抗体工程制药PPT通用课件

1、第四章 抗体工程制药 教学目标：掌握抗体药物制备的基本原理和技术。教学要求：了解免疫现象和抗体药物制备的发展简史，了 解基因工程抗体和抗体工程技术的基本内容；理解抗 体药物的结构和生物学活性与单克隆抗体靶向制剂的 研究意义；掌握单克隆抗体的基本概念与制备原理和 鼠源性单克隆抗体的改造方法。教学重点：单克隆抗体的基本概念与制备原理和鼠源性单 克隆抗体的改造方法。教学难点：抗原表位的概念、单克隆抗体的制备原理。 Contents of chapter 41、概述 2、单克隆抗体的制备 3、鼠源性单克隆抗体的改造 4、基因工程抗体和抗体工程 GoGoGoGoGo5、抗体药物 “疫”：流行性传染病，免

2、疫即免于发生传染病。尽管近代才出现“免疫”这个词，但是人们在远古时代就已认识了免疫现象。公元前5世纪希腊半岛的战史中，描述了在传染病流行时，由患过该病的人来护理病人和埋葬尸体的事例。公元384年，晋朝葛洪在肘后备急方中记载“疗狂犬咬人方，乃杀所咬犬，取脑傅之，后不复发” 。4.1 抗体工程制药概述1、有关免疫学知识 免疫是机体对异种、异体及自身物质所产生的反应，即机体“自我识别，排除异己”，以达到自身稳定的一种复杂的生理性保护，并且与人体的胚胎发育、疾病发生、衰老等一系列的生命过程有密切关系，是人体进化的结果。 免疫学是研究人类和实验动物体内、外免疫反应的本质及其变化规律的科学。 免疫系统是由

3、淋巴器官（胸腺、骨髓、淋巴结、脾和扁桃体）、淋巴组织以及免疫细胞（淋巴细胞、浆细胞和巨噬细胞）借助血液和淋巴循环相互联系而组成的功能系统。 T淋巴细胞（表面有抗原识别受体）巨噬细胞 B淋巴细胞（表面有抗原识别受体）人体内三种主要的免疫细胞巨噬细胞B细胞T细胞抗原识别受体目标对象作用方式无有（表面有1000个抗原识别受体，有特异性）有（表面有10万个抗原识别受体，有特异性）几乎所有的抗原类物质如细菌、病毒、衰老细胞。体液中的抗原（部分病毒除外），如细菌。吞噬或感染了病毒等抗原的细胞、外来器官等。吞噬产生抗体释放细胞毒素三种免疫细胞的比较外源蛋白、细菌、病毒等抗原B细胞作用过程(体液免疫)浆细胞B

4、细胞产生抗体抗体使抗原失去活性特异抗原识别受体T细胞作用过程（细胞免疫）感染了抗原的细胞或吞噬了抗原的巨噬细胞，外来细胞。T细胞活性T细胞产生细胞毒素攻击受感染细胞。受感染细胞死亡 自然被动免疫 母体的特异性抗体IgG通过胎盘或初乳中的分泌型IgA进入胎儿体内或婴儿体内，使胎儿或婴儿被动的获得母体抗体的方式。 婴儿在出生后6个月内很少得传染病，是从母体获得被动免疫的结果。 自然自动免疫 在自然条件下，人体被病原体感染后所获得的免疫力。这种免疫可以通过得传染病获得，也可经过隐性感染获得。宋朝（十一世纪）时吸入天花痂粉预防天花 ；明代（公元十七世纪七十年代左右）接种“人痘”，预防天花； 十八世纪后

5、叶，英国乡村医生Jenner种“牛痘”预防天花。 病原菌致病与疫苗十九世纪中叶，显微镜的改进导致病原菌的发现；1850年在羊的血液中看到炭疽杆菌；Pasteur证明实验室培养的炭疽杆菌能使动物感染致病； Koch提出病原菌致病的概念； 正式认识Jenner的接种牛痘苗、预防天花的科学性和重大意义。 人工自动免疫 用人工接种的方法向机体输入抗原性物质，使机体自己产生特异性免疫力。 免疫力出现较慢，人工接种后需经14周诱导期方可产生；但维持时间达半年到数年不等，主要用于传染病的特异性预防。 白喉造成人类疾病有2500年的历史，十八世纪初，在新英格兰的白喉大流行，使得2.5的人口死亡，有三分之一的儿

