高效液相色谱法改动通用PPT课件

1、高效液相色谱法改动 20.1 概述20.2 高效液相色谱法的分类与基本原理 20.2.1 高效液相色谱法的分类 20.2.2 基本原理20.3 各类高效液相色谱法 20.3.1 液固吸附色谱法 20.3.2 液液分配色谱法 20.3.3 化学键合相色谱法 20.3.4 其他色谱法20.4 固定相 20.4.1 液固色谱固定相 20.4.2 化学键合相 20.4.3 其他固定相20.5 流动相（溶剂系统） 20.5.1 分离方程式 20.5.2 Snyder溶剂分类 20.5.3 正相洗脱与反相洗脱 20.5.4 洗脱方式 20.5.5 流动相最优化方法简介20.6 高效液相色谱仪 20.6.1

2、 输液泵 20.6.2 色谱柱与进样器 20.6.3 检测器 20.6.4 超高效液相色谱仪20.7 定性、定量分析方法 20.7.1 定性分析方法 20.7.2 定量分析方法高效液相色谱法概述 高效液相色谱法 HPLC （high performance liquid chromatograph） 高压输液泵 高效固定相 高灵敏度检测器高效液相色谱法与经典液相色谱法的比较 见表高效液相色谱法与GC的比较 见表 高效液相色谱法的 分类与基本原理20.2.1 高效液相色谱法的分类按固定相的聚集状态： LLC和LSC按分离机制： 分配、吸附、离子交换（IEC）、空间排阻（SEC）、亲合（AC）、手

3、性（CC）、胶束（MC）、电色谱法（EC）。HPLCLSCLLCNLLC和RLLCBPC（狭）RBPCNBPCISC一般RBPCPICIEC一般IECICAA（氨基酸分析法）SECGPC和GFCAC（亲和）MC（胶束）CC（手性）20.2.2 高效液相色谱法的基本原理HPLC的范氏方程：讨论： 涡流扩散项：填料和填充均匀程度高效液相色谱柱的装填纵向扩散项传质阻力项温度一般为室温 选甲醇、乙腈粘度小的溶剂粒径综上所述，HPLC应采用：1)采用小粒径、窄粒度分布的球形固定相，首选化学键合相，用均浆法装柱；2）采用低粘度流动相，低流速（1ml/min)；3）柱温一般以2535度为宜。太低，则流动相的

4、粘度增加，温度高易产生气泡。流速分析型HPLC一般流量为1mL/min。各类高效液相色谱法20.3.1 液固吸附色谱法分离机理 溶质分子与流动相分子竞争吸附吸附剂表面吸附活性中心，靠溶质分子的分配系数（容量因子）不同而分离。影响容量因子的因素 溶质分子的极性 溶剂的极性 硅胶的活性若以硅胶为固定相： 洗脱剂：以烷烃为底剂，加适量极性调整剂组成的二元或三元流动相。流动相应该不含水。20.3.2 液液分配色谱法分离机理 靠样品组分溶入固定相与流动相达到“平衡”后分配系数的差别而分离。正、反相液液色谱法 注意流出顺序。 目前，物理涂渍的液液色谱几乎已被化学键合相所取代。20.3.3 化学键合相色谱法

5、 将固定液的官能团键合在载体表面，就构成化学键合相。以化学键合相为固定相的色谱法称为化学键合相色谱法，简称键合相色谱法（bonded phase chromatograph，BPC）化学键合相的优点 均一、稳定；不易流失，使用周期长；柱效高；重现性好。反相键合相色谱法（RBPC或RHPLC） 固定相：在载体表面键合含弱极性或中等极性的基团，如十八烷基硅烷（C18）（ODS柱）、辛烷基（C8）、甲基（CH3）、苯基等。流动相：以水做主体，加适量的极性调节剂增加选择性如甲醇、乙腈、四氢呋喃等。 出峰顺序： 极性强的组分先出柱，极性弱的组分后出柱。分析对象： 分离非极性至中等极性的各种分子型化合物。

6、影响保留时间的因素： 溶质的分子结构： 极性越弱，保留时间越长。 流动相的表面张力、介电常数和pH值： 对于二元或多元体系改变溶剂的配比可改变流动相的表面张力和介电常数。通常，流动相中有机溶剂含量增加，k变小。例如：在水甲醇体系中增加甲醇的量，可降低表面力和介电常数，使容量因子变小。正相键合相色谱法 固定相：在载体表面键合含中等极性或较强极性的基团，如氰基（CN）、氨基（NH3）、或二羟基等。 流动相：以非极性或弱极性的溶剂如己烷、庚烷等为主体，加适量的极性调节剂增加选择性如乙醚、氯仿、二氯甲烷等。出峰顺序： 极性弱的组分先出柱，极性强的组分后出柱。影响保留时间的因素： 键合相的种类、流动相的

7、强度、试样的性质。 流动相的极性增强，洗脱能力增加，保留时间缩短。适应范围： 分离溶于有机溶剂的极性至中等极性的分子型化合物。反相离子对色谱法（RPIC）写成通式：表：反相离子对色谱的离子对试剂序号反离子种类主要应用对象1季铵盐（如四丁基铵磷酸盐TBA、溴化十六烷基三甲基铵（CTAB）强酸、弱酸、磺酸染料、羧酸、氢化可的松及其盐2叔铵（如三辛铵）磺酸盐、羧酸等3烷基磺酸盐（如甲基、戊基、己基、庚基、樟脑磺酸盐）强碱、弱碱、儿茶酚胺、鸦片碱等4高氯酸胺5烷基磺酸盐（如十二烷基磺酸盐、正庚烷基磺酸钠（PICB7)与3类似，选择性不同离子对色谱法的适用对象： 用于有机酸、碱、盐的分离，以及用离子交换

