enu与疾病动物模型ppt课件

1、 ENU诱变与疾病动物模型 邵义祥人类遗传性疾病人类群体中约20%25%的人都患有不同种类、不同程度的遗传相关疾病。人类遗传学研讨阐明： 45%新生儿患有遗传病，40%的低智能儿童是由遗传要素呵斥。现代医学研讨已证明：癌症、糖尿病、冠心病、动脉粥样硬化、高血压病和精神分裂症等常见病与遗传要素亲密相关。人类疾病动物模型的用途 由于个体遗传背景的差别及研讨资料的限制，人类遗传疾病的深化研讨必需经过动物模型实现。利用动物模型进展遗传疾病机理的深化研讨借助动物模型进展实验性矫正或治疗获得人类遗传病动物模型的方法自发性动物模型基因组改造和修饰基因组诱变基因驱动法与表型驱动法基因敲除与插入基因驱动 特点：

2、基因构造明确； 时间长，代价高， 效率低。诱导点突变表型驱动 特点：高通量，大规模，表型明确；随机。小鼠是第二个完成全基因组测序的哺乳动物。人类疾病有关的遗传基因中的90%在小鼠身上有类似的效果。小鼠容易获得，世代间隔短，豢养、管理、实验操作方便。 小鼠是研讨人类疾病和基因功能的最为理想的方式动物，成为研讨人类疾病和实验新的治疗手段的理想模型。小鼠在人类遗传病研讨中的独特作用ENU诱变技术随着越来越多的基因和微卫星标志被定位，突变基因的定位也会随之变得容易，因此对小鼠进展化学诱变将越来越变得低本钱而高效益。ENUethylnitrosourea致突变技术是高通量大规模挑选新基因及发育突变技术的

3、化学诱变方法。ENU诱变是一种表型诱变技术，研讨者无需知道哪个基因以及这些基因的突变类型，即可直接针对某一未知基因突变导致的特定表型或疾病进展研讨 ENU的构造 N-ethyl-N-nitrosoureaENU诱变机制烷基化反响作用位点： A：N1、N3、N7 G：O6、N3、N7 C：O2、N3 T：O2、O4、N3复制、错配、未修复导致单碱基突变screening and testing for dominant mutantsscreening and testing for recessive mutants指标分类具体指标一般状况精神状态、体重、体形、营养状况神经行为步态、摇头、转圈

4、、震颤、活动状况皮肤、毛发皮色、皮质、毛色、毛质、胡须、斑点、淤斑、纹理眼位置、大小、形态、颜色、角膜、虹膜、有无白内障耳耳廓位置、形态、大小、外耳道是否闭锁尾长短、粗细、形态、颜色骨骼头形、有无下颌、脊柱侧弯、四肢长短粗细、趾数多少，趾长短、并趾口腔牙齿长短、色质、质地、角度；舌的形态、色质；有无腭裂尿、粪尿液颜色、浑浊度；粪便颜色、质地血生化血糖、胆固醇、甘油三脂、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、尿素氮血常规白细胞数、红细胞数、血红蛋白、平均红细胞体积、平均红细胞血红蛋白含量其它水肿、脑积水、腹水、脊柱裂诱变小鼠的筛查工程ENU诱变的历史和现状 ENU诱变开场于上个世纪70年代，初期主要运用在

5、肿瘤研讨领域； 在1985年左右，开场有报道用ENU诱变雄鼠而在后代当中获得突变系小鼠，这些突变小鼠某些酶的活性发生了改动 ；1995年以后，开场在世界范围内得到开展并主要用于基因功能的研讨；1994年King等经过诱变获得生活规律异常的小鼠，1997年克隆了clock基因，这是阐明ENU诱变技术独特优势的里程碑。 国外进展德国GSF 1997-2003年期间共建立突变系小鼠267种，其中隐性突变50种，半显性突变5种，其他均为显性突变； 到2000年英国MRC筛查突变小鼠26000只，得到突变系小鼠500种；到目前为止，世界上ENU诱变获得的突变系小鼠已有1000多种。 国内进展南京大学和扬

6、州大学共同承当的“国家小鼠遗传资源库工程，其中一项重要任务就是开展小鼠ENU诱变研讨。2002-2004年资源库共建立了具有自主知识产权的转基因/基因剔除/化学诱变小鼠共167种，其中ENU诱变获得的有117种，在此根底上克隆了7个突变基因。清华大学生物科学与技术系发育生物学实验室用ENU 诱导斑马鱼突变一共得到 35 种突变体 。ENU诱变建立疾病动物模型 心血管疾病、代谢性疾病、神经系统疾病、免疫性疾病、肿瘤和出生缺陷等遗传高度相关性疾病已成为国际上生物医学研讨的最抢手领域，相应的实验动物学支撑，特别是相关疾病的动物模型的获得和建立成为了实验动物学研讨的热点。 小鼠疾病模型的开发与保种美国