6、童死亡。在类毒素治疗发明之前，白喉是15岁以下儿童的三大死因之一。 1884年，首次分离出白喉杆菌，白喉杆菌是一种革兰氏阳性杆菌，在有氧及37的环境下，生长良好。 人的鼻咽部若受到白喉杆菌感染，会产生毒性很强的外毒素，抑制正常细胞蛋白质合成，引起局部组织破坏及形成白色膜状物，毒素可经由血液到达全身，主要造成心肌炎、神经炎，血小板低下及蛋白尿。十九世纪八十年代后期，发现白喉杆菌经其分泌的白喉外毒素致病；随后发现再感染者的血清中有“杀菌素”-抗体；1890年， Behring和Kitasato用白喉抗毒素治疗白喉病人。 Behring（德）和 北里柴三郎(日)用白喉脱毒外毒素注射马等动物，在动物血

7、清中发现了一种能中和白喉外毒素的物质，称为抗毒素。 以抗毒素对白喉患者进行治疗，发现此种中和毒素的能力能被动地转移给正常动物，使后者获得抗白喉毒素的免疫力，因此称这种方法为人工被动免疫法。此后很多人从免疫动物或传染病病人血清中发现了多种能和微生物或其产物发生结合反应的物质，通称为抗体，而引起抗体产生的物质称为抗原。抗原和抗体因能发生特异性结合，为诊断传染病建立了血清学诊断方法。此二人在1901年共同获得诺贝尔生理和医学奖。人工被动免疫 采用人工方法向机体输入由他人或动物产生的免疫效应物，如免疫血清、淋巴因子等，使机体立即获得免疫力，达到防治某种疾病的目的。 特点是产生作用快，输入后立即发生作用

8、。但由于该免疫力非自身免疫系统产生，易被清除，故免疫作用维持时间较短，一般只有23周。主要用于治疗和应急预防。2、抗原 能刺激人或动物机体产生抗体或致敏淋巴细胞，并能与这些产物在体内或体外发生特异性反应的物质。抗原的基本性质具有异物性、大分子性和特异性。ABO血型：红细胞表面的糖蛋白末端寡糖的特点决定了它的抗原性。3、抗体是免疫球蛋白 抗体是能与相应抗原特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。二十世纪三十年代，Tiselius和Kabat用电泳研究血清蛋白。动物免疫后，血清中-球蛋白显著增高。-球蛋白有Ab活性。4、多克隆抗体的制备 抗淋巴细胞多克隆抗体的制备 采用人的淋巴细胞、胸腺细胞或脾细胞作为

9、抗原，经过处理后接种到异种动物如马或兔体内，使其致敏产生各种针对人的淋巴细胞表面不同抗原决定族的多样抗体，然后再将所采集的动物血清经过一系列的分离、提纯等处理，去除无关的其它杂抗体，从而获得精制的抗淋巴细胞的多种免疫球蛋白（IgG）。 器官移植后的排斥反应是宿主T细胞被外来移植物抗原刺激活化之后所介导的免疫反应。而T细胞的完全活化必须具备三个外来信号，即由抗原提呈细胞（APC）提供的移植物抗原（第一信号）和共刺激因子（第二信号）以及T细胞自分泌或旁分泌的促生长因子（第三信号）。这三个信号的糖蛋白分子都必须与T细胞表面的受体或配体结合，才能传递活化信号，引起T细胞的活化与克隆增殖。 抗淋巴细胞多

