实验七血清蛋白醋纤薄膜电泳

1、动 物 生 物 化 学 实 验实验七 血清蛋白醋纤薄膜电泳一、实验目的1. 学习电泳的基本原理2. 掌握血清蛋白醋纤薄膜电泳的原理及操作技能。二、实验原理1. 电泳的基本原理 带电粒子在电场中向着与其本身所带电荷相反的电极移动的过程称为电泳，不同物质，由于其带电性质及颗粒大小、形状不同，因而在一定的电场中，它们移动方向和移动速度也不同，故此可使它们分离。 在电场中，颗粒移动速度以泳动度（或迁移率）表示，泳动度是指带电颗粒在单位电场强度下的泳动速度，可用下式表示：式中： 泳动度cm2/(V.S) R颗粒泳动速度（cm/s） E电场强度（v/cm） d颗粒移动距离（cm） L支持物有效长度（cm）

2、 V电泳实际电压 t电泳时间(s) 通过测定V、t、L、d、即可算出泳动度。 在电场中，推动带电粒子运动的力（F）等于粒子所带净电荷量（q）与电场强度（E）的乘积。 FqE=qV/d 另外，带电粒子的前移还要受到介质阻力（ f ）的影响，对于一个球形质点，服从Stoke定律，即： f 6 r （r为质点半径，为介质粘滞系数，为质点移动速度） 当质点在电场中作稳定运动时： F f 即：qE 6 r V = qE /6r 迁移率u： 单位电场强度下的电泳速度， 粒子的迁移率在一定条件下决定于粒子本身的性质即其所带电荷及大小和形状。uv/E=q/6r 影响电泳因素(1) 待分离分子的性质 ： 包括带

3、电粒子所带的电荷、分子大小和形状。 分子带的电荷量越大、直径越小、形状越接近球形，则其电泳迁移速度越快。 (2) 电场强度： 电场强度指每1cm距离的电压降。电场强度越高，带电颗粒泳动速度越快。 一般E为210V/cm，V为100 500V，为常压电泳，电泳时间从几十分钟几十小时，常用分离大分子。 E为20200V/cm，为高压电泳，电泳时间几分钟几小时，多用于分离小分子物质。(3) 溶液PH： PH影响带电颗粒的解离，也即决定了颗粒所带净电荷的多少。对两性电解质，PH偏离PI越远，带电荷越多、泳动速度越快，PH=PI，其净电荷为零，不移动。(4) 离子强度： 溶液离子强度越高、增加了电极缓冲

4、液的粘稠度，颗粒泳动速度越慢。一般离子强度为0.020.2较适宜。(5) 电渗： 在电场中，液体对于固体支持物的相对移动称为电渗。电渗将改变颗粒在电场中的泳动速度。 例如：在纸电泳中，由于滤纸纤维素上带有一定量的负电荷，而使与纸相接触的水分子感应而带一些正电荷。水分子便向负极移动并带动溶液中的颗粒一起向负极移动。若颗粒本来向负极移动，则其表观泳动速度将比其本来的泳动速度快；若颗粒原来向正极移动，则其表观泳动速度慢于其本来的泳动速度；净电荷为零的颗粒也会随水向负极移动。电泳的种类按支持介质的不同可分为： 纸电泳（Paper electrophorisis） 醋酸纤维薄膜电泳（Cellulose

5、Acetate electrophoresis） 琼脂凝胶电泳（Agar Gel electrophoresis） 聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyacrylamide Gel electrophoresis）（PAGE） SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）。 按支持介质形状不同可分为： 薄层电泳 ； 板电泳 ； 柱电泳 2. 血清蛋白醋纤薄膜电泳原理 血清中各蛋白质的等电点不同，但大都在pH7以下，若将血清置于pH8.6的缓冲液中，则这些蛋白质均带负电，在电场中都向阳极移动。由于各种蛋白质在同一pH环境中所带负电荷多少及分子大小不同，所以在电场中向阳极泳动速度也不同。蛋白质分子小而带电荷

6、多者，泳动速度快；反之，则泳动速度慢。因此可将血清蛋白质依次分为清蛋白、a1-球蛋白、a2-球蛋白、 -球蛋白和-球蛋白五条区带，经染色可显示各蛋白条带。+白蛋白(A)12三、实验试剂及器材1.试剂 (1) 巴比妥巴比妥钠缓冲液(pH8.6，m=0.06): 称取巴比妥1.66克和巴比妥钠12.36克，溶于500毫升蒸馏水中，加热溶解。待冷至室温后，再加蒸馏水稀释至1000毫升。 (2) 染色液: 称取氨基黑10B0.5g，分别加入蒸馏水40ml，甲醇50ml和冰醋酸10ml，混匀。 (3) 漂洗液: 分别量取95%乙醇45ml、冰醋酸5ml和蒸馏水50ml，混匀。2. 器材 仪器：电泳仪、电

7、泳槽 材料：醋酸纤维薄膜、培养皿、滤纸、镊子、点样器四、实验操作1薄膜的准备： 取醋纤薄膜(2厘米*8厘米) 置于巴比妥缓冲液中浸泡，待充分浸透(即膜条无白斑时)后取出，用洁净滤纸轻轻吸去表面的多余缓冲液。2点样： 吸取少量血清均匀涂抹在点样器的钢口，随后将钢口垂直“印”在醋纤薄膜的粗糙面距一端2cm处，待血清渗入膜后移开点样器。 点样应注意：要适量、均匀和垂直，并避免弄破薄膜。3. 电泳： 将已点样的薄膜加样面朝下，加样端置于阴极端，平整地贴于电泳槽的支架上拉直。支架上事先放置好两端浸入缓冲液的用四层滤纸条作的“滤纸桥”(如图2)。通电进行电泳。一般电压为120160伏，电流约0.40.6毫安厘米，通电时间4050分钟，待电泳区带展开约3.5厘米时断电。4. 染色: 小心取出薄膜，直接浸于氨基黑染色剂中510分钟(以清蛋白区带染透为止)。然后在漂洗液中连续浸洗数次，使薄膜底色漂净，即得五条蛋白色带。从阳极端起依次