培养基与无菌技术二

1、培养基与无菌技术（二）一、无菌技术1、定义指在微生物实验工作中，控制或防止各类微生物的污染及其干扰的一系列操作方法和有关措施。一、无菌技术二、培养基的配制目的：防止外来杂菌，获得纯净的培养物。2、实现无菌的常用方法2、实现无菌的常用方法灭菌：采用相对较为温和物理或化学方法，杀死物体表面或内部部分的微生物（不包括芽孢和孢子）。常见的方法：煮沸法、紫外线法、巴氏法以及利用化学药品等1常用方法主要操作适用对象煮沸法100oC煮沸5-6min耐高温的液体或物品巴氏法70-75oC 煮 30min 或80oC煮15min牛奶等不耐高温的液体紫外线30W 紫 外 灯 照 射 30min接种室、接种箱、超净

2、工作台化学药物体积分数 50%-70%的乙醇食醋3-5mL/m3熏蒸石灰水1-3%升 0.1%高锰酸钾过氧化氢结晶紫 漂白粉皮肤及器械空气地面植物组织表面皮肤伤口外用紫、浅口洗刷培养皿、饮水消毒：2、实现无菌的常用方法灭菌 灭菌：指用孢子）。理化杀死物体内外所有的微生物（包括芽孢和常见的灭菌方法：灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌等2、实现无菌的常用方法 灭菌：2常用灭菌方法主要操作适用对象灼烧灭菌在灯火焰的充分燃烧层灼烧接种环、接种针或其他金属工具，试管口或瓶口等干热灭菌干热灭菌箱160170oC 加热12h耐高温的、需要保持干燥的玻璃器皿（吸管、培养皿等）、金属用具等高压蒸汽灭菌100kpa

3、,121oC 持530min培养基、无菌水、工作服等物品的灭菌，也可用于玻璃器皿的灭菌拓展：过滤灭菌是通过过滤介质吸附或筛除去除微生物的方法。 过滤灭菌主要用于那些不适合高压灭菌的，例如细胞培养液，里面含有细胞生长必须的一些营养成分，氨基酸等。过滤灭菌的有效性主要取决于被滤溶液中存在的微生物，所以要根据被滤溶液中存在的微生物情况，选择适宜孔径的滤膜，如常见规格，孔径0.22m或0.3m的滤膜。拓展：过滤灭菌3、主要内容主要包括三个方面：无菌环境设施、无菌实验器材、无菌操作方法 无菌实验器材：凡是实验中使用的器材，能灭菌处理的必须灭菌，如玻璃器皿（包括注射器、吸管、滴管、三角瓶、试管等）、培养基

4、、无菌衣、等，无法灭菌处理的，使用前必须经处理，例如无菌室内的凳、试管架、天平等，这些虽然无法灭菌，但是可以用化学药品熏蒸、喷洒或擦拭。，可 无菌环境设施：无菌环境只是相对而言，指人们利用物理的方法或化学的方法，在某一可控制空间内使微生物数量降低至最低限度，接近于无菌的一种空间。主要方法：无菌室 无菌柜超净工作台3 无菌操作方法：a.对实验操作的空间、操作者的衣着和手，进行清洁和 无菌操作方法：d. 实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触；e. 使用过的培养基及培养物等必须经过灭菌处理后才能丢弃，以防止培养物的扩散；;b.将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌

5、;c.为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在行;灯火焰附近进注意：通常，可在灯旁进行实验；小规模的操作可以使用无菌箱或超净工作台，工作量大的使用无菌室，要求严格的可在无菌室内再结合使用超净工作台。点对点练习【例1】高压灭菌锅点对点练习【例3】牛奶、玻璃吸管、接种环、培养基、空气灭菌的方式依次是（的直接原因是（）A 高压 B 高温CD 高压加灼烧灭菌 巴氏干热灭菌 紫外线高压蒸汽灭菌A B C D 4【例5】下列关于无菌技术的理解，错误的是（【例4】下列无菌操作中，错误的是（）无菌技术能对实验操作的空间进行无菌技术能将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基进行灭菌 C无菌技术不能防止操作者自

6、身携带微生物污染实验D无菌技术包括避免已经灭菌处理的材料用具与周围物品的接触A 无菌操作的目的是防止杂菌污染B 用擦拭双手的方法对操作者进行C 实验操作过程应在灯火焰附近进行D 玻璃器皿（吸管、培养皿）可用擦拭二、培养基的配制1、培养基的配制原则 选择适宜的营养物质总体而言，所有微生物生长繁殖均需要培养基含有碳源、氮源、无机盐、生长因子、水及能源，但由于微生物营养类型复杂，不同微生物对营养物质的需求是不一样的，因此首先要根据不同微生物的营养需求配制针对性强的培养基。 营养物质浓度及配比合适培养基中营养物质浓度合适时微生物才能生长良好，营养物质浓度过低时不能满足微生物正常生长所需，浓度过高时则可

