实验2研究生 pcr产物鉴定及pcr原理应用

1、生化与分子生物学技术1实验室秩序 （时间，物品保管，工作服，分组与值日）仪器与设备的使用实验室安全环保实验室管理与操作规程2实验二 apoB基因多态性分析-PCR产物电泳检测3 电泳的概念 带电粒子（胶体颗粒、离子等）在电场的作用下在特定的介质中向与其电荷性质相反的电极方向定向泳动的现象。 广泛应用于生物大分子的分离和鉴定4 实验室中常用到的电泳方法 （以介质分类） 纸电泳 醋酸纤维膜电泳 凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳 5 电泳的基本原理利用物质的两个差异来分离物质电荷差异 电荷性质 电荷数量分子差异 分子大小 分子形状6琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，沸水中溶解，45 开始形

2、成多孔性刚性滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同DNA的分子量大小、构象及电荷数不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带DNA显色剂多用EB，它能和碱基间的氢键结合，在波长为254nm365nm的紫外光照射下呈橘红色（530nm）的荧光。DNA琼脂糖电泳基本原理71.1 影响DNA在凝胶中迁移速率的因素 DNA分子的大小构象凝胶浓度电压缓冲液81.2 不同浓度琼脂糖的凝胶分离范围琼脂糖浓度（，W/ V ) DNA分子的有效分离范围（kb)0.7 0.8-100.9 0

3、.5-71.2 0.4-61.5 0.2-32.0 0.1-29一、电泳前准备准备内容作用1.刷干净电泳制胶的梳子，板子，槽子，蒸馏水洗净晾干防止不必要的重复污染，减少外来的污染。梳子干净有利于梳孔的形成。2.检查电泳槽，根据情况更换buffer排除电泳槽的电极接触不良，确保buffer的缓冲能力，减少污染。3.根据DNA的分离范围选择合适的胶浓度并记录达到较好的分离效果，防止样过快跑出胶或者是过慢浪费时间。4.计算agarose的用量和制胶 buffer的用量记录，胶最终越薄越好。实验记录备查10二、制胶步骤注意事项1.称量agarose和bufferBuffer不要用成H2O，称量相对准确

4、2.融胶，加热到胶产生大量的气泡时，拿出摇匀，继续加热到完全溶解，拿出摇匀，再加热到沸腾。非常热，小心烫手，另外注意不要加热过度使胶冲出瓶子。因此注意选择起码为胶体积2倍以上的瓶子。保证胶混匀和完全溶解，减少可能因此引起的胶中孔径不均匀影响分离效果。3.倒胶，可用水浴的办法使胶冷却到60度左右，即手可以握住瓶子的温度，沿着制胶板的一侧，缓缓地一次性倒入。梳子最好是预先放好并固定的，注意梳孔的体积能点的下所有的样。用枪头赶掉气泡。制胶的桌面相对水平。倒胶时尽量减少气泡的产生。EB如果在制胶时加入，在60度左右时加入，使终浓度为0.5ug/ml。不宜过低，染色成像不明显；不宜过高，导致背景太深。摇

5、匀要沿着瓶壁摇动，尽量减少气泡产生的可能性。高浓度胶例如2%以上的EB很难摇匀，而且凝的速度也相对快，强烈建议跑完胶之后再用EB染色。4.室温凝胶30分钟过程中不要碰到梳子，尽量保持胶的位置不移动。时间不宜过久，导致胶干燥变形；不宜过短，影响胶内部孔径形成。5.拔梳子，放入电泳槽。缓缓地将梳子垂直从梳孔拔出，尽可能使梳子是同时从各个胶孔拔出的。暂时不用的胶最好放入电泳槽电泳液中浸泡。电泳液要浸没胶1mm。11三、上样电泳步骤注意事项1.样品中加入loading buffer使其终浓度为1 X，混匀Loading buffer浓度不宜过低，点样时样品不能很好的沉在胶孔里；不宜过高，电泳时容易形成