10、克隆抗体主要通过阻断抗原与淋巴细胞的结合、杀灭和清除淋巴细胞来实现免疫抑制效应。但由于每批次产品制作所用的抗原（淋巴细胞）不同，或提纯过程的流水线生产差异，不同批次的多克隆抗体产品间存在差异，疗效不一。此外，多克隆抗体对淋巴细胞无关的抗原（包括血小板、红细胞）可发生交叉反应而导致全血象的降低。 PcAbMcAb基因工程抗体抗体组药物 利妥昔单抗 Rituximab是1997年美国FDA批准的、用于治疗B细胞非霍杰金氏淋巴瘤，已达30多万例病人。治疗总有效率为50%，其疗效与化学药物相同，但更安全，几乎无副作用，抗体联合化疗有效率高达80%以上。 Rituximab 500mg/支的价格为210

11、00元左右，尽管价格高，但却供不应求，2005年市场销售额近32亿美元。据统计，2005年治疗性和诊断性抗体的销售额大约为150亿美元，治疗性抗体的销售达到120亿美元。 1、单克隆抗体的原理 骨髓瘤细胞在体外培养能无限增殖，免疫的B淋巴细胞能产生特异性抗体，细胞融合后形成杂交瘤细胞；HAT培养基选择性培养杂交瘤细胞；微量蛋白质检测技术筛选出能产生特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞。4.2 单克隆抗体的制备 2、单克隆抗体的制备过程 抗原制备、免疫动物免疫脾细胞和骨髓瘤细胞的制备细胞融合杂交瘤细胞的选择培养、杂交瘤细胞的筛选杂交瘤细胞的克隆化 单克隆抗体的检定分泌单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立单克隆抗

12、体的大量制备动物体内诱生法体外培养法单克隆抗体的纯化 1982年，美国斯坦福医学中心的科学家用小鼠制备的单克隆抗体治疗B细胞淋巴瘤，治疗后患者的病情缓解、瘤体消失。 1986年，美国FDA批准世界上第一个单克隆抗体药物莫罗单抗-CD3（OKT3）进入市场，用于器官移植时的抗排斥反应。在这个时期，抗体药物的研制和应用给人们治疗疾病带来了很大的期望。20年后的今天，单克隆抗体药物已经成为生物医药最重要的发展领域之一，到2006年，FDA共批准23个治疗性单克隆抗体药物。 OKT3单抗主要和T细胞表面的CD3抗原结合，而CD3分子是与T细胞受体（TCR）紧密相联在一起的一个复合体（TCR-CD3复合

13、体）。这样，OKT3就可通过封闭TCR而阻断由APC提呈的启动T细胞活化的第一信号（外来抗原）的结合。 OKT3的选择性好、特异性强，制剂和疗效较稳定，对急性排斥反应的逆转率可达8595%。 作业1、名词解释： 抗原、抗体、单克隆抗体。2、简述单克隆抗体的制备原理。3、简述单克隆抗体制备的基本过程。4.3 鼠源性单克隆抗体的改造 杂交瘤单克隆抗体均为鼠源性大量应用于人体可产生人抗鼠抗体改造鼠源性单克隆抗体的目的：降低免疫原性降低相对分子质量，增加组织通透性 一、免疫球蛋白的结构 B淋巴细胞在抗原刺激下增殖分化为浆细胞，浆细胞产生能与相应抗原发生特异性结合的免疫蛋白-Ab。抗体也称为球蛋白。19

14、68年和1972年将具有抗体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白统一命名为免疫球蛋白。 免疫球蛋白分为分泌型（SIg）和膜型（mIg）。SIg主要存在于血清及其他体液或外分泌液中，具有抗体的各种功能。mIg是B细胞表面的抗原识别受体。Ig是由两条相同的重链（H链）和两条相同的轻链（L链）通过链间二硫键连接而成的四肽链结构。 重链的分子量约为5075kD，由450550个氨基酸残基组成。重链恒定区的氨基酸的组成和排列顺序不同，其抗原性也不同。据此将免疫球蛋白分为五类，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，其相应的重链分别为链、链、链、链和链。根据Ig铰链区氨基酸组成和重链二硫键的数目和位置的差别

