实验一 细胞形态及细胞器的观察

1、细胞生物学实验实验课要求1.安全第一。2.认真听课，随时发问。3.上课期间不要吃东西，手机调到震动。4.缺课1/3以上者直接进入重修。5.成绩包括：实验报告，平时成绩，期末小考。2实验一 细胞形态及细胞器的观察实验目的（1）学习普通光学显微镜的构造和原理，重点掌握光学显微镜的规范操作方法。（2）观察动植物细胞的细胞及其细胞器结构，重点观察有丝分时期的形态结构特征及染色体的变化规律。3实验用品普通光学显微镜以及动植物细胞装片。口腔上皮细胞，洋葱鳞茎表皮细胞，洋葱根尖细胞。4主要内容显微镜的发展显微镜的光学原理显微镜的几个基本概念显微镜的结构显微镜的使用观察细胞及细胞器的形态-实际操作5几个重要的

2、分辨率人眼：0.2mm光学显微镜：0.2um电子显微镜：0.2nm61.显微镜的发展1.1 人眼：人眼观察物体的能力是有限的。一般的情况下，在25cm的明视距离内，人眼只能分辨相距0.1-0.2mm的两个物体。也就是说，当两个物体相距不到0.1mm的时候，人眼就会把它们看成是一个物体了。这个极限便称为人眼的分辨本领。 7 1.2 放大镜：约在四百年前眼镜片工匠们开始磨制放大镜。当时的放大镜的放大倍数只有35x 1.3 显微镜： 1590年，荷兰和意大利的眼镜制造者造出类似显微镜的放大仪器。 16731677年期间，列文胡克制成单组元放大镜式的高倍显微镜 19世纪70年代，德国人阿贝奠定了显微镜

3、成像的古典理论基础。 1850年出现了偏光显微术； 1893年出现了干涉显微术； 1935年荷兰物理学家泽尔尼克创造了相衬显微术， 89 1611年，德国天文学家开普勒用两片双凸透镜分别作为物镜和目镜，使放大倍数有了明显的提高，以后人们将这种光学系统称为开普勒式望远镜。人们用的折射式望远镜还是这两种形式，天文望远镜一般是采用开普勒式。 10罗伯特虎克制造的显微镜（1665）放大倍数：140倍 11121314152 显微镜的光学原理折射和折射率 光线在均匀的各向同性介质中，两点之间以直线传播，当通过不同密度介质的透明物体时，则发生折射现象，这是由于光在不同介质的传播速度不同造成的。16 2.2

4、凸透镜的五种成象规律(1) 当物体位于透镜物方二倍焦距以外时，则在象方二倍焦距以内、焦点以外形成缩小的倒立实象； (2) 当物体位于透镜物方二倍焦距上时，则在象方二倍焦距上形成同样大小的倒立实象； (3) 当物体位于透镜物方二倍焦距以内，焦点以外时，则在象方二倍焦距以外形成放大的倒立实象； (4) 当物体位于透镜物方焦点上时，则象方不能成象； (5) 当物体位于透镜物方焦点以内时，则象方也无象的形成，而在透镜物方的同侧比物体远的位置形成放大的直立虚象。17显微镜的成像原理 显微镜和放大镜起着同样的作用，就是把近处的微小物体成一放大的像，以供人眼观察。只是显微镜比放大镜可以具有更高的放大率而已。

5、 物体位于物镜前方，离开物镜的距离大于物镜的焦距，但小于两倍物镜焦距。所以，它经物镜以后，必然形成一个倒立的放大的实像AB。 AB靠近F2的位置上。再经目镜放大为虚像AB后供眼睛观察。目镜的作用与放大镜一样。所不同的只是眼睛通过目镜所看到的不是物体本身，而是物体被物镜所成的已经放大了一次的像。 18193 显微镜的几个基本概念3.1 光源：能发射光波的物体。 可见光频率范围：7.51014 - 3.91014 Hz。 真空中对应的波长范围：390nm 760nm 相应光色：紫、蓝、青、绿、黄、橙、红203.2分辨率(鉴别距离)：显微镜能分辨的最小距离，用D表示。显微镜的鉴别距离越小，分辨率越高