7、的Jackson实验室保管了近2500多个品系的小鼠模型；英国MRC的哺乳类遗传学中心保管了1000多个品系的小鼠资源；意大利的欧洲小鼠突变系保管中心每年以开发150个突变系小鼠的速度建立了数百个基因工程小鼠模型；日本的熊本大学实验动物资源开发研讨中心(CARD)自2000年建立以来，已搜集保管了700多个转基因和基因剔除小鼠模型。国家遗传工程小鼠资源库建立以来，已搜集、开发了264种小鼠模型品系。 模型种类包括：糖尿病模型、生殖缺陷模型、心衰模型、生长缓慢模型、骨密度异常模型、肢体发育缺陷模型、听力异常模型、眼发育异常模型、稀毛、毛色变异模型等等。目前，世界上数以千计新的小鼠品系，模拟人类代

8、谢性疾病、本身免疫疾病、老年性疾病和神经系统疾病的动物模型正在不断经过ENU诱变这个高通量挑选技术建立起来，进而相关基因被定位和克隆。随着基因组方案的进展，从表型到基因克隆的方法目前也日渐成熟和简化。 ENU在建立人类疾病动物模型和开展基因功能研讨中的主要优势在相对短的时间内诱导产生较多的突变系小鼠，获得许多基因包括新基因的功能信息；只需得到可以遗传某种表型的突变小鼠，就可以经过配种构成恣意控制的“超大家系；小鼠近交系有数百种，其中12个品系的微卫星数据曾经建库且免费开放，便于对突变基因的定位及克隆；小鼠与人类病理过程的类似性，经过克隆小鼠的致病基因就可以经过同源检索得到人类的相应疾病的基因；

9、ENU诱变无需知道哪个基因以及这些基因的何种突变导致特定的表型或疾病，这也使得发现新基因成为能够。ENU诱导的某些突变，导致非致死的表型和改动蛋白质的部分功能，而不是完全废弃，因此添加了研讨者鉴定突变体的时机，而该突变体含有对某个基因座的丰富信息。 总之，以ENU诱变为手段，经过方式小鼠研讨功能基因或人类疾病已成为一种很有前景的手段和捷径。我们的部分研讨任务突变系小鼠的获得两种突变小鼠突变基因的定位两种突变小鼠模型性状的初步研讨ENU诱变、突变表型挑选及遗传实验技术道路ENU处置C57BL/6雄鼠3个月后与同品系母鼠配种子代小鼠G1离乳G1豢养至2月龄阳性突变小鼠G1同品系配种得G2具有亲代G

10、1突变表型显性遗传突变基因的定位技术道路B6突变系与DBA/2交配，获得阳性表型的F1F1回交 DBA得到F2代提取阳性表型的F2鼠 尾DNA选择相关基因附近的微卫星优先连锁分析计算LOD值确定连锁在 G1 代小鼠中，针对肉眼可见的神经行为、皮肤、毛发、五官、骨骼等可见表型筛查突变个体。筛查 G1 小鼠 1650只，获得突变小鼠 48 只。在对G1突变小鼠的遗传实验及突变系小鼠保种过程中，繁衍小鼠1468只，确认可以稳定遗传的只需短尾、角膜浑浊和瞳孔异形突变小鼠等共 7 种，经卡方检验都属于单基因显性遗传。 小 鼠 的 ENU 诱 变结果突变基因的微卫星定位体系D1Mit372、D1Mit84

11、、D1Mit273、D2Mit6、D2Mit17、D2Mit528、D3Mit268、D3Mit15、D4Mit17、D4Mit54、D5Mit352、D5Mit168、D6Mit274、D6Mit339、D7Mit246、D7Mit333、D8Mit4、D8Mit320、D9Mit325、D9Mit243、D10Mit3、D10Mit73、D11Mit163、D11Mit258、D12Mit、D12Mit17、D13Mit18、D13Mit262、D14Mit50、D14Mit205、D15Mit226、D15Mit34、D16Mit189、D16Mit100、D17Mit33、D17Mit

