肿瘤细胞与分化凋亡(三)

1、细胞凋亡的生物学意义胚胎发育和形态发生细胞稳态和免疫机制衰老肿瘤发生及化学治疗 1细胞凋亡和恶性肿瘤1 Bcl2和恶性肿瘤2 P53和恶性肿瘤3Bcr-abl和恶性肿瘤4 PML-RAR蛋白和恶性肿瘤2细胞凋亡干预和肿瘤治疗1 野生型P53基因介导的肿瘤治疗2 Bcl2基因介导的肿瘤治疗3 泛素蛋白酶体降解途径介导的肿瘤治疗4 三氧化二砷介导的血液系统恶性肿瘤治疗5 DADS诱导肿瘤细胞凋亡3细胞凋亡的检测方法1 台肦蓝（trypan blue)染色法 原理：trypan blue 是一种细胞膜非通透性染料。坏死细胞因细胞膜受损而被台肦蓝着色染色。因此，该法能区分细胞的生存状态，简单、便捷、常

2、规用于细胞死亡的初步评价和细胞存活率评价。 注意事项：该法不能区别继发性坏死和真正意义上的坏死细胞；也容易低估细胞死亡程度。（因为早期凋亡细胞具有完整的细胞膜而被误当作活细胞）42.丫啶橙染色（acridine orange,AO)和溴化乙啶(ethidium bromide,EB)双染法原理：AO和EB都是结合DNA的荧光染料，分别产生蓝色和橙色荧光。其中，AO能透过完整的细胞膜，而EB则只能染色胞膜受损的细胞。因此， AO/EB双染法能借助荧光显微镜或流式细胞仪区分活细胞或早期凋亡细胞和坏死或继发性坏死细胞。 注意事项：应用单一形态学计数凋亡细胞数（凋亡指数，apoptosis index

3、)常受到主观因素的干扰，其个体间甚至同一主体的重复性较差。 5荧光显微镜观察 图9A 未处理的HL-60细胞 图9B DADS处理的HL-60细胞 吖啶橙 40 吖啶橙 4063 电子显微镜观察法 电镜下超微结构观察虽可显示凋亡细胞的许多特点，如膜发泡和某些结构如微纤毛的丢失、染色质固缩和线粒体超浓缩等，但由于样本制备复杂、耗时，该项技术主要用于获取细胞凋亡的定性检测。783 透射电镜观察 图8A 未处理的HL-60细胞 图8B DADS处理的HL-60细胞 透射电镜6000 透射电镜600094 DNA断片法或称琼脂糖凝胶电泳“梯形条带”图谱法 原理：凋亡细胞的基因组DNA常首先被剪切为20

4、0-300kb和30-50kb的片断（“结构域式”剪切），再进一步降解产生大小相当于核小体(160-200bp)的倍数的寡核小体片断（“裂解”/“梯子式”剪切）。因此，在琼脂糖凝胶电泳图谱上凋亡细胞表现为特征性“梯子”样外观。 注意事项：梯状DNA(DNA ladder)现象常被看作是细胞凋亡的重要生物化学标志。但是，日益增多的资料显示并不是所有表现凋亡形态学特征的细胞都是呈现这种梯子样外观。因此，缺乏梯状DNA并不能排除细胞凋亡的存在。据报道，某些细胞系如K562细胞凋亡常发生单链而不是双链DNA降解，故不能形成“DNA ladder”。另外，一般凋亡率要在15%以上才能呈现典型“DNA l

5、adder” 。故有DNA ladder可以肯定凋亡存在，没有DNA ladder不能排除凋亡的存在。10图5 不同浓度DADS作用HL-60细胞24h后DNA梯状条带的形成图6 60 molL-1 DADS作用HL-60细胞不同时间后DNA梯状条带的形成 11.TUNEL法（末端DNA转移酶dUTP缺口末端标记法） 原理：DNA聚合酶能够填补双链DNA中的单链缺 失部分，应用放射性同位素、生物素和荧光素等标记的三磷酸核苷酸形成新的DNA。 TUNEL法是在含标记dUTP的反应体系中，加以末端DNA转移酶。故又称为TdT(terminal deoxy-transferase)法。该法是应用无需

6、模板的DNA聚合酶，延伸核苷酸的碱基序列与DNA底物无关。 注意事项：该法只能了解DNA是否断裂和发生DNA断裂的细胞数量，虽然在理论上对这种方法的特异性尚有争议，但操作简便，并且可大量应用于回顾性研究，从而成为目前较为流行的细胞凋亡评价方法。12TUNEL检测结果 图10A 未处理的HL-60细胞 图10B DADS处理的HL-60细胞 TUNEL 20 TUNEL 20136 PI染色流式细胞术测定凋亡率 原理：实验证明凋亡细胞在固定和清洗过程中降解的小分子量DNA 外漏，导致细胞内DNA含量减少。因此，应用DNA特异荧光染料（如碘化丙啶，propidium iodide, PI）染色后，