8、色谱法无法分离的离子型和非离子型化合物的混合物的分离。离子抑制色谱法 （ion suppression chromatograph，ISC） 在反相色谱法中，通过向流动相加入少量弱酸（常用乙酸）、弱碱（常用氨水）或缓冲盐（常用磷酸盐及乙酸盐）来调节流动相的pH，抑制样品组分的离解，增加它在固定相中的溶解度，以达到分离有机弱酸、弱碱的目的，这种技术称为离子抑制色谱法。调节pH范围：27.5 pH8.0 破坏键合相与载体的结合 pH8）不稳定；在孔隙中大分子扩散困难，降低柱效；硅胶表面上的剩余硅羟基对分离有影响。 目前研制的基质有：氧化铝、氧化锆、氧化钍和氧化钛。主要掌握正相和反相键合相： 键合的

9、基团的极性及适用情况。 表：反相HPLC常用的化学键合相类型牌号名称官能团粒度/m形状说明长链YWG-C18H37C18硅烷10非球形Partisil ODSC18硅烷5，10非球形5CZprbax ODSC18硅烷6球形15C短链LiChrosorb RP-8C8硅烷5，10非球形1314CYWG C6H6苯基硅烷10非球形7CLiChrosorb RP-2二甲基硅烷5，10非球形5C键合相的性质和特点 含碳量： 指键合在硅胶表面上的烷基所含碳的质量分数，随链长增长，从322。 覆盖度： 指硅胶被键合后，在硅胶中的有效羟基与硅烷试剂反应的程度，在键合后有时还用短链的硅烷试剂与剩余和新产生的羟

10、基反应，使羟基全部被”帽盖“（即封尾）而不起作用。 键合相的特点： 使用过程中不流失； 化学稳定性好； 适于梯度洗脱； 载样量大。流动相（溶剂系统）HPLC对流动相的要求： 不与固定相反应；对试样有适宜的溶解度，k在110之内，最好在25之间；与检测器相适应；纯度高，粘度小。 使用前滤过，脱气。20.5.1 分离方程式 讨论：主要受溶剂种类的影响；在溶剂组成确定后，k主要由溶剂的配比所左右。20.5.2 Snyder溶剂分类 Snyder选择了3个参考物质，用于检验溶剂的3种分子间作用力，分别用Xe、 Xd、 Xn表述。 表：参考物与被检溶剂间的作用力参考物乙醇（质子给予体）二氧六环（质子受体

11、）硝基甲烷（强偶极）被检溶剂的作用力类型质子受体作用力(Xe)质子给予体作用力(Xd)强偶极作用力(Xn) 描述溶剂极性用Snyder提出的溶剂极性参数P来衡量。表：常用溶剂的极性参数和选择性参数溶剂PXeXdXn正戊烷0.0-乙醚2.80.530.130.34二氯甲烷3.10.290.180.53氯仿4.10.250.410.33甲醇5.10.480.220.31 可将81种色谱溶剂，按Xe、 Xd、 Xn在三角形坐标图上的相邻关系分为8类。 选择不同组别的溶剂，分子作用力不同，容易使改变，利于分离。20.5.3 正相洗脱与反相洗脱 溶剂洗脱强度指流动相中溶剂的洗脱能力, 它不仅与流动相，而

12、且与固定相的极性有关。在正相色谱中, “溶剂洗脱强度”与溶剂极性成正比；而在反相色谱中，溶剂极性越大, 洗脱能力越小。 反相键合相色谱法的溶剂强度用另一强度因子S表示。表：反相色谱常用溶剂的强度因子S水甲醇乙腈丙酮二噁烷乙醇异丙醇四氢呋喃03.03.23.43.53.64.24.5混合液设计统计技术： 根据溶剂选择性分组，选具有显著选择性差异的溶剂。 反相：水为底剂，甲醇、乙腈和四氢呋喃为选择性溶剂。 正相：已烷或戊烷为底剂，乙醚、氯仿和二氯甲烷为选择性溶剂。混合溶剂的强度20.5.4 洗脱方式等度洗脱： 在一个分析周期内流动相组成保持恒定，适合于组分数目较少、性质差别不大的试样。梯度洗脱（程

13、序洗脱） 在一个分析周期内程序程序控制改变流动相的组成，如溶剂的极性、离子强度和pH值等，可使一个复杂样品中性质差异很大的组分，能在各自适宜的分离条件（容量因子k适宜）下分离。梯度洗脱能缩短分析时间、提高分离度、改善峰形、提高检测灵敏度。高效液相色谱仪总 图高压泵 主要部件之一，压力：150350105 Pa。 应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性梯度淋洗装置 外梯度: 利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。 内梯度: 一台高压泵, 通过比例调节阀,将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。进样装置流路中为高压力工作状

14、态， 通常使用耐高压的六通阀进样装置， 其结构如图所示：高效分离柱 柱体为直型不锈钢管，内径16 mm，柱长540 cm。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。液相色谱检测器 紫外检测器 应用最广，对大部分有机化合物有响应。 特点： 灵敏度高；线形范围高； 流通池可做的很小（1mm 10mm ，容积 8L）； 对流动相的流速和温度变化不敏感； 波长可选，易于操作； 可用于梯度洗脱。（参照书P539：截止波长）荧光检测器（FD） 灵敏度比紫外检测器高，选择性好，但只能适合于能产生荧光的物质（或通过衍生化能产生荧光的物质）的检测。电化学检测器： 包括极谱、库仑、安培和电导检测器。 安培检测器可检测具有氧化还原活性（能发生电极反应）的物质，灵敏度高。蒸发光散射检测器（ELSD）： 是通用型的检测器。它适合于检测挥发性低于流动相