6、。 D=0.61/ nsin D：分辨率 :光波的波长 N:介质折射率 :物镜镜口角3.3孔径角：由标本上一点发出的进入物镜最边缘光线L和进入物镜中心光线OA之间的夹角称为孔径角。3.4数值孔径：NA = nsin , 叫物镜的数值孔径。 数值孔径与显微镜的分辨率有密切关系，越短，NA越大，分辨率越高。21物镜数值孔径22 在显微镜下所看到的物像和实际物体之间的大小比例叫显微镜的放大率或放大倍数。显微镜下物像的放大主要由物镜、镜筒长度、目镜所决定。适合的放大倍数决定于物镜的数值孔径，一船应为数值孔径的5001000倍。显微镜的总放大率（Mt)应为：Mt=MobMeMob：物镜放大率Me：目镜放

7、大率3.6放大率23像差球差象散慧差场曲负畸变正畸变24色差25色差校正263.7焦点深度 在显微镜的光轴上有一段距离范围内物体被看得清晰。超出这段距离的物体就模糊不清。这段距离位于显微镜焦点的上下很小的范围之内。这段距离的上下限叫焦点深度。27焦点深度283.8视场数 目镜中观察到的物像的一定范围叫视野。 显微镜的总放大率小的时候所能看到的标本的范围大，而总放大率愈大所能看到的标本的局部愈小。所以说视野与显微镜的总放大率成反比。 在同一总放大率的条件下视野也可有大小差别。这种差别决定于目镜的某些性能。首先目镜的视场光栏的直径是最主要的条件。视场光栏的直径叫目镜的视场数值293.9工作距离 工

8、作距离也叫物距，即指物镜前透镜的表面到被检物体之间的距离。 在物镜数值孔径一定的情况下，工作距离短孔径角则大。 数值孔径大的高倍物镜，其工作距离小。 30提高显微镜分辨率的方法：（1）增大物镜的数值孔径在物镜和盖玻片之间充以n 较大的油，如香柏油n =1.52,不仅使n 增大，而且孔径角 也增大。（2）用短波长的光照射如紫外光显微镜，电子显微镜。314 显微镜的结构组成光学放大系统照明系统机械和支架系统物镜光源折光镜聚光镜滤光片目镜32光学显微镜基本结构：1. 照明灯(Lamp)2. 聚光器(Condenser)3. 载物台和切片夹(Mechanical stage and specimen

9、retainer)4. 推进器(Mechanical stage adjustment knob)5. 物镜(Objectives)6. 粗细螺旋(Course and fine focus knob)7. 目镜(Oculars)8. 照相机等接口(Connection to camera, etc.)33344.1物镜 物镜(objective)是光学显微镜成像系统中决定其分辨率或叫分辨本领的最关键部件。 (1)消色差物镜(achromat) 色差校正使可见光中红光和蓝光聚焦于一点，而黄绿光则聚焦于另一点。能够消除光谱中红光和蓝光所形成的色差。这种物镜与目镜配用时可达到消色差物镜所要求的光学

10、性能。 (2)复消色差物镜(apochromat) 是性能最高的物镜。能消除可视光中黄、红、蓝即包括几乎所有谱线在成像过程中所造成的色差。35 (3)平象物镜 它们所成的影象基本上是平的，象场弯曲很小，不会发生视野中心与边缘不能同时准焦的现象，因此对目视观察及显微摄影都极为方便。平象物镜由于将弯曲的影象展平，在同样放大倍数下它成的影象比用一般物镜要大一点。在平象物镜的金属外框上，刻有Flanachr、 planapo、 plan 等字样。 (4)相差物镜 相差物镜(Phasencontrast objective)的一个透镜片上喷涂着一层环状金属膜板叫相位板。相位板是相差显微镜的关键部件。它和

11、相差显微镜的聚光镜上的的环状光栏相配合使用。有关位相板涂料的性质和作用原理在以后详述。 外壳上刻有Ph标记 36物镜结构37物镜壳上的标志：(1)物镜的种类APO(复消色差物镜)FL(萤石物镜或半复消色差物镜) PL(平场物镜)PLFL(平场萤石物镜）PLAPO(平场复消色差物镜)38 2)放大倍数用数字表示，如4、10、20、40和100等。(3)数值孔径（NA）如100.25，400.65和1001.3(4)标准机械筒长 160mm、170mm或(5)需用盖片情况1600.17 1600或160-；0或-39物镜标识404.2目镜 目镜的作用是把物镜放大的实象再放大一级，并把物象映入观察者