7、能对微生物生长起抑制作用。 控制条件各类微生物生长繁殖或产生代谢产物的最适条件各不相同，一般来讲，细菌与放线菌适于在77.5范围内生长，酵母菌和霉菌通常在4.56范围内生长。值得注意的是，在微生物生长繁殖和代谢过程中，由于营养物质被分解利用和代谢产物的形成与积累，会导致培养基发生变化，若不对培养基条件进行控制，往往导致微生物生长速度下降或(和)代谢产物产量下降。因此，为了维持培养基的相对恒定，通常在培养基中加入缓冲剂，常用的缓冲剂是一氢和二氢磷酸盐(如KH2PO4 和K2HPO4)组成的混合物。 灭菌处理5二、培养基的配制2、培养基的配制流程以牛肉膏蛋白胨固体培养基为例： 计算：根据牛肉膏蛋白

8、胨培养基配方的比例，计算制作 100mL 的培养基时，各种成分的用量。 称量：准确地称取各种成分。 溶化：将称好的牛肉膏连同称量纸一同放入烧杯，加入少量的水，加热。当牛肉膏溶化并与称量纸分离后，用玻璃棒取出称量纸。往烧杯中加入称量好的蛋白胨和氯化钠，用玻璃棒搅拌，使其溶解。加入琼脂加热使其熔化。在此过程中不断用玻璃棒搅拌，防止琼脂糊底而导致烧杯破裂。当琼脂完全熔化后，补加蒸馏水至 100mL。计算称量溶(熔)化调灭菌倒平板 调性。：培养霉菌时需将调至酸性，培养细菌时需将调至中 灭菌：注意事项：a.灭菌的主要 灭菌：将配制好的培养基转移到锥形瓶中，加棉塞，包上牛皮纸，放入高压灭菌锅，在压力为 1

9、00kPa，温度为 121的条件下，灭菌 1530min。是温度而不是压力。因此高压锅内冷空气必须完全排尽后，才能关上排气阀，维持所需压力;b.灭菌所需时间到后，切断电源，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力降至“0”时，打开排气阀，打开盖子，取出灭菌物品。6 倒平板：待培养基冷却至 50左右时，在21灯火焰附近倒平板。倒平板操作：将灭过菌的培养皿放在火焰旁的桌面上，右手拿装有培养基的锥形瓶，左手拔出棉塞；右手拿锥形瓶，使瓶口迅速通过火焰；用左手将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，右手将锥形瓶中的培养基（约 1020mL）导入培养皿，左手立即盖上培养皿的皿盖；等待平板冷却凝固后，将平板倒置过来

10、放置，使皿盖朝下，皿底在上。43 倒平板：为何平板要倒置放置？2、培养基的配制流程 倒平板：快告诉我是为什么？否则。7二、培养基的配制2、培养基的配制流程以牛肉膏蛋白胨固体培养基为例：考点：培养基的配制有关倒平板的操作错误的是（）将灭过菌的培养皿放在火焰旁的桌面上使打开的锥形瓶瓶口迅速通过火焰将培养皿打开，培养皿盖倒放在桌子上等待平板冷却凝固后需要倒过来放置计算称量溶(熔)化调灭菌倒平板点对点练习【例7】下列操作属于灭菌方法的是（【例8】关于灭菌和的不正确理解是（）A 灭菌是指杀灭环境中的一切微生物包括芽孢和孢子B和灭菌实质上是相同的，都能杀死一切微生物A接种前用棉球擦拭双手和工作台面C 接种

11、环用灼烧法灭菌B接种中试管口等易被污染的部位通过火焰 C牛奶在 80下煮 15min 以杀死其中的微生物D氯化 溶液浸泡外植体 12min 后无菌水冲洗D 常用法、灭菌方法有加热法、过滤法、紫外、化学药物8【例9】和灭菌是两个不同的概念，灭菌是指彻底杀灭微生物使其永远【例10】（1）在大肠杆菌培养过程中，除考虑营养条件外，还要考虑、和渗透压等条件。由于该细菌具有体积小、结构简单、变异类型丧失生长繁殖的能力仅指杀死一部分对有害的病原菌而容易选择、对被的物体基本无害下列哪些事物适用于处理（）等优点，因此常作为遗传学的实验材料。皮肤果汁饮用水 牛奶 注射器 培养皿酱油 手术刀接种环培养基（2）在微生物培养操作过程中，为防止杂菌污染，需对培养基和培养器皿进行(、灭菌)；操作者的双手