红曲霉产麦角固醇液体培养基筛选

1、山 地 农 业 生 物 学 报2 7 ( 3 ) : 2 4 1 2 4 6 , 2 0 0 8Jou rna lof Moun ta inA gricu ltu reandB io logy红曲霉产麦角固醇液体培养基筛选 3宁玮霁 1 ,谭艾娟 1 33 ,刘爱英 1 ,吕世明 23( 1. 贵州大学 生命科学学院 , 贵州 贵阳550025; 2. 贵州大学 动物科学学院 , 贵州 贵阳550025 )摘 要 : 对红曲霉 M onascus菌株 - ZZ产麦角固醇的液体发酵培养基进行单因子筛选试验 ,结果表明 ,最佳碳源是 310g / dL 乳糖 ,最佳氮源是 210 g / dL 牛

2、肉膏 ,最佳无机盐为 1100 g / dL 硫酸镁 ; 对碳源 、氮源和无机盐进行正交 优化试验 ,结果显示 ,不同因子对麦角固醇含量的影响为 :牛肉膏 乳糖 硫酸镁 ;最佳液体发酵培养基组成为 :315 g / dL 乳糖 、210g / dL 牛 肉 膏 、 0175 g / dL M gSO4 ; 优 化 后 菌 体 中 麦 角 固 醇 的 含 量 从 61514g / g 提 高 到1 12711g / g,是原有含量的 183 % ;菌体中麦角固醇含量达细胞干重的 1113% 。关键词 : 红曲霉 ;麦角固醇 ;培养基筛选 ;正交优化 ;液体发酵中图分类号 : TQ92517; Q

3、93 - 335文章编号 : 1008 - 0457 ( 2008) 03 - 0241 - 06文献标识码 : AScreen in g the m ed ium in gred ien ts of M on a scu s sp. ZZ ferm en ted ergo stero l3N I N G W e i2ji1 , TAN A i2ju an133 , L I U A i2y ing1 , LU S h i2m ing2 ( 1. In stitu te of L ife S c iences, Gu izhou U n ive rs ity, Gu iy an g, Gu iz

4、h ou 550025, C h in a; 2. In s titu te of A n im a l S c ien ces, Gu izh ou U n ive rs ity, Gu iy a ng, Gu izh ou 550025,C h in a)A b stra c t: The m ed ium ingred ien ts of fe rm en ting e rgo ste ro l by M onascus sp. ZZ we re sc reened by single2fac to r te st. The re su lts we re de te rm ined t

5、ha t the op tim um ca rbon sou rce wa s lac to se 310 g / dL , the op tim um n itrogen sou rce wa s the beef extrac t 210 g / dL , the op tim um m ine ra l sa lt wa s M g SO4 1100 g / dL. The op tim um b ro th of fe rm en ting e rgo ste ro l of M onas2 cus sp. ZZ wa s op tim ized by o rthogona l te

6、st. The re su lt of o rthogona l te st showed tha t the con tribu tion of fac to rs to fe rm en t e rgo ste ro l we re the beef extrac t lac to se M g SO4 , and the op tim um b ro th wa s compo sed of the lac to se 315g / dL , the beef extrac t 210 g / dL , M g SO4 0175 g / dL. The e rgo ste ro l co

7、ncen tra tion in the b iom a ss of M onascus sp. ZZ wa s ra ised from61514g / g to 1 127. 1g / g, the con ten t of e rgo ste ro l wa s 1. 13% d ry we igh t of the b iom a ss.Key word s: M onascus; e rgo ste ro l; sc reen ing of m ed ium; o rthogona l te st; liqu id fe rm en ta tion麦角固醇 ( C2 8 H4 3 O

8、 H ) 又名麦角甾醇 ,化学名 称 为 2 4 - 甲 基 胆 固 醇 - 5 , 7 烯 - 3 - 羟 基 , 是 脂溶性维生素 D2 的前体 ,当受到紫外 线 照 射 时 可 转 化 为 维 生 素 D2 ; 麦 角 甾 醇 是 一 种 重 要 的 医 药 化 工原料 ,可用于“可的松 ”、“黄体酮 ”等药物的生 产 1 。目 前 国 外 主 要 采 用 微 生 物 发 酵 法 生 产 , 所 用 菌 种有酵母菌 、曲霉和青霉 ,其产量可分别达到细胞干重的 2 17 % 、2 10 % 和 1 18 %左右 2 - 3 。国内对于 酵母产麦角 固 醇 的 研 究 始 于 上 个 世 纪

