核状坏死溃疡病灶，泄殖腔充血、出血；(3)盲肠扁桃体溃疡。 2鸡禽流感：(1)心肌灰白色坏死；(2)胰腺有灰白色坏死点；(3)消化道有类似新城疫病变，特别是腺胃乳头肿大出血，但与新城疫不同的是十二指肠、盲肠扁桃体未见溃疡；(4)产蛋鸡成熟卵泡囊充血、出血，腹腔内常见有卵黄渗出或破裂、卵泡血肿和变形等特异性病变。 四、鉴

8、别诊断根据两者的流行情况、临床病症及剖检变化得到初步的鉴别诊断。另外，采用红细胞血凝试验可作定性鉴别，即鸡红细胞血凝试验两者均凝集，山羊红细胞凝集试验鸡新城疫不凝集，鸡禽流感凝集。 五、防治措施1杜绝病原侵入鸡群、严格执行消毒制度。消毒剂应选择重信誉、讲品质厂家生产的具有杀菌谱广、作用快、无腐蚀性、残留少、使用方便者。如百毒杀、农福五号等。 2合理制订鸡群免疫程序，做好预防接种工作。可分别选用鸡新城疫I系或系苗、鸡禽流感多价灭活苗屡次强化免疫以增强鸡群的抵抗力。 五、防治措施3一旦发现可疑疫病，及时检测诊断和做好病死鸡的处理工作。并对受威胁鸡群进行紧急防治，以预防疫情蔓延和继发感染。可选用：(

9、1)鸡新城疫、禽流感高免卵黄抗体，按每公斤体重肌注2-3mL，连用2-3d；(2)利毒威 混饮：每100g本药治疗量兑200kg水，连饮2-4d；(3)感泰克混饮：按体重给药，治疗量每千克体重02-03mL。呼啦杀 混饮：每100g本药治疗量兑120kg饮水。 病毒别离 病毒别离不仅是目前对发病禽群最确切诊断的一种方法，也是免疫禽群的主要监测手段。如果采集及处理样品的方法得当，别离病毒是诊断禽流感的一种敏感而实用的方法。相对于PCR、免疫荧光、ELISA以及电镜观察等其他直接检测病原的方法或手段，病毒别离的一个主要的优点就是可以测定病毒的致病性，而且可以对病毒做进一步抗原特性分析试验和基因特性

10、的研究，同时可用于疫苗制备及药物敏感性实验等。 病毒别离 不仅是发病禽确实切诊断方法，而且是免疫禽群的主要监手段。病料的采集 可以从活体或尸体进行病原的别离和鉴定。用棉拭子法常可从活体的气管和泄殖腔中别离到病毒,特别是从泄殖腔中别离到病毒的时机较多，为此可用不同大小的棉拭子擦取气管或泄殖腔，尽量使棉拭子擦到深部,并能刮取泄殖腔粘膜外表的滤泡，以获得足量的材料。病料的采取时间很重要，一般在感染初期或发病急性期采取。如转为后期那么因机体已形成足够的抗体而不易别离到病毒。死禽采集气管、脾、肺、肝、肾和脑等组织样品。小珍禽用拭子取样易造成损伤，可取而代之以采集新鲜粪便。病料的保存 病料应放在含有抗菌素

11、的pH值7.07.4的等渗PBS内无PBS可用25%50%的甘油盐水，假设短时间内不能处理可于低温条件下冻存。 琼脂扩散AGP试验 AGP试验用抗原是用所有A型禽流感病毒共有的核蛋白NP抗原制成的，可以用来检测所有A型流感病毒目前有15种血凝素亚型产生的抗体。该方法只适用于未免疫鸡群禽流感抗体的监测，方法简单、操作方便，但敏感性稍差。注意：1、该方法不适用于水禽血清抗体的检测，水禽禽流感抗体检测应该用HI试验。2、配琼脂时应先将琼脂充分溶化后再放入盐，否那么琼脂不易溶解。AGP试验结果1234567 血凝HA血凝抑制HI试验 该方法适用于禽流感病毒血凝素亚型的鉴定以及感染或免疫后血清中抗体的检