12、39、D18Mit52、D19Mit128、D19Mit33。 泳道1： 野生型D2品系小鼠对照；泳道 217：F2角膜浑浊小鼠的检测结果，其中第9泳道发生重组，其他连锁。F2代 B6角膜浑浊小鼠的微卫星检测角膜浑浊小鼠突变基因的连锁分析角膜浑浊小鼠突变基因的染色体定位D17Mit33与D17Mit143聚丙烯酰胺凝胶电泳结果 上图：第4泳道发生重组 以下图：无 1 例发生交换，12、13、14分别为D2、F1、B6 F2代 短尾小鼠的微卫星检测短尾鼠的突变基因连锁分析228只F2 B6D2 D2 109只短尾短尾突变基因与各微卫星的连锁分析短尾小鼠突变基因的染色体定位角膜浑浊突变小鼠的生物学

13、特性初步研讨突变品系的建立及其模型性状研讨的技术道路突变杂合子繁衍学目的生长发育血常规血液生化免疫学目的病理组化建立新的模型品系形状行为察看角膜浑浊小鼠角膜浑浊小鼠和野生型小鼠的繁衍学目的比较 角膜浑浊小鼠后代的性别比(:)为：1.07 有角膜浑浊表型的性别比(:)为：1.44B6-Co与正常B6小鼠的脏器系数 角膜浑浊突变系与正常B6小鼠血常规的比较 角膜浑浊突变系与正常B6小鼠血液生化值的比较 角膜浑浊小鼠的角膜病理学特征1角膜浑浊小鼠的角膜病理学特征2角膜浑浊小鼠的角膜病理学特征3角膜浑浊小鼠的模型价值 我国盲人数约670万人，角膜浑浊是仅次于白内障的主要致盲缘由约占15.4% 。人类角

14、膜病有多种类型，它们的致病缘由更有许多假说，但由于缺乏适宜的动物模型，相关研讨不断未能深化。 突变小鼠角膜中有大量钙质和异物堆积，类似于人的斑点状营养不良，而角膜上皮细胞和基质成纤维细胞的形状学变化又类似于人的先天性角膜化生症。目前尚不能确定其对应的人类角膜病类型，但遗传要素在其中的决议作用是毫无疑问的。 对该小鼠的研讨能够会对人类角膜病的正确分型及发病机制提供科学实际根据。短尾突变小鼠的生物学特性初步研讨短尾小鼠后代尾巴的不同形状短尾小鼠的繁衍学目的 不同尾形小鼠的统计结果 各尾形所占百分比：短尾 33.8 %，中尾 9.9 %，正常尾 56.3 %。性别 (:) 比值：0.75 脏 器 系

15、 数 比 较 表血 常 规 比 较 表血 液 生 化 值 比 较 表短尾小鼠脏器系数、血常规、血液生化结果短尾小鼠的脾、脑、子宫、卵巢的脏器系数与B6有显著差别。短尾小鼠白细胞、单核细胞显著高于B6。 结果阐明，短尾小鼠的血红蛋白、碱性磷酸酶、血清总蛋白、白蛋白、白蛋白、血清总胆固醇都显著低于B6小鼠。 所获短尾小鼠属于纵形肢体缺陷，与人类心手综合征holt-oram syndrome，HOS属于同一类型，其突变基因与人类TBX5基因高度同源。心手综合征在人类的发病率约为十万分之一。短尾小鼠无疑是一个很好的骨骼畸形研讨的动物模型。 短尾小鼠的模型价值短尾突变基因T的序列鉴定与分析短尾突变基因序

16、列鉴定与分析技术道路RT-PCR及巢式PCR抽提RNA胶回收测序测序结果比对确定突变位点基因组突变位点鉴定实 验 方 法 8.5天小鼠胚胎的获取RNA抽提：参照 RNAR Total RNA Isolation System ( Promega 公司 )的阐明书，在超净任务台内进展操作RT引物设计 逆转录：参照 Invitrogen 公司 SuperScriptTM First-Strand Synthesis System for RT-PCR 试剂盒阐明书操作 高保真PCR扩增PCR产物回收：fastgene 胶回收试剂盒回收。搜集滤液,送上海生工测序。 8.5天 B6-St 小鼠胚胎总 RNA RT-PCR扩增产物，得到了 1494 bp 的特异性产物 突变T基因RT-PCR产物电泳图T基因、突变T基因的cDNA序列与数据库序列的比对 巢式 PCR 验证结果 1：正常小鼠胚胎T基因PCR电泳结果。2：短尾小鼠胚胎T基因PCR