9、 5 0 年 代 。朱 效 刚 等 4 利 用 固 态 发 酵 红 曲 霉 SJ S - 2 0 产 得0 18 %左右的麦角固醇 ; 陈松生等 5 以液体发酵 M on a scu s pu rpu reu s 7 2 1 得到 1 %左 右的 麦角 固 醇 , 且 液体发酵较固体发酵而言周期较短 。笔者 经过 前期 试 验筛 选得 到麦 角固 醇 高产 菌株 M on ascus sp. ZZ, 液 体 发酵 条件 优化 得 到接 种量10 % ;在此基础上 ,本研究考察了不同碳源 、氮源 、无机盐对红曲霉菌株中麦角固醇含量的影响 ,并进行 了三因素三水平的正交优化试验 ,现将结果报告如下

10、 :收稿日期 : 2008 - 03 - 27;修回日期 : 2008 - 04 - 18基金项目 : 贵州省科技厅资助项目 黔科合 GY字 ( 2005 ) 3027 作者简介 : 宁玮霁 ( 1983 - ) ,女 ,贵州贵阳人 ,在读硕士研究生 ,从事天然活性产物研究 。33 通讯作者 : E2m a il a jtan gzu. edu. cn1材料与方法1 11 材料1 11111 1112菌种红曲霉 M onascus sp. ZZ,采自福建漳州 ,保存于贵州大学真菌研究所 。培养基斜面培养基为 PDA;液体种子培养基为 PSA;基础发酵培养基为葡萄糖 215 g / dL、蛋白胨

11、115 g / dL , pH 值自然 。1 1113 主要药品碱性钾醇用 300 g /L KOH 和 40 %乙醇按体积比 VKOH V乙醇 = 2 1 配制 ;麦角固醇标准品由 Sigm a公司生产 。1 1114 主要仪器紫外分光光度计为北京普析通用仪器 TU - 1901双光束紫外可见分光光度计 。1 12 方法1 1211 菌种准备1 121111 菌种活化方法将接种好的斜面培养基置于 30 恒温培养箱内培养 57 d。1 121112 液体 种 子 培 养 方 法将 培 养 好 的 斜 面 孢 子 用 Tw een 80 轻 轻 洗 下 , 无 菌 水 调 整 浓 度 至106个

12、mL- 1 , 250mL 三角 瓶 装 PDA 50mL , 按 10 % 接 种 量 接 入 孢 子 液 , 30 , 200 r /m in 振 荡 培 养 48 50 h。1 121113 基础发酵方法250mL 三角瓶装基础发酵培养基 50mL ,将液体种子按 10 %接种量接入培养基中 , 30 , 200 r /m in培养 5 d,设 3个平行试验 ,测麦角固醇含量 ,取平均值 。1 1212 麦角固醇提取 参照文献 6 方法改进 。1 121211 麦角固醇提取 皂化 萃取法 将全部发酵产物转入离心管内 , 4 000 r /m in 离心至发酵液 澄清 ,取沉淀物于烘箱中

13、40 烘干 3 5 h,称取一定重量 (约 50m g左右 )加入碱性钾醇 20mL , 85 90 水 浴皂化 215 h,冷却至室温 。加入 20mL 乙醚 ,剧烈振荡 15m in,静置 215 h,取乙醚层 ,加入 95 %乙醇定容至50mL , 28115 nm 测吸光度 ,按公式计算 : 麦角固醇 % = ( C V N ) /W 100 % 。1 121212 麦角固醇标准曲线制作 称取麦角固醇 2124m g,用 95 %乙醇定容至 200mL 成为母液 ,配制一 系列浓度梯度溶液 。用 201000 0g /mL 标准样品在 250 400 nm 进行光谱扫描 ,以确定最大吸