12、测，敏感性比AGP试验高，但只有当抗原和抗体的血凝素亚型完全一致时才会出现HI现象。 进行禽流感的监测时，当HI抗体在判定标准的可疑范围之内时，需一周后再采血进行检测。 对于免疫鸡，可以采集发病期及发病2-3周后的血清作比照检查，测其抗体水平，如果康复期的血清抗体较发病初期升高4倍以上，可以认为是禽流感发生。 进行血清学检测时首先要了解该鸡群的免疫状况，防止简单地将疫苗抗体误认为是感染抗体。注意：反响温度不能太高，假设在37 如温箱下进行，会影响检测结果，应在25 以下的室温或在4冰箱中作用。NASBA、RT- PCR诊断技术 NABSA方法可用来进行H5禽流感病原的快速检测，香港在1997年

13、发生H5禽流感感染人事件后，加强了对该病的监测，在世界上率先使用这一方法，在全国兽医界，浙江率先使用。RT-PCR灵敏度相对较差，从病料中的检出率较低，但检测尿囊液有足够的灵敏度，并且可以通过对HA裂解位点的序列分析对毒株的致病性做出初步判断，以便争取时间在短时间内采取措施。同时，对PCR产物进行序列分析，可以进行禽流感病毒分子遗传变异的比较。 禽流感的预防和控制疫苗免疫 疫情监测及检疫 及时发现和扑灭疫情 综合防治 疫苗免疫概述疫苗免疫是预防和控制禽流感最经济、最有效的途径。 禽流感病毒抗原具有多样性，各亚型之间的抗原性存在一定的差异，亚型间缺乏坚强的交叉保护作用。 我国主要流行的是H5和H

14、9亚型禽流感，目前必须而且只需做好H9和H5亚型禽流感的预防工作。 对鸡群进行大范围的免疫、增强对外来病毒侵袭的抵抗能力的同时，必须做好水禽H5亚型禽流感的防疫工作，不仅可以减少水禽本身的发病率和死亡率，而且可以减少带毒水禽对环境的污染及对鸡的传播。 出口肉禽原那么上是不能进行禽流感疫苗免疫的(香港除外)。所用疫苗必须是经农业部批准使用的禽流感疫苗H5、H9，由省级动物防疫监督机构统一组织供给。 影响疫苗免疫效果的因素 疫苗质量是疫苗保护率上下的决定性因素，主要包括疫苗中血凝素抗原的含量、乳化剂的选择及乳化的生产工艺等；对于禽流感疫苗来讲，最重要的是所用疫苗中病毒的血凝素亚型必须与当地流行株的

15、亚型相一致，才能发挥该疫苗的高效免疫保护作用。 鸡群健康状况是影响疫苗免疫效果的又一重要因素，当鸡群曾经或正在感染某些疾病，尤其是一些免疫抑制病如法氏囊、网状内皮组织增生症、禽白血病和鸡传染性贫血等病会严重干扰疫苗的免疫效果。 鸡的日龄和品种的不同，对疫苗免疫的敏感性也不一致，HI抗体产生的时间和所能到达的高度也存在差异。禽种苗别第一次免疫第二次免疫第三次免疫第四次免疫日龄剂量ml/只日龄剂量日龄剂量日龄剂量蛋鸡、种鸡H5、H9140.3420.5120-1400.5260-2800.5商品、肉鸡H5、H9100.3250.5种鸭H5140.5421.0120-1401.0260-2801.0

16、种鹅H5140.5421.0150-1701.5260-2801.5禽流感疫苗参考免疫程序 关于禽流感疫苗的几个问题 抗体产生期：7天产生HI试验可检测到的抗体，但21天才能产生坚强的免疫保护力，对强毒攻击的抗死亡保护率达100%。免疫后21天，H5亚型HI平均抗体价在5.5log2以上， H9亚型HI平均抗体价在6.0log2以上。 HI抗体保护的临界值：HI抗体大于或等于5.0log2以上时可完全保护，等于 4.0log2时大局部保护。 同一毒株制成的疫苗是否可以同时用于其它家禽： 首先，从抗原性分析及氨基酸序列分析上，不同宿主来源的H5亚型禽流感病毒并无明显差异。其次，我们曾分别用鸡、鸭