12、的眼中，实质上目镜就是一个放大镜。显微镜的分辨率能力是由物镜的数值孔径所决定的，而目镜只是起放大作用。对于物镜不能分辨出的结构，目镜放的再大，也仍然不能分辨出。4.3聚光镜 聚光镜装在载物台的下方。小型的显微镜往往无聚光镜，在使用数值孔径0.40以上的物镜时，则必须具有聚光镜。聚光镜不仅可以弥补光量的不足和适当改变从光源射来的光的性质，而且将光线聚焦于被检物体上，以得到最好的照明效果。41 聚光镜光栏 所谓光栏，从广义的角度可指一切限制入射光束截面的框孔都可认为光栏。 聚光镜光栏作用 （1）改变聚光镜的数值孔径以便与物镜的数值孔径相匹配，可调整图象的分辨率和反差。 （2）辅助调整亮度。4243

13、5 光学显微镜的使用实验时要把显微镜放在座前桌面上稍偏左的位置，镜座应距桌沿 67 cm左右。打开光源开关，调节光强到合适大小。转动物镜转换器，使低倍镜头正对载物台上的通光孔。 将所要观察的玻片放在载物台上，使玻片中被观察的部分位于通光孔的正中央。先用低倍镜观察（4X）。观察之前，先转动粗动调焦手轮，使载物台上升，物镜逐渐接近玻片。需要注意，不能使物镜触及玻片，然后，通过目镜观察，并转动粗调焦手轮，使载物台慢慢下降，直到看清物像。44如果像偏离视野，可慢慢调节载物台移动手柄。瞳距调节：左右推拉目镜，使两目镜距离与自己两眼距离相等。高倍物镜观察：把物像中需要放大观察的部分移至视野中央。将高倍物镜

14、转入光路（一般具有正常功能的显微镜，低倍物镜和高倍物镜基本齐焦，在用低倍物镜观察清晰时，换高倍物镜应可以见到物像，但物像不一定很清晰），微动调焦手轮进行调节。根据需要调节孔径光阑的大小或聚光器的高低，使光线符合要求（一般将低倍物镜换成高倍物镜观察时，视野要稍变暗一些，所以需要调节光线强弱）。45瞳距调节46屈光度调节47光学显微镜的维护 显微镜要轻拿轻放。严禁将表面有水的载片放到显微镜上。从低倍转入高倍应能看到图象，否则需转入低倍另行调节、查找原因。每次使用完毕后将将光源亮度调至最低。临时不用显微镜只需将光源亮度调至最低而无需关闭。忌频繁开关显微镜电源。镜头脏污只能用专用工具经专门程序清洗。使

15、用完毕等灯箱冷却后罩上防尘罩或放入箱内，并存于干燥无尘处。48观察细胞及细胞器的形态口腔上皮细胞49洋葱表皮鳞状细胞50植物和动物细胞形态差别动植物细胞都可以观察到细胞核动物细胞没有细胞壁（形状不规则）植物细胞具有细胞壁（形状较为规则）51洋葱根尖细胞52细胞有丝分裂根据细胞形态结构的变化，将有丝分裂人为地划分为6个时期：前期(prophase)、前中期(premetaphase)、中期(metaphase)、后期(anaphase)和末期(telophase)、胞质分裂。53前期Prophase（1）染色质(chromatin)凝缩成染色体(由两条染色单体组成)；（2）中心体(centros

16、ome)移向两极，分裂极确立，纺锤体(spindle)开始装配；（3）核仁(nucleonus)消失，核被膜裂解；前中期Prometaphase（1）染色体进一步凝集浓缩，变粗变短；（2）纺锤体形成，纺锤丝捕获染色体，并拉动染色体向纺锤体赤道面移动。54中期metaphase（1）所有染色体排列到赤道板(equatorial plate)；（2）纺锤体呈典型的纺锤样，位于染色体两侧的动粒微管长度相等，作用力均衡。后期anaphase中期染色体的两条染色单体相互分离，形成子代，并分别向两极运动。(1)后期Aanaphase A:动粒微管缩短，拉动染色单体移向两极；(2)后期Banaphase B:极性微管延长，两极间距离逐渐增长；55末期telophase（1）色单体到达两极，并开始去浓缩变成染色质，核仁重新出现，核膜开始重新装配，形成子代细胞核；（2）动粒微管消失，