医学细胞生物学：第3章 细胞生物学的研究方法

1、第三章 细胞生物学的研究方法学习目的与要求掌握细胞生物学基本研究方法的原理和应用熟悉细胞生物学基本研究方法的技术特点了解细胞生物学基本研究方法的进展第一节 显微镜技术一、 光学显微镜二、 电子显微镜三、 纳米显微镜普通光学显微镜荧光显微镜相差显微镜暗视野显微镜共聚焦激光扫描显微镜一、 光学显微镜技术（一）普通光学显微镜-分辨率极限是0.25um放大率：最终成像的大小与原物体 大小的比值。分辨率与放大率组织切片的制备苏木精：核酸伊红： 细胞质苏丹染料：脂肪切片与观察肝癌组织切片图像（二)荧光显微镜-呈现强反差的彩色图像1.荧光和荧光染料 某些物质在短波长光波(激发光）照射下，吸收光能，受到激发并

2、释放出一种能量降级的较长的可见光波（蓝、绿、黄或红光，波长400800nm，发射光），这种光称荧光。 荧光分子可使样品呈现不同的染色，因此也称为荧光染料（如吖啶橙、异硫氰酸荧光素等） 2.荧光显微镜的原理和应用特点：照明方式通常为落射式，即光源通过物镜投射于样品上 ；光源为紫外光，波长较短，分辨力高于普通显微镜； 有两个特殊的滤光片，光源前的用以滤除可见光，目镜和物镜之间的用于滤除紫外线，用以保护人目。应用：定性、定位和定量的研究组织与细胞内的荧光标记物质。医学实验研究及疾病诊断方面的用途日益广泛。 （三）相差显微镜-常用于活细胞观察培养中的肝癌细胞（四）暗视野显微镜-通过散射光成像原理：利用

3、散射光与衍射光成像特点：照明光线不直接进入物镜，视野的背景是黑的，物体的边缘是亮的 应用：主要观察的是物体的轮廓，分辨不清内部的微细构造，适合于观察活细胞内的细胞核、线粒体、液体介质中的细菌和霉菌等。 （五）共聚焦激光扫描显微镜 -提供高清晰度彩色三维图像工作原理光学切片与三维图像激光共聚焦显微镜图像 成骨肉瘤细胞中npm蛋白的分布二 电子显微镜（Electron Microscope）透射电子显微镜（transmission electron microscope，TEM） 扫描电子显微镜（ Scanning electron microscope, SEM ）（一）透射电子显微镜（TEM）

4、透射电子显微镜(TEM)与光学显微镜(LM)的基本区别 显微分辨本领光源透镜真空 成像原理LM200nm可见光（400-700）玻璃透镜不要求真空 利用样品对光的吸收形成明暗反差和颜色变化100nm紫外光（约200nm）玻璃透镜不要求真空TEM0.1nm电子束（0.01-0.9）电磁透镜真空1.33x10-51.33x10-3P 利用样品对电子的散射和透射形成明暗反差透射电子显微镜标本制备过程（二）扫描电子显微镜（SEM)缺点：分辨率低（3-10nm）扫描电镜工作原理人成骨肉瘤MG-63细胞的电镜图像 TEM SEM（三）透射电镜借助金属投影、冰冻断裂和冰冻蚀刻技术可获取三维图像1.金属投影与

5、复型原理：以一定角度向样品表面喷重金属，样品表面三维结构可显示投影效果。应用：蛋白、核酸大分子、病毒颗粒及细胞壁观察2.冰冻断裂复型样品制备：冷冻样品（液氮-196度）冰刀切割暴露膜内部结构金属投影法应用：观察细胞膜性结构的内部构造 叶绿体内膜冰冻断裂复型，显示内膜上大量膜蛋白3.冰冻蚀刻样品制备：冷冻组织（液态氦-269度）冰刀切割真空升华暴露膜及细胞内部结构金属复型应用：观察细胞内部构造冰冻蚀刻显示昆虫肌肉细胞中的蛋白质纤维三、纳米显微技术纳米尺度：1nm100nm 扫描隧道显微镜原子力显微镜 1.扫描隧道显微镜（Scanning tunneling microscope，STM)2.原子

6、力显微镜（atomic force microscope，AFM)首次观察到分子的照片原子力显微技术的优缺点 优点：提供真正的三维表面图；AFM不需要对样品的任何特殊处理，不会对样品会造成不可逆转的伤害；常压下甚至在液体环境下都可以良好工作；用来研究生物宏观分子，甚至活的生物组织；缺点： 成像范围太小,速度慢，受探头的影响太大。第二节 细胞的分离和培养一 、不同类型细胞的分离细胞分离过程需遵循以下原则：分离体系溶液必须是等渗的，具有缓冲性的离子强度。低温。无菌操作。细胞的分离方法主要有以下几种：差速离心或密度梯度离心流式细胞技术免疫磁珠法激光捕获显微切割技术（一）差速离心或密度梯度离心 根据细