6、带形的变形。注意混匀。2.点样沿着胶孔的边缘匀速加入。尽量避免碰坏胶孔。枪头不要吸过多的气泡，拔起时不要过猛带出样品。每点一个样完，吸取buffer洗枪头，避免样品混杂。如果是有特殊要求，例如回收，强烈建议每点一个样换一次枪头。加样的速度当然是越快越好，注意保证质量。点样的量不要太大，一方面是体积不要太大，溢出污染邻位样品；一方面两不要太大，容易导致脱尾和模糊不清。3.接通电源，选择合适的电压和时间电泳。胶孔与电极成水平状态，防止样品跑歪。跑胶期间不时回来看看，防止样品跑出胶等意外发生。12基因组DNA电泳仪，电泳槽，电子天平，移液器，枪头，微波炉，紫外透射检测仪等。 琼脂糖，1XTAE电泳缓

7、冲液，溴化乙锭（EB），6X加样缓冲液 ： 0.25%溴酚蓝 ，0.25%二甲苯青 ，40%蔗糖水溶液; 0.25%溴酚蓝 ，0.25%二甲苯青 ，30%甘油水溶液实验材料13PCR-apoB基因多态性产物的鉴定取PCR产物全部上样14325671.5%胶，电泳（80mA, 120min）1：Marker2：待测样品13：待测样品24: 待测样品35: 待测样品46: 待测样品57：待测样品6-DNA琼脂糖凝胶电泳紫外灯下观察结果14琼脂糖凝胶板的制备（封板、梳子位置与高度、1%胶3mm、凝固后拔梳）倒缓冲液，加样（取基因组DNA样品液8l+2l上样缓冲液（5），混匀, 上样 ）电泳（恒压10

8、0V 1小时）检测（紫外检测）四.操作步骤 （1人1孔）其余DNA样品交给老师保存，以后实验用。15有关PCR反应PCR反应体系PCR过程PCR的基本原理标准的PCR反应体系4种dNTP混合物 各200mol/L引物 各10100pmolTaq DNA聚合酶 2.5uMg2+ 1.5mmol/L模板DNA 0.12g16有关PCR反应PCR反应条件PCR过程PCR的基本原理17PCR技术的创建一、最初的理论描述Khorana Khorana (1971)等最早提出核酸体外扩增的设想：“经DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可合成tRNA基因。”但由于当时基因

9、序列分析方法尚未成熟，热稳定DNA聚合酶尚未报道以及引物合成的困难，这种想法似乎没有实际意义。加上70年代初分子克隆技术的出现提供了一种克隆和扩增基因的途径，所以，Khorana的设想被人们遗忘了18二、PCR技术的发明Kary Mullis1985年，Kary Mullis在Cetus公司工作期间，发明了PCRMullis要合成DNA引物来进行测序工作，却常为没有足够多的模板DNA而烦恼1983年4月的一个星期五晚上，他开车去乡下别墅的路上PCR技术的创建1920PCR从构想成为现实 1983年12月， Mullis用同位素标记法看到了10个循环后的49 bp长度的第一个PCR片断； 198

10、5年10月25日申请了PCR的专利，1987年7月28日批准（专利号4,683,202 ），Mullis是第一发明人； 1985年12月20日在Science杂志上发表了第一篇PCR的学术论文，Mullis是共同作者； 1986年5月，Mullis在冷泉港实验室做专题报告，全世界从此开始学习PCR的方法。PCR技术的创建212294变性55退火Mullis的构思1983年PCR反应条件PCR过程PCR的基本原理有关PCR反应5533XX延伸（DNA聚合酶）5523945537?24Taq DNA聚合酶（Thermus aquaticus)酶活性(%)温度() 40 50 60 70 80 90

11、 100100 80 60 40 20Saiki, 1988年PCR技术的发展25729455PCR循环普通PCR仪、梯度PCR仪全新4通道实时荧光定量PCR仪261988年第一台PCR仪问世，PCR逐步实现自动化1989年美国Science杂志列PCR为十余项重大科学发明之首，比喻1989年为PCR爆炸年。1993年，Mullis因此项技术荣获诺贝尔化学奖。PCR技术的发展27Kary B. Mullis（1944）28PCR仪的变迁三个水浴锅，用手移动 （Mullis等人当时用的）电加热块 自来水冷却 （PE，1988）电加热块 内置循环液冷却 （PE，1989）三个加热块 机械手 （St

