预测的SARS冠状病毒刺突蛋白S2亚基B细胞表位肽在大肠杆菌中的表

1、猜测的SARS冠状病毒刺突卵白S2亚基B细胞表位肽在大肠杆菌中的表冯宇,万敏,王宣军,张培因,于永利,王丽颖【关键词】SARS冠状病毒刺突卵白;,B细胞表位猜测;,朋友10分子;,S2亚基ExpressinfpreditedBellepitpepeptideinS2subunitfSARSrnavirusspikeprtEininE.liandidentifiatinfitsiiantigeniityKeyrdsSARSspikeprtein;Bellepitpepreditin;haperne10;S2subunit摘要目的:研究猜测的SARS冠状病毒刺突卵白S2亚基B细胞表位肽在大肠杆菌中

2、的表达及其模拟S2卵白的抗原性。要领:用DNAStar软件对S2亚基序列举行阐发,猜测B细胞表位地点肽段。通过4轮PR反响人工搭建猜测表位DNA序列并克隆到含有朋友10基因的pET28a(+)载体中,组成重组载体pET28hap10S2epi。重组卵白hap10S2epi在E.liBL21(DE3)中表达并以SDSPAGE和esternblt举行断定。用纯化的hap10S2epi免疫家兔制备抗血清,并通过ELISA断定hap10S2epi的抗原性。结果:乐成构建并在大肠杆菌中表达了hap10S2pei交融卵白。hap10S2epi免疫的抗血清能识别真核细胞表达的SARS冠状病毒全长S2刺突卵白

3、。结论:猜测的SARS冠状病毒S2刺突卵白B细胞表位肽可以或许诱导家兔产生针对S2卵白的抗体,为研制抗SARS病毒基因工程疫苗奠基了基矗关键词SARS冠状病毒刺突卵白;B细胞表位猜测;朋友10分子;S2亚基SARS冠状病毒刺突卵白spikeprtein是组成病毒衣壳突起的重要布局卵白,在病毒侵袭宿主细胞历程中发挥紧张生物学成效:与宿主细胞外貌受体结合,并介导病毒与宿主细胞膜交融使病毒进入宿主细胞1,2。S卵白由S1、S2两个亚基组成,此中S2亚基序列相对守旧并到场病毒与宿主细胞膜交融历程,被以为是产生中和性抗体的紧张抗原区3,4。因此,S2卵白与SARS病毒的高度易感性严密相干。为进一步探究S

4、2卵白成效,本研究中利用分子生物学软件对S2卵白的B细胞表位举行了多参数猜测,并按照猜测结果用人工合成的要领构建了朋友10S2表位肽交融基因,在E.liBL21(DE3)中表达的表位肽交融卵白与真核表达的全长S2卵白有部门配合的抗原性,这为进一步研究S2卵白成效及研制抗SARS病毒疫苗打下了基矗1质料和要领1.1质料ERI、NI及HindIII购于宝泰克生物公司。DNA聚合酶、T4DNA毗连酶购自美国Prega公司。抗组氨酸单克隆抗体Ab、HRP标识表记标帜的羊抗鼠IgG、HRP标识表记标帜的羊抗兔IgG、卡那霉素、氨苄青霉素及IPTG均购自Siga公司。硝酸纤维素膜N购自美国Shleiher

5、Shuell公司。pET表达体系购自美国Nvagen公司。载体pD18T购于大连宝生物生物工程公司。DNA接纳试剂盒购自鼎国公司。E.liJ109、BL21由本室保存。用于扩增S2基因的引物由上海生工生物工程公司合成。1.2要领2结果2.1B细胞表位的猜测及DNA段的构建用DNAStar对SARS病毒基因序列编号为AY707461S2卵白中大概B细胞表位举行猜测,综合阐发种种参数,选择抗原指数大于0,亲水性指数大于0,氨基酸位于卵白分子外貌大概性大于1而且相近柔性布局的氨基酸区段作为猜测的B细胞表位。末了选择位于S2卵白N端第5-122个氨基酸区段作为包罗猜测B细胞表位的区段举行克隆构建图1。

6、图1S2卵白亲水性地区、抗原指数、氨基酸外貌大概性及二级布局柔性地区阐发略Fig1TheultiparaeterpreditinfS2subunitfSARSrnavirusspikeprtEin2.2hapS2重组质粒的构建与断定按照表位猜测结果方案4对PR引物,从中心向两头颠末4轮PR反响合成400bp摆布的SARS冠状病毒S2卵白区大概的B细胞表位编码基因定名为S2epi图2,并经DNA序列阐发无误。将S2epi基因克隆到pET28分子朋友10hap10质粒的序列的hap10基因卑劣,构建成pET28hap10S2epi交融基因重组质粒,经ERI与HindIII酶切电泳后可见一巨细为40

7、0bp摆布的片断图3。图2PR法搭建S2epi基因片断的电泳图略Fig2nstrutinfS2epigenebyPR:DNAarker;1:PRprdut.图3pEThap10S2epi重组质粒酶切断定略Fig3nstrutinfpET28ahap10S2epirebinantvetr:DNAarker;1:pET28ahap10S2epirebinantvetrdigestedbyERIandHindIII;2:pET28aplasiddigestedbyERIandHindIII.2.3重组hap10S2epi卵白的表达与纯化将转化pET28hap10S2epi重组质粒的大肠杆菌BL21(