7、在FCM进行的细胞周期分析中，凋亡细胞常以亚二聚体形式出现。亚二倍体细胞群被称为亚G1期（sub-G1)细胞。它的出现被认为是凋亡细胞的重要标志。 注意事项：识别亚G1期细胞的同时，必须将它和细胞碎片区分开来，因为细胞碎片的DNA含量也明显低于G1期细胞。142.3 流式细胞仪检测凋亡率 control 5mgL-1DADS 7.5mgL-1DADS 10mgL-1DADS 15mgL-1DADS 20mgL-1DADS 10mgL-1DADS+PD 10mgL-1DADS+SB15图7 PI/Annexin V双染色检测DADS作用HL-60细胞12h后凋亡率的变化163.3 流式细胞仪检测

8、凋亡率 17图12 PI/Anexin-V双染色流式细胞仪检测DADS作用K562细胞12h后凋亡率的改变18 E F G H图13 流式细胞仪检测DADS作用K562细胞24h、48h后的凋亡率改变19细胞凋亡死亡受体相关信号途径20细胞凋亡死亡受体相关信号途径 表3 caspase 家族主要成员序号 原名 功能 底物特异性Caspase-1 ICE 辅助炎症 WEHDCaspase-2 ICH-1 凋亡反应 DEXDCaspase-3 CPP32,Yama,apopain 凋亡反应 DEXDCaspase-4 ICErel-,TX,ICH-2 辅助促炎症 WEHDCaspase-5 ICE

9、rel-,TY 辅助促炎症 WEHDCaspase-6 Mch-3 凋亡反应 (I/L/V)EXDCaspase-7 Mch-3,ICE-LAP3,CMH-1 凋亡反应 DEXDCaspase-8 FLICE,MACH,Mch-5 凋亡反应 (I/L/V)EXDCaspase-9 ICE-LAP6.Mch6 凋亡反应 (I/L/V)EXDCaspase-10 Mch4 凋亡反应Caspase-11 ICH-3Caspase-12 Caspase-13 ERICHCaspase-14 MICE(Mini-ICE)21Pro-caspase3Pro-caspase9Cyt-cGAPDHHL-60T

10、ime(h) 0 1 2 4 8 24图30 DADS作用HL-60细胞后caspase3的表达变化22Pro-caspase3Pro-caspase9Cyt-cGAPDHK562Time(h) 0 1 2 4 8 24图31 DADS作用K562细胞后caspase3的表达变化23Pro-caspase3Pro-caspase9Cyt-cGAPDHRajiTime(h) 0 1 2 4 8 24图32 DADS作用Raji细胞后caspase3的表达变化24细胞凋亡线粒体相关信号途径MMP开放线粒体外膜PBRCyclophilin DANTPorinm 下降AIF Cyto C/Apaf-1

11、/procaspase-9 caspase-9-caspase-8 caspase-3 apoptosis 25BaxMitoTracker overlay图34激光共聚焦检测HL-60细胞中Bax的线粒体转位26overlayMitoTrackerBax图35激光共聚焦检测K562细胞中Bax的线粒体转位27DADS通过启动Mcl-1/Bid/Bax/Caspase-9/Caspase-3线粒体凋亡通路诱导HL-60和K562细胞凋亡。28MMP开放和caspase活化的“正反馈”环MMP开放Caspase-3活化线粒体膜屏障功能破坏线粒体肿胀Cyoto C释放Apoptosome（proc

12、aspase-9/Apaf-1/Cyto C）Caspase-9活化膜间蛋白（如AIF）释放刺激ceremide酶活化 剪切MMP复合物凋亡诱导剂结合Apaf-1 和procaspase-929内源性细胞凋亡抑制物1 Caspase8（FLICE)抑制蛋白（FLIP)2 SODD(silencer of death domain)3 IAP（inhibitor of apoptosis protein)4 Survivin5 Bcl-2家族蛋白30Bcl2家族蛋白的结构和功能 Bcl2的两大结构域： TM BHBcl2家族蛋白活性调节 Bcl2 家族蛋白的效应机制31MCL1Bcl-2BidB

13、axBakGAPDHHL-60Time(h) 0 1 2 4 8 24图24 DADS处理HL-60细胞后Bcl-2家族成员的表达变化32GAPDHBakBaxBcl-2K562BidTime(h) 0 1 2 4 8 24图25 DADS作用K562细胞后Bcl-2家族成员的表达变化MCL133Time(h) 0 1 2 4 8 24MCL1Bcl-2BidBaxBakGAPDHRaji图26 DADS作用Raji细胞后Bcl-2家族成员的表达变化34Quantitation data for Cycling B.FAM/SybrStandard Curve图27 DADS作用HL-60、K562、Raji细胞后MCL1mRNA表达水平的变化35Quantitation data for Cycling B.FAM/SybrStandard Curve图28 DADS作用HL-60、K562、Raji细胞后BaxmRNA表达水平的变化36Standard CurveQuantitation data for Cycling B.