12、rategene，1994）半导体制冷和加热（MJ, PE, BioMetra, Eppendorf）空气加热 (Roche)梯度PCR仪, 实时荧光定量PCR仪Lab-on-chip式的PCR仪(芯片PCR)全新4通道实时荧光定量PCR仪普通PCR仪、梯度PCR仪291st cycle2nd cycle3rd cycle过 程变 性退 火延 伸30经典循环参数（500bp以内）94 30s 55 45s72 1min94 5min30次72 7min4 forever31PCR技术的特点灵敏度高30轮循环,扩增量达230个拷贝（109拷贝）将模板从皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug

13、=10-6)水平能从100万个细胞中检出一个靶细胞病毒检测的灵敏度可达3个PFU细菌检测的最小检出率为3个细菌特异性强 引物序列与模板结合的特异性快速简便 一次性加好反应液，24小时即可完成扩增32生物学基础研究目的基因扩增和鉴定 、DNA测序、定点突变医学临床应用遗传疾病基因诊断、致病病原体检测 、组织配型人类基因组工程遗传图谱的构建、DNA测序、表达图谱法医学物证鉴定个体识别、亲子鉴定其他动植物检疫、系统进化研究、分子考古学PCR的应用领域33分子克隆（目的基因的获取和鉴定）重组DNA质粒DNA基因片段PCR技术应用于科学研究3455Bam H IEcoR IBam H IEcoR IPC

14、R(5端引入限制酶识别位点)35 围绕二硫键构建不同结构的K5缺失突变体（PCR缺失突变） Yang X（杨霞）, et al. J Cell Mol Med (IF:5.2), 2010. PCR技术应用于科学研究362、临床基因诊断A内源性病变基因正常人A病 人PCR技术应用于临床诊断37遗传疾病的基因诊断 基因缺失、插入或置换等地中海贫血珠蛋白链合成不平衡38A正常人病 人正常病人A39病原微生物基因正常人 (-)病 人 (+)40登革病毒的检测41DMD：人类肌营养不良基因A：无外显子8,12,17,19对应条带,说明病人外显子819缺失B：病人A中未扩增外显子带的强度为C的一半,提示

15、为区域缺失携带者C：正常人DMD基因外显子的一般扩增形式多重PCR检测DMD基因缺失42PCR-RFLP法：(PCR产物限制性酶切片断多态性分析) Ras癌基因限制性内切酶43突变限制性内切酶44正常突变电泳45个体识别；亲子鉴定方法：PCR-RFLP（限制片段长度多态性） DNA指纹 PCR-ASO （等位基因特异性寡核苷酸） PCR-VNTR（可变数目串联重复序列）多态性 PCR-STR（短串联重复序列）多态性 PCR-SSCP（单链构象多态性） 线粒体DNA测序PCR技术应用于法医学鉴定46性别鉴定女性男性Y引物PCR男性 女性47 PCR-STR(short tandem repeat

16、)多态性检测PCR；电泳检测PCR技术应用于法医学鉴定48现场血迹 嫌疑人1 嫌疑人2 嫌疑人3个体识别PCR技术应用于法医学鉴定49父 父 子 母亲子鉴定PCR技术应用于法医学鉴定501：Marker2：阳性模板3：待测样品14：已确诊乙肝病人样品5: 待测样品26: 待测样品37: 阳性模板结果分析 阴性阴性乙肝病毒基因携带者51 PCR-VNTR(Variable numble of tandemly repeated short DNA sequence) 多态性检测PCR；电泳检测523VNTR位于该基因3端下游第2个Poly A信号以下位置的一个可变数目串连重复序列，也称小卫星区（