14、收值 。在最 大吸收值处测定各管吸光度 ,制作标准曲线 。1 1213 碳源筛选1 121311 不同碳源对麦角固醇含量的影响将果糖 、乳糖 、大米粉 、蔗糖分别以 215 g / dL 浓度取代基础 发酵培养基中的葡萄糖进行单因子筛选试验 ,每种碳源设 3个平行试验 ,取平均值 。1 121312 不同碳源浓度对麦角固醇含量的影响 将 115 g / dL、210 g / dL、215 g / dL、310 g / dL、315 g / dL 最佳碳源分别取代基础培养基中的葡萄糖进行浓度筛选试验 ,每个浓度设 3个平行试验 ,取平均值 。1 1214 氮源筛选1 121411 不同氮源对麦角

15、固醇含量的影响将牛肉膏 、酵母膏 、NH4 NO3 、(NH4 ) 2 SO4 分别以 115 g / dL 浓 度分别取代基础发酵培养基中的蛋白胨进行单因子筛选试验 ,每种氮源设 3个平行试验 ,取平均值 。1 121412 不同氮源浓度对麦角固醇含量的影响 将 110 g / dL、115 g / dL、210 g / dL、215 g / dL、310 g / dL 最佳氮源分别取代基础培养基中的蛋白胨进行浓度筛选试验 ,每个浓度设 3个平行试验 ,取平均值 。1 1215 无机盐筛选1 121511 不同无机盐对麦角固醇含量的影响将 K2 H PO4 、KH2 POM4 、N aH2

16、PO4 、CaC l2 、M gSO4 、FeSO4分 别按 110 g / dL 添加到基础培养基中进行无机盐试验 ,每种无机盐设 3个平行试验 ,取平均值 。1 121512 不同无机盐浓度对麦角固醇含量的影响 将 015g / dL、0175g / dL、110g / dL、1125g / dL、115g / dL 最佳无机盐分别添加到基础发酵培养基中进行无机盐浓度影响试验 ,每个浓度设 3个平行试验 ,取平均值 。第 3 期宁玮霁 ,等 :红曲霉产麦角固醇液体培养基筛选2431 1216 正交试验每组设 3个平行试验 ,取平均值 。将筛选出来的碳源 、氮源 、无机盐进行正交优化试验 ,

17、按三因素三水平设计正交试验 ,用比较极差的方法进行最佳培养基配方的筛选 ,并对试验结果进行稳 定性试验 (见表 1 ) 。3表 1 L9 ( 3 )正交设计因素水平3Ta b11L9 ( 3 ) le ve l o f o rtho go n a l de s ig n fa c to r水 平碳 源氮 源无 机 盐123最佳碳源 215 g / dL最佳碳源 310 g / dL最佳碳源 315 g / dL最佳氮源 115 g / dL最佳氮源 210 g / dL最佳氮源 215 g / dL最佳无机盐 0175 g / dL最佳无机盐 1100 g / dL最佳无机盐 1125 g /

18、 dL2结果与分析2 11 麦角固醇标准曲线2 1111 麦角固醇光谱扫描结果光谱扫描的结果中 ,麦角固醇标准品呈现3 个吸收峰 , 2 个较小的吸收峰中间有一个最大 吸 收峰 , 其 中最 大吸 收峰 为 28115 nm , 符 合麦 角固 醇最 大理 论 吸收 值的 范围 280 282 nm。所以试验在 28115 nm 波长下测定麦角固醇的含量 。2 1112 麦角固醇标准曲线配制不同浓度的 10 个标准样品 ,在 28115 nm 下测定吸收值 ,作麦角固醇标 准曲线 ,结果见图 2。在图 2 的标准曲线中 , 回归方程 : 吸光度 = 01025 7 C + 01013 5 ,

19、相 关系 数 : R2 =01999 7。方程表明 ,麦角固醇在 121210918g /mL 范围内与吸光度呈现良好的线性关系 。可以用来检测样品中的麦角固醇含量 。2 1113 基础发酵菌体中麦角固醇的含量为 61514g / g。2 12 不同碳源对麦角固醇含量的影响从表 2可见 ,当乳糖为碳源时 ,麦角固醇含量最高 ,菌体含 92411g / g麦角固醇 ,因此在上述 5种碳源 中乳糖为最佳碳源 。2 13 不同浓度乳糖对麦角固醇含量的影响从表 3可见 ,随乳糖浓度升高 ,麦角固醇的含量逐渐升高 。当乳糖为 310 g / dL 时 ,菌体中所含的麦角 固醇达到最大值 ( 1 0241

