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文档简介

1、实验八植物细胞骨架的光学显微镜观察实验目的实验原理仪器、材料与试剂实验步骤实验报告及思考题1 实 验 目 的了解细胞骨架的结构特征及其制备技术2实 验 原 理 细胞骨架（cytoskeleton）是指真核细胞中的蛋白纤维网架体系。广义的细胞骨架包括细胞核骨架、细胞质骨架、细胞膜骨架和细胞外基质。狭义的细胞骨架是指细胞质骨架，包括微丝（microfilament，MF， 57nm ）、微管（microtubule，MT，2025nm）、中间纤维（intermediated filament，IF，811nm）。 细胞（特别是真核细胞）中的骨架系统，不仅仅是活细胞的支撑结构，决定细胞的形状，而且与

2、细胞运动、物质运输、能量转换、信息传递、细胞分裂、基因表达、细胞分化、极性生长等生命活动密切相关。3细胞骨架在通常固定条件下不稳定，如低温、高压、锇酸处理，而且MF、MT、IF都是直径非常小的结构，只有在电镜下才能够观察到。研究细胞骨架常规的实验方法：电镜观察、组织化学、免疫荧光等本实验采用的特殊方法4Triton X100Triton X100是一种非离子型去垢剂，可以除去可溶性蛋白质和脂类，而微丝束不会被Triton 破坏而保留在细胞中。通过Triton的处理去掉了一部分杂蛋白，使细胞骨架显现更清晰。M缓冲液成分：咪唑、EDTA、EGTA、MgCL2等咪唑是一种缓冲剂；EDTA熬合Ca、M

3、g离子；EGTA熬合Ca离子，不熬合Mg离子；保持一种低钙低镁的条件。使骨架纤维保持在聚合状态并且较为舒张。考马斯亮蓝R250是一种普通的蛋白质染料，可以使细胞内各种蛋白质染色。本实验中，有些骨架纤维不稳定，如微管；有些纤维太细，在光学显微镜下无法分辨。在实验中观察到的纤维主要是微丝束，由许多微丝结合在一起，直径约在40nm左右，考马斯亮蓝R250染色对微丝束的显示起了夸大的作用。5 实 验 步 骤1）撕取洋葱鳞茎内表皮约1cm2，放入盛有5 mL pH6.8的磷酸盐缓冲液的小培养皿中，使其下沉（或浸没5min）。 2）吸去缓冲液，用1%TritonX-100处理洋葱表皮25 min。（3mL

4、） 3）吸去TritonX-100，用M-缓冲液充分洗3次，每次约3 min。（3mL） 4）加3%戊二醛固定20min。（5mL） 5）用磷酸缓冲液洗3次，每次3min。（3mL） 6）0.2%考马斯亮蓝R250染色20 min。（3mL） 7）用自来水洗数遍，降低背景。 8）将样品置于载玻片上，加盖玻片，在光学显微镜下观察。6结果观察将制好的片子置于光镜的低倍镜下，可见到规则排列的长方形洋葱表皮细胞轮廓，细胞内可见到被染成兰色的粗细不等的分枝状结构，这便是细胞骨架。转高倍镜继续观察，调节小镙旋可见到细胞骨架的立体结构。7注意事项撕取洋葱鳞茎内表皮不可带茎肉。样本要展开铺平去垢处理要掌握好时间和温度染色时间需掌握好，必要时可分别不同时间染色观察时选择平展染色适中的部位观察染色时统一到水槽旁边染色，不要污染桌面滴

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