17、minisatellite）。根据重复序列长度的不同，可分为不同的等位基因型，自从1989年首先发现14种Apo B基因3VNTR等位基因以来，国内外至今已发现22种等位基因，长度在4001200 bp之间.根据重复序列的内部结构分为两类：ATAATTAAATATTTT，称为X型；ATAATTAAAATATTT，称为Y型。其序列中发生单核苷酸取代（即G或C取代T）， 又可产生X或Y的变异体Xi、Yi、Xii和Yii等。VNTR重复序列数目的不同，以及每一重复序列内部结构的变化决定了VNTR的高度多态性。apoB3VNTR序列由两端152个保守序列和中间以15bp核心序列多次重复组成。 有关3

18、VNTR多态性53小 结 掌握PCR技术的原理及基本步骤 熟悉apoB基因多态性的基本原理和操作步骤 了解PCR技术的广泛应用54思 考 题 Taq DNA 聚合酶有何特性使之可以用于聚合酶链式反应？ 根据自己的实验观察，你认为哪些事项是 PCR 操作成功的关键所在？551）不对称PCR2) 反向PCR3）多重PCR4）锚定PCR5）逆转录PCR6）原位PCR7) 荧光定量 PCR PCR的类型56 目的：扩增产生特异长度的单链DNA。 方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引物和非限 制性引物,其最佳比例一般是0.010.5M,关键是限制 性引物的绝对量。 用途：制备核酸序列测定的模板

19、 制备杂交探针 基因组DNA结构功能的研究 不对称PCR57 高浓度引物低浓度引物58反向PCR (reverse PCR) 用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。 可对未知序列扩增后进行分析,如探索邻接已知DNA片段的序列；用于仅知部分序列的全长cDNA的克隆,扩增基因文库的插入DNA；建立基因组步移文库。已知序列未知序列未知序列59已知序列未知序列未知序列限制酶限制酶连接酶60多重PCR（复合PCR）用于检测特定基因序列的存在或缺失。61电泳引物1234123462DMD：人类肌营养不良基因A：无外显子8,12,17,19对应条带,说明病人

20、外显子819缺失B：病人A中未扩增外显子带的强度为C的一半,提示为区域缺失携带者C：正常人DMD基因外显子的一般扩增形式多重PCR检测DMD基因缺失63LP-PCR（Labelled primers) 利用同位素、荧光素等对引物进行标记,用以直观地检测目的基因。 特别适合大量临床标本的基因诊断 可同时检测多种基因成分病毒1 病毒2 病毒 3 病毒464标记引物观察PCR产物65锚定PCR（anchored PCR, A-PCR）PCR的局限：需了解靶基因片段两侧的序列 对于未知序列怎么办？66cDNA末端核酸转移酶3GGGG5CCCC 锚定引物3GGGG5CCCC3GGGGCCCC锚定PCR首

21、先合成第一链cDNA,然后再添加一同聚物尾（polydG),与同聚物尾配对的3锚定引物（带有限制性内切位点polydC)一起作PCR扩增67PCR固相分析法模板生物素化引物PCR扩增探针亲和固相介质检测探针信号可用于基因芯片的制作68原位 原位聚合酶链式反应（In Still PCR,IsPCR）是由Haase等于1990年首创。它是利用完整的细胞作为一个微小的反应体系来扩增细胞内的目的片段,在不破坏细胞的前提下,利用一些特定的检测手段来检测细胞内的扩增产物。 直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行扩增。可进行细胞内定位。 适用于检测病理切片中含量较少的靶序列69既往鉴定细胞内特异序列一般采用原位杂交（ISH）,但在每个细胞中目的片段的拷贝数少于10的情况下,该方法的敏感度就明显下降。而标准的PCR则可扩增出细胞内单拷贝的序列,敏感度很高,但却未能与细胞形态学研究相结合。 ISPCR则可把这两者结合起来,成为细胞学诊断中一种崭新的检测技术。利用该法可检测细胞内病毒感染、细胞内基因重排、以及分析细胞内RNA表达产物等方面发挥一定作用。在检测细胞的潜在感染方面也具有重要意义。 原位PCR的作用70操作步骤1. 细胞或组织固定：细胞经固定和乙醇通透化处理后便适于一般PC