20、1g / g) ,之后有降低趋势 ,这和菌体中麦角固醇富集产生对合成过程中 HM G - CoA 还原酶的抑制有关 ,也和菌体中和乳糖分解代谢相关的酶趋于饱和不再结合底物有关 。表 2 不同碳源对麦角固醇含量的影响表 3 不同浓度乳糖对麦角固醇含量的影响Ta b13 E ffe c t o f la c to se co n c e n tra tio n o n the co n te n t o f e rgo s te ro lTa b12E ffe c t o f ca rbo n so u rc e s o n theco n te n t o f e rgo s te ro l麦角

21、固醇含量 (g / g)乳糖浓度 ( g / dL )生物量 ( g)麦角固醇含量 (g / g)碳 源生物量 ( g)1152102153107971690818922141 024110110011601180122大米粉417148011758514924116101901990139019801170144果蔗乳糖糖糖葡萄糖 315 1 01411 0114 2 14 不同氮源对麦角固醇含量的影响从表 4可见 ,不同氮源对菌体中麦角固醇的含量影响更为明显 。在 5种氮源中 ,牛肉膏最有利于菌体 产生麦角固醇 ,菌体中麦角固醇可达 1 12818g / g,因此 ,牛肉膏为最佳氮源 。2

22、 15 不同浓度牛肉膏对麦角固醇含量的影响从表 5可见 ,随着牛肉膏浓度的增加 ,菌体中麦角固醇的含量随之增高 。当牛肉膏浓度为 210 g / dL时 ,达到高峰值 ( 1 35111g / g) ,以后 ,麦角固醇的含量随之降低 。这与麦角固醇的产物抑制有关 ,因此 ,210 g / dL牛肉膏有利于麦角固醇的产生 。表 4 不同氮源对麦角固醇含量的影响表 5 不同浓度牛肉膏对麦角固醇含量的影响Ta b15 E ffe c t o f b e e f e x tra c t co nc e n tra tio n o n the co n te n t o f e rgo s te ro

23、lTa b14E ffe c t o f n itro g e n so u rce s o n theco n te n t o f e rgo s te ro l麦角固醇含量 (g / g)牛肉膏浓度 ( g / dL )生物量 ( g)氮 源麦角固醇含量 (g / g)生物量 ( g)1101152102151 071191 123101 351111 109140132014801550142酵母膏牛肉膏 蛋白胨N aNO3739141 1281861115362170199014701421175 310 97019 0131 (NH4 ) 2 SO 4 94218 0158 2 1

24、6 不同无机盐对麦角固醇含量的影响从表 6可见 , 6种无机盐中 ,能释放出 H + 的无机盐都有利于菌体生物量的增加 ,这和红曲霉是一种嗜酸2 +性真菌有关 。试验中的无机盐均有利于麦角固醇的产生 ,其中 M gSO4 效果最好 。这与 M g 是大多数还原酶的辅酶 ,因而能增强麦角固醇合成代谢中的多种还原酶活性有关 。因此 ,选择 M gSO4 为最佳无机盐 。2 17 不同浓度 M gSO 4 对麦角固醇含量的影响从表 7可见 ,随着 M gSO4 浓度的增加 ,麦角固醇的含量和菌体生物量也不断增加 。在 M gSO4 浓度为1100 g / dL 时达到最大值 ( 95719g / g

25、) ,之后 ,麦角固醇含量呈现下降趋势 。因此 , 1100 g / dL M gSO4有利于 麦角固醇的产生 。单因子筛选试验结果表明 ,最佳碳源为乳糖 、最佳氮源为牛肉膏 、最佳无机盐为 M gSO4 。表 7 不同浓度 M g SO 4 对麦角固醇含量的影响Ta b17 E ffe c t o f M gSO 4 co nc e n tra tio n o n the co n te n t o f e rgo s te ro l表 6Ta b16不同无机盐对麦角固醇含量的影响E ffe c t o f d iffe re n t ino rga n ic sa lt o n the c