7、胞的大小和细胞密度不同进行分离（二）流式细胞技术（三）免疫磁珠法（四）激光捕获显微切割技术二、细胞培养细胞培养技术（cell culture）就是在体外模拟体内的生理环境，培养从机体中取出的细胞，并使之生长和生存的技术。（一）细胞培养条件（二）细胞培养基本设备（三）原代培养与传代培养原代培养与传代培养的概念： 原代培养指的是从动物机体取出的进行培养的细胞群。原代培养的细胞生长比较缓慢，而且繁殖一定的代数后（一般10代以内）停止生长，需要从更换培养基。将细胞从一个培养瓶转移到另外一个培养瓶即称为传代或传代培养。传代培养的细胞通常表现出来源组织的分化特征。（四）细胞系（五）细胞融合（六）胚胎干细胞

8、（ES)的培养条件胚胎干细胞： 具有体外培养无限增殖、自我更新和 多向分化的特性 。特殊的培养要求：维持ES细胞处于未分化状态。饲养层细胞：分泌成纤维细胞生长因子，促进ES细胞的增殖；分泌白血病抑制因子，抑制ES细胞分化。第三节 细胞组分的分离与纯化技术一、细胞组分的分级离心二、层析法分离蛋白质三、蛋白质电泳一、细胞组分的分级离心 离心是研究如细胞核、线粒体、高尔基体、溶酶体和微体，以及各种大分子基本手段。 高速离心机：转速为1025Kr/min；超速离心机：转速超过25Kr/min，离心力大于89K。目前超速离心机的最高转速可达100Kr/min，离心力超过500Kg。（一）差速离心（dif

9、ferential centrifugation）在密度均一的介质中由低速到高速逐级离心，用于分离不同大小的细胞和细胞器。在差速离心中细胞器沉降的顺序依次为：核、线粒体、溶酶体与过氧化物酶体、内质网与高基体、最后为核蛋白体。 （二）密度梯度离心（density gradient centrifugation） 用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使细胞分层、分离。包括速度沉降与平衡沉降两种方法。介质为氯化铯，蔗糖和多聚蔗糖。分离活细胞的介质要求： 1.能产生密度梯度，且密度高时，粘度不高； 2.PH中性或易调为中性； 3

10、.浓度大时渗透压不大； 4.对细胞无毒。 （三）密度梯度离心-速度沉降与平衡沉降二、层析法分离蛋白质（一）层析法原理（二）柱层析的分类三、蛋白质电泳 蛋白质带有电荷，具有不同的形状、大小以及净电荷的蛋白质分子在电场中具有不同的迁移速率，进而被分离。（一）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS)支持介质：聚丙烯酰胺凝胶样品处理：还原剂：巯基乙醇、二硫苏糖醇（DTT)SDS ：多肽链带上负电荷分离原理： 按照分子量的不同分离多肽。（二）等电聚焦电泳(isoelectric focusing,IEF) （三）双向电泳第四节 细胞化学和细胞内分子示踪技术一、酶细胞化学技术二、免疫细胞化学技术三、放射自显影技

11、术四、活细胞内分子示踪一、酶细胞化学技术二、免疫细胞化学技术（一）荧光素标记蛋白质细胞中的分布PHB（红色,CY5）和P53（绿色,FITC）蛋白在MG-63细胞中的分布（二）胶体金标记抗体显示PHB在细胞核基质中的分布（三）辣根过氧化物酶反应显示不同蛋白在细胞中的分布三、放射自显影技术四、活细胞内分子示踪（一）离子探针汞离子（二）绿色荧光蛋白融合蛋白GFP-NPM在EC9706细胞中（A）经姜黄素诱导凋亡后发生了显著的定位变化（B），以及在MG-63细胞中的定位（C）和HMBA诱导分化后细胞中在定位变化（D）。EC9706MG-63（三）荧光共振能量转移第五节 细胞功能基因组学研究技术一、基因的基本研究技术二、RNA干扰技术三、蛋白质相互作用研究技术四、生物芯片技术五、蛋白质组学研究技术一、基因的基本研究技术（四）荧光定量PCR技术（五）DNA测序技术（六）高通量测序（深度测序技术）PHB蛋白质在原核细胞中的表达PHB基因的RT-PCR PHB基因与pGEX-4T-2载体构建GST-PHB融合蛋白的表达质粒，并转化BL21大肠杆菌GST-PHB25 0.3 mM IPTG诱导后 GST-PHB大量表达Western确证GST-PHB的融合蛋白在在大肠杆菌BL21中的表达(以MG-63细胞蛋白作为PHB的阳性对照）表达的PHB经质谱鉴定后确认