15、，同一类Ig可分为不同的亚类。 轻链的分子量约25 kD，由214个氨基酸残基构成。轻链分为(kappa)型和(lambda)型。天然Ig分子上两条轻链的型别总是相同。 两型轻链的功能无差异。 不同种属中，两型轻链的比例不同。:比例的异常可能反映免疫系统的异常 -人类免疫球蛋白链过多，提示可能有产生链的B细胞肿瘤。 可变区 ：重链和轻链靠近N端的约110个氨基酸的序列变化很大。 高变区 ：VH和VL各有三个区域的氨基酸组成和排列顺序特别易变化。 互补性决定区：三个高变区共同组成Ig的抗原结合部位，该部位形成一个与抗原决定簇互补的表面。骨架区：高变区之外区域的氨基酸组成和排列顺序相对不易变化。恒

16、定区：重链和轻链的C区分别称为CH和CL 。铰链区：位于CH1与CH2之间，含有丰富的脯氨酸，易伸展弯曲，易被木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等水解。 二、免疫球蛋白的功能区 VH和VL是结合抗原的部位。 HVR（CDR）是V区中与抗原表位互补结合的部位。 CH和CL具有部分同种异型的遗传标志。 三、免疫球蛋白的水解片段 木瓜蛋白酶水解片段。2个Fab段：抗原结合片段，由一条完整的轻链和重链的VH和CH1功能区组成，与抗原结合不能形成凝集反应或沉淀反应。Fc段：可结晶片段。Fc段相当于IgG 的CH2和CH3功能区，无抗原结合活性，是抗体分子与效应分子和细胞相互作用的部位。Ig同种型的抗原性主要存在于Fc

17、段。胃蛋白酶水解片段：双价 F(ab)2片段：与抗原结合可发生凝集反应和沉淀反应。 pFc： Ig的Fc段被胃蛋白酶裂解为若干小分子片段，失去生物学活性。 白喉抗毒素、破伤风抗毒素经胃蛋白酶消化后精制，因去掉Fc段而减缓发生超敏反应。 J链浆细胞合成； 富含半胱氨酸的一条多肽链；连接Ig 单体形成二聚体、五聚体或多聚体。 四、免疫球蛋白的生物学活性 识别并特异性结合抗原； IgM、IgG与抗原结合后，通过经典途径激活补体系统，产生多种效应功能：结合细胞表面的Fc受体； 调理作用 ：抗体、补体促进吞噬细胞吞噬细菌等颗粒性抗原的作用； ADCC ：抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用。表达Fc受体的细胞

18、通过识别抗体的Fc段直接杀伤被抗体包被的靶细胞； NK细胞是介导ADCC的主要细胞。 介导型超敏反应：IgE的Fc段与肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面的高亲和力IgE Fc受体结合，促使这些细胞合成和释放生物活性物质。穿过胎盘和粘膜： IgG是唯一能通过胎盘的免疫球蛋白； 是一种重要的自然被动免疫机制，对于新生儿抗感染具有重要意义。 五、抗体的治疗应用抗肿瘤抗感染抗器官移植排斥反应治疗自身免疫性疾病和变态反应性疾病六、McAb药物迅速发展的主要障碍人体免疫系统对鼠源蛋白的排斥反应。抗体人源化是解决问题的唯一途径降低相对分子量，增加组织通透性。细胞工程杂交瘤技术鼠单抗人单抗大鼠小鼠产量高、操作比小鼠麻

19、烦 少用易操作、多用HAMA反应人人杂交瘤人B细胞、骨髓瘤细胞融合人鼠杂交瘤人B细胞、鼠骨髓瘤细胞融合EBV转化人B细胞 单纯转化转化后融合与鼠骨髓瘤与人鼠杂交瘤杂交瘤制备人单抗的问题：染色体易丢失、抗体分泌不稳定 利根川进（1980）报告了B细胞分化发育过程中抗体基因结构的变化，阐明IgV区基因的重排与突变构成无限组合，推测抗体多样性达109-1011。4.3 基因工程抗体和抗体工程 一、抗体基因多样性二、基因工程抗体及其制备 目的：一是降低免疫原性；二是降低相对分子量，增加组织通透性。 原理：抗体同抗原结合的功能决定于抗体分子的可变区（V），异种抗原性则决定于抗体分子的稳定区（C）。 1、