26、o n te n t o f e rgo s te ro l无 机 盐麦角固醇含量 (g / g)生物量 ( g)M gSO4 浓度 ( g / dL )麦角固醇含量 (g / g)生物量 ( g)K2 H PO4KH2 PO4N aH2 PO4CaC l2M gSO4FeSO48151678614864128301195714813141105110011210138015501980150017511001125761148651895719849140142014601500165 1150 76113 0121 第 3 期宁玮霁 ,等 :红曲霉产麦角固醇液体培养基筛选2452 18 正

27、交试验从表 8的正交试验极差分析结果可见 ,牛肉膏对麦角固醇含量产生的影响最大 ,其次是乳糖 , M gSO4对麦角固醇产生影响最小 ;经方差检验发现 ,各个因素对麦角固醇在菌体中含量的影响显著 ,其主次为 :牛 肉膏 乳糖 M gSO4 ; 2种数据检验得到的结果一致 。因此 ,优化后培养基配方为 : 315 g / dL 乳糖 、210 g / dL 牛肉膏 、0175 g / dL M gSO4 ,自然 pH 值 。表 8 正交试验结果及极差分析Ta b18O rtho go na l te s t re su lts a nd ra ng e a na ly s is麦 角 固 醇 含

28、 量 (g / g)试 验 号碳 源氮 源无 机 盐123456789 R SS M SF1112223332 265182 902162 867186361885 446120742 72311036113431231231232 370153 283152 382119121985 233157242 61617866121932132313122 877192 693142 464184131135 439104517 7191523611033655199701363916924121 0341894316790141 2781479819用优化后培养基配方进行 3次重复试验 ,得到较

29、为稳定的结果 (见表 9 ) 。表 9 正交稳定性试验讨论3Ta b19 O rtho go na l s ta b ility te s t试验号麦角固醇含量 (g / g)生物量 ( g)3 11 因为有机氮源不仅仅提供培养基中氮元素 ,其氨基酸碳 骨 架 也 能 以 乙 酰 Co - A、 - 酮 戊 二 酸 、琥珀酰 Co - A 等形式进入碳素循环 , 所以 , 有 机氮源同时可以提供碳素和氮素 ,因此在液体发酵123平均值1 125131 184141 071181 127110181018001790180培养基中添加氮源能促使菌体进一步生长 。经过单因子筛选和正交试验 ,发现不

30、同氮源对菌体中麦角固醇的含量影响最大 ,说明氮源在菌体生长发育和麦角固醇合成代谢中有着重要作用 。3 12 通过培养基的优化使得菌株 - ZZ的生物量从优化前的 014 g提高到 018 g;麦角固醇的含量从优化前 的 61514g / g提高到 1 12711g / g,是原有含量的 183 % ; 菌体中麦角固醇含量达细胞干重的 11127 % , 符 合课题“新型三高一低 优质红曲产品研发 ”(即高莫纳可林 、高麦角固醇 、高色价和低橘霉素 )的要求 , 具有较好的市场应用前景 。3 13 有研究表明 ,麦角甾醇是真菌细胞膜的重要组分 ,其在确保膜结构的完整性 、与膜结合酶的活性 、膜

31、的流动性 、细胞活力及物质运输等方面起着重要作用 7 。一旦麦角甾醇缺乏 ,必将引起真菌细胞膜功能异常 ,甚至发生细胞破裂 8 - 9 。真菌中甾醇必须保持一定水平才能起到生理作用 ,细胞中过量甾醇在甾醇 酰基转移酶作用下酯化为甾醇酯储存在胞液内 ,也就是说 ,甾醇酰基转移酶的活性关系到菌体细胞中麦角 固醇含量的提高 。何秀萍等 10 通过克隆甾醇酰基转移酶基因并构建质粒 ,质粒中的基因在菌体中得到了表达 ,使细胞内甾醇酯化水平升高 ,致使细胞麦角固醇含量的提高 。这为今后的红曲霉菌株 - ZZ的研究 方向有一定的提示作用 。参考文献 : 1 邓玉清 ,王 纪 , 虞 龙. 微生物麦角甾醇的研

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