17、和鹅源毒株制成疫苗，分别免疫鸡后进行交叉攻毒，各疫苗均具有坚强的交叉免疫免疫力。疫情监测及检疫监测方法未经免疫区域：以流行病学调查、血清学监测为主包括琼脂扩散试验、血凝抑制试验等方法，结合病原别离和毒型鉴定、毒力鉴定进行监测。免疫区域：以病原学监测为主，结合血清学监测。 监测对象：所有易感禽类。 产地监测：定期按比例抽样检测。流通环节监测：对交易市场、禽类屠宰厂场、异地调入的活禽和禽产品进行不定期的病原学和血清学监测。尤其要严格管理好活禽交易市场，这是禽流感病毒非常好的蓄积地，这些市场集中了不同地区的各种家禽，是促进不同种畜禽直接接触感染的有效途径；污染的鸡笼、蛋箱等可携带病毒在市场和养鸡场之

18、间不断移动而导致病毒的传播，鸡贩子通过市场或集市贩运、贩卖病淘鸡，更可造成远距离的扩散。 监测中发现因使用未经农业部批准的禽流感疫苗而造成血清学阳性禽群，一律按发生禽流感疫情处理。引种检疫 国内异地引入种禽及精液、种蛋时，应领先到当地动物防疫监督机构办理检疫审批手续且检疫合格。引入的种禽必须隔离饲养21天以上，并由动物防疫监督机构进行检测，合格前方可混群饲养。 从国外引入种禽及精液、种蛋时，按国家有关规定执行。 及时发现和扑灭疫情疫情报告 任何单位或个人发现可疑高致病性禽流感疫情时，必须立即向当地县级防治禽流感领导小组办公室报告。疫情报告包括疫情发生的时间、地点、发病品种、日龄、死亡数量、临床

19、病症、生产和免疫接种情况。 疫情通过专渠道上报，县级在接到报告并进行初步诊断后，应立即分别向同级人民政府和上级防治禽流感领导小组办公室报告。在省级专家现场诊断及实验室检测后，可判定为疑似病例。要求政府启动应急预案，同时上报农业部，采集病料送国家指定的参考实验室确诊。及时报告，把疫情限制在最小范围之内。对于发生疫情的养殖者本身及其他养禽业者以及对于国家都是有利的。疫情公布国务院畜牧兽医行政管理部门统一管理并公布全国动物疫情。未经许可，禁止其它任何单位和个人以任何形式对外发布疫情信息。 高致病性禽流感确实认有以下情况之一的，可确认为高致病性禽流感：1、有典型的临床病症和病理变化，发病急、死亡率高，

20、且能排除鸡新城疫和中毒性疾病，血清学检测阳性。2、未经免疫的家禽出现H5、H7亚型禽流感血清学阳性。3、在禽群中别离到H5、H7亚型禽流感病毒株或其它亚型高致病力禽流感毒株。4、发生可疑疫情时，由国家指定的2名或2名以上禽流感现场诊断专家到现场诊断确认的。 疫情处理发现疑似高致病性禽流感疫情时，畜主应立即将病禽场隔离，并限制其移动。当地动物防疫监督机构接到疫情报告后，要在6小时内赶赴现场，进行调查核实，包括流行病学调查、临床病症检查、病理解剖等作出初步诊断，并采取相应措施；同时采集病料送有关实验室进行确诊。必要时由国家指定省级现场诊断专家到现场进行诊断确认。 1、划定疫点、疫区、受威胁区2 、封锁3、扑杀4、无害化处理5、紧急免疫6、消毒 7、紧急监测8、疫源分析与追踪调查 9、封锁令的解除 10、处理记录 综合防治 预防禽流感的发生，不应该仅仅依赖于疫苗的免疫，平时还必须认真实施、贯彻好综合防治措施。加强饲养管理，提高环境控制水平 饲养、生产、经营场所必须符合动物防疫条件，取得动物防疫合格证。饲养场