20、人-鼠嵌合抗体（chimeric antibody）：在基因水平上把鼠源性单克隆抗体的H和L链的V区基因分离出来，分别与人Ig的H链和L链的C区基因连接，即成为人-鼠嵌合抗体的H和L链基因，再共转染骨髓瘤细胞，就能表达出完整的Chimeric Antibody. 2、改形抗体(Reshaping antibody)：Ig分子中参与构成抗原结合部位的区域是H和L链V区中的互补性决定区 (CDR区)。如果用鼠源性单克隆抗体的CDR序列替换人Ig分子中的CDR序列，则可使人的Ig分子具有鼠源性单克隆抗体的抗原结合特异性。这种改型抗体也称CDR移植抗体 。早期的改形抗体：简单的CDR移植，通过点突变进

21、行“微调”即更换某个位点上的氨基酸。 第二代改形抗体：使用了鼠人嵌合FR。其目的是获得具有高亲和力的治疗性抗体。 3、小分子抗体：基因工程小分子抗体仅表达鼠源性单克隆抗体的V区片段，其相对分子质量仅为原抗体的1/80-1/3。Fab片段抗体：VH+CH1+L。 FV抗体：VH+VL。单链抗体：VH-Linker-VL。单域抗体：VH或VL。最小识别单位：单个CDR区。单链抗体 人工合成一段DNA片段，以VL-衔接物-VH的顺序连接上VL和VH的DNA序列，构成嵌合基因； 在大肠杆菌中表达，纯化；单链蛋白具有抗体结合亲和性和特异性。 单链抗体体积小，免疫原性较低，渗透性好，能有效地穿透致密的肿瘤

22、屏障，有利于实体瘤的诊断和治疗。构建双功能分子 -生物导弹 单链抗体是“导航系统”； 药物蛋白是“炸弹” 。4、多功能抗体及其制备1）双功能抗体：双特异性单链抗体，是一种非天然性抗体，其结合抗原的两个臂具有不同的特异性。如一个Fab片段结合肿瘤特异性抗原，另一个则结合杀伤性T细胞，识别和消灭肿瘤细胞的功能统一在一个单链抗体分子上。2）多功能抗体：结合性能良好的单链抗体的多聚体。3）抗体融合蛋白：从广义讲应属于双功能抗体范畴。小结：单抗研发的演变历程鼠单抗100% 鼠源OKT-3PanorexZevalin鼠/人崁合单抗(66-75 % 人源)ReoPro, RituxanRemicadeSim

23、ulect人源化单抗(90-95 % 人源)Zenapax, Mylotarg, Herceptin, CampathSynagis100% 人源 用SCID小鼠制备人单抗SCID小鼠移植入人淋巴细胞 （人鼠嵌合模型）抗原免疫杂交瘤技术基因工程人单抗人抗体鼠将小鼠Ig基因灭活然后转入人Ig基因，生产出人单抗遗传工程鼠 最理想的单克隆抗体：100%人源；人类免疫系统自然产生。 全人抗体面临的关键问题：抗体分泌细胞的保持。 25年来的全人抗体的尝试鼠骨髓瘤不适合与人B细胞融合 稳定性差 抗体产量低 非洲淋巴细胞瘤病毒 (EBV) 保存抗体分泌细胞细胞株不稳定抗体的产量低不能特异性地保存抗体分泌细胞

24、很难获得人类骨髓瘤细胞株 全人抗体技术的最新突破 成功建立人骨髓瘤细胞系Karpas707H ，人源抗体进入新的里程用 途：能稳定的保持人B细胞分泌抗体的能力发明人：英国剑桥大学的Dr Karpas教授意 义：1 在整体水平上研究人类产生的抗体 2 开创人类抗体基因组学的研究评 价：1 诺贝尔奖得主Dr Milstein 推荐发表在PNAS2 世界权威杂志“科学”发表了新闻评述3 剑桥大学开了新闻发布会 基因工程抗体，即按不同的需要，将抗体的基因进行加工、改造和重新装配，然后再导入到适当的受体细胞内进行表达的抗体分子，这也就是第三代抗体。基因工程抗体具有的优点 通过基因工程技术的改造，可降低甚

25、至消除人体对抗体的排斥反应；基因工程抗体的分子量较小，可部分降低抗体的鼠源性，更加有利于穿透血管壁，进入病灶的核心部位；根据疾病的类型和部位，制备新型抗体；可采用原核细胞、真核细胞和植物等多种表达方式，大量表达抗体分子，大大降低生产成本。 自1986年以来，北京安波特基因工程技术有限公司连续承担四个五年期国家科技部“863”抗体类生物治疗肿瘤药物研究项目；目前已取得了国际、国内首次发表的14项领先研究成果；申请了四项专利。 四、噬菌体抗体库技术phage antibody library定义： 通过PCR将全套人抗体重链和轻链V区基因克隆出来，并在噬菌体表面表达、分泌，经筛选后获得特异性抗体。

26、 1、在噬菌体中表达免疫球蛋白基因的原理 大肠杆菌丝状噬菌体M13、fd、f1等，属于丝杆噬菌体科、丝杆噬菌体属，含一个单链环状DNA分子；DNA外螺旋状排列着5种外壳蛋白：蛋白位于丝状噬菌体的管状部分；蛋白、和分别位于两端。常将外源基因与外壳蛋白的基因连接，形成融合蛋白。 2、重组噬菌体生产抗体从小鼠或人的B细胞中分离出mRNA；反转录成cDNA；设计两对特殊的引物，通过PCR将编码重链和轻链的cDNA扩增出来；用特定的限制性内切酶酶解扩增出来的cDNA片段；cDNA片段克隆进入丝状噬菌体质粒载体中，与单链丝状噬菌体外壳蛋白或的基因连接形成融合基因；经过辅助噬菌体感染后，抗体功能片段与外壳蛋

27、白一起表达在重组丝状噬菌体的表面；通过免疫亲和层析的方法或用ELISA的方法，筛选出抗原特异性抗体。 3、组合抗体文库技术 重链和轻链的cDNA都有各不相同的限制性内切酶酶切位点； 将每一序列（大量不同的抗体基因）都定向克隆进一单独的丝状噬菌体载体并在裂解循环中表达；形成一个可以用以筛选特异抗原结合活性的组合丝状噬菌体文库。 哺乳动物的B细胞可以产生约106-108个不同的抗体；一个噬菌体文库含有相同数量级的克隆；因而一个抗体组合文库可以包括任何一种哺乳动物B细胞产生的各种抗体分子；对混合文库中的克隆可以进行人工突变。 4、噬菌体抗体文库技术的优点省去了单克隆抗体制备过程中许多费时费力的过程；

28、 使Ab的制备由细胞水平进入到基因水平，为解决人源单克隆抗体的制备提供了新的途径；重、轻链的随机组合提高了抗体的多样性。 5、Ab蛋白的附着型和分泌型表达在丝状噬菌体的外壳蛋白基因和外源抗体蛋白基因之间引入一个琥珀突变密码子UAG； 当丝状噬菌体感染有琥珀突变抑制的大肠杆菌株(如SupE)时，UAG密码子被解读为G1u，Ab蛋白就以融合蛋白的形式附着于噬菌体表面；在非琥珀突变抑制的大肠杆菌菌株中表达时，UAG密码子被解读为终止密码子，Ab蛋白以可溶性蛋白的形式被分泌到细菌体外。 6、抗体的表达系统 哺乳动物细胞表达哺乳动物细胞是真核细胞；具有对表达的蛋白进行正确的加工和翻译后修饰的能力；可以将

29、抗体分泌表达。 细菌表达生产抗体分子片段最为有效的系统 表达的抗体分子不能糖基化、组装错误、不能形成正确的二硫键等易形成不溶且不具活性的蛋白包涵体酵母、植物细胞、昆虫细胞7、随机多肽文库 又称人工合成抗原决定簇文库 人工合成构建编码随机肽段(一般在69肽之间)的基因； 噬菌体展示 ,构建一个多肽文库； 从文库中筛选能够模拟某些生物大分子生物功能与活性的短肽小分子。 EPO模拟小肽 随机合成8肽文库；通过ELISA的方法，用EPO受体筛选； EPO模拟肽段的功能完全可以模拟EPO分子。 抗原抗体特异性结合，在体内和体外均可呈显某种反应。在体内，可表现为溶菌、杀菌、促进吞噬或中和毒素等作用，故抗体

30、类药物可用于治疗。在体外，由于抗原性状和反应条件不同，可发生凝集或沉淀等可见反应，故可用已知抗体来鉴定抗原，做病原学诊断和血型测定，称为血清学鉴定。一、抗体诊断试剂 抗体诊断药物基本分为三类：血清学鉴定用的和免疫标记技术用的抗体制剂，以及体内导向诊断药物。4.4 抗体药物1、血清学鉴定用的抗体类试剂（1）鉴定病原菌用的抗体试剂 A、常用诊断血清的品种和用途 B、诊断血清的制备步骤 a、制备细菌抗原：细菌接种-培养-收集菌苔-制成菌液。 b、免疫动物和制备抗体血清：动物：家兔、马、羊、豚鼠。免疫途径：静脉、腹腔、皮下。接种次数3-7次，每次间隔3-4d，末次注射后6-8d取血样测效价，达到要求，

31、即可采血，离心分离血清。 C、诊断血清的诊断方法：直接凝集反应。（2）HBsAg的反向被动血凝诊断试剂A、试剂制备原理：红细胞经甲醛处理后，在酸性条件下能吸附蛋白质，当纯化的抗HBs血清吸附其上时便具有抗体活性，若待测样品中存在有HBsAg时，则发生特异性结合而使血细胞发生凝集。B、制备步骤：先用HBsAg免疫豚鼠-获得抗HBs血清-硫酸铵盐析/柱层析-取其 IgG -在pH4.0醋酸缓冲液中致敏醛化血细胞-洗去多余蛋白成分，用含1%兔血清的稀释液稀释至一定浓度，分装即成。C、诊断方法：在V型血凝板上进行，阴性样品不凝集，少许血细胞沉积于V型孔底部，呈尖点状；阳性样品血细胞凝集成块状。（3）妊

32、娠诊断试剂 妇女妊娠后，血液和尿液中的HCG(绒毛膜促性腺激素)含量增高，在3个月内可达到高峰。此时检测尿液中的HCG，就可确定是否怀孕。（4）抗ABO血型系统血清2、免疫标记技术用的抗体类试剂 给抗体标记放射性核素、荧光素或酶活性，能将抗原抗体反应放大，使常规不能观察的反应得以显现，可对微量抗原进行定性定量测定，灵敏度提高。结合显微镜技术，还可对抗原物质作出组织内或细胞内的定位测定。除临床诊断外，还能为探讨发病机制提供手段。（1）荧光抗体诊断试剂：荧光抗体是用荧光色素,如异硫氰酸荧光素（FITC）、罗丹明（RB200）、藻红素（PE）等标记抗体蛋白，即成荧光抗体。用荧光抗体浸染含有抗原物质的组织切片或细胞，荧光抗体就与抗原结合，在荧光显微镜下成为发光的可视物，从而达到诊断和定位的目的。 （2）免疫酶抗体诊断试剂：酶标诊断试剂 a、HBsAg酶标诊断试剂 b、HBeAg(乙型肝炎e抗原)酶标诊断试剂 c、HAVAg(甲型肝炎病毒抗原)酶标诊断试剂 d、测定HIV（人免疫缺陷病毒）抗原的酶标 诊断试剂 e、AFP（甲胎蛋白）酶标诊断试剂 f、CEA（癌胚抗原）酶标诊断试剂（3）放射免疫用抗体诊断试剂 把放射性核素分析的高灵敏性与抗原抗体反应的特异性两大特点结合起来建立的检测技术。能测出ng/ml，甚至pg/ml水平的微量抗原物质。A、HB