8、DE3)经IPTG诱导3h后超声裂解,经SDSPAGE断定,重组卵白为可溶性表达图4中1和2泳道。裂菌所得上清经镍亲和层析及G25除盐纯化后得到表不雅相对分子质量(r)约为30000的卵白图4,与理论盘算推测的重组卵白r符合。图4hap10S2epi卵白的表达纯化略Fig4Expressinandpurifiatinfhap10S2epifusinprtein1:BL21(DE3)induedfr3h;2:BL21(DE3)uninduedLane;3:hap10S2epidesaltedbySephadexG25;4:hap10S2epipreparatinprirtdesalting;5:

9、BreakthrughfratinfrNiSepharseFFlun;6:FratinselutedfrNiSepharseFFlun;:Lleulareightarker.2.4重组hap10S2epi卵白的esternblt断定用抗Histag的Ab对SDSPAGE电泳阐发的重组hap10S2epi卵白举行esternblt断定,结果表现:pET28hap10S2epi重组质粒转化的表达菌出现了阳性条带,而pET28空质粒转化菌无反响条带图5。图5hap10S2epi基因交融表达产物的esternblt断定略Fig5Identifiatinfhap10S2epibyesternblt1:B

10、L21(DE3)harbringpET28aplasid;2:BL21(DE3)harbringpET28hap10S2epiplasid.2.5hap10S2epi重组卵白的免疫原性断定用全长S2卵白作为检测抗原,接纳ELISA法检测hap10S2epi卵白免疫的家兔血清中抗SARS冠状病毒S2卵白抗体的程度,结果表现:家兔血清1100、1200、1400稀释组A492值大于阴性比较组A492值2倍图6,说明家兔血清中含有能识别SARS病毒S2卵白的抗体。图6hap10S2epi的卵白免疫原性断定略Fig6Identifiatintheiungeniityfhap10S2epi3讨论病毒中和

11、性B细胞抗原表位简直定对SARS的诊断、疫苗分子方案及免疫干预治疗至关紧张。SARS是由冠状病毒引起的一种急性感抱病,在SARS治疗历程中,利用病愈病人血清获得了必然的疗效,必定了中和性抗体在SARS治疗及防范中的作用,但利用病愈病人血清结果并不不变,而且存在埋伏的宁静性题目。本研究按照B细胞表位特性,先猜测抗原表位,通过人工合成的要领构建出SARS冠状病毒刺突卵白S2亚基DNA,在大肠杆菌中表达后利用金属鏊合层析纯化得到朋友10S2表位交融卵白hap10S2epi,制止了从SARS患者构造或体液提取DNA的不宁静性,是一种经济、省时、省力的要领。应用种种相干软件对卵白质的布局和特性举行猜测,

12、特殊是表位猜测,在医学、生物范畴里都得到了证明5。在对SARS病毒S2卵白氨基酸序列阐发的历程中,我们创造病毒S2卵白N端5122个氨基酸序列片断表现多种要领猜测的同等性,该地区具有较好的亲水性和可及性,在二级布局上那么含有不规矩卷曲和转角布局,这些特点与卵白质抗原决定簇的布局特点符合6。在随后的ELISA实行中,由交融卵白制备的抗血清与酵母表达的S2完备卵白相结合,证明了我们所猜测的B细胞表位的正确性。更进一步的实行可以利用SARS活病毒举行病毒中和实行,确定此地区中是否含有中和性的B细胞表位。分子朋友10hap10为一r10000的卵白,属于热休克卵白家属中的成员,是HSP60的共朋友分子

13、,一同到场卵白的折叠。分子朋友被界说为能结合和不变另一卵白质不不变构象异构体的一组卵白质,并通过结合和开释,在体内可利于其他卵白质的准确组装、折叠、跨膜转运及错误折叠卵白质的落解7。真核细胞卵白在原核细胞中表达时每每形成不成溶的包容体。以包容体情势存在的卵白由于没有有准确的三级布局,以是不具有相应的生物学活性。从包容体中提取活性卵白要颠末繁琐的包容体制备、溶解、纯化、重折叠等历程,这不单增长了卵白质纯化历程的难度而且每每活性卵白得率很低8。在本研究中,S2表位卵白与分子朋友10形成的交融卵白在大肠杆菌中以可溶的情势表达,利用交融卵白端所带有的六聚组氨酸纯化标签可以一步亲和层析纯化得到较高纯度的

14、S2卵白举行后续的卵白质成效研究,制止了庞大的包容体纯化历程。而且由于hap10S2epi卵白N端的分子朋友10的存在,进步了卵白的表达程度,使得交融卵白表达程度占菌体总卵白的40%摆布。综上所述,我们通过对SARS病毒S2卵白氨基酸序列的阐发,猜测了S2卵白中B细胞表位地点肽段,然后接纳人工合成基因的方法用PR法构建出该肽段的DNA片断,再将该肽段与朋友10分子在大肠杆菌中举行交融表达,并用纯化后的交融卵白免疫动物制备多克隆抗体,末了应用ELISA法确定产生的抗体可与酵母表达的完备S2卵白结合,证明了所猜测B表位的准确性。本研究结果为进一步研究SARS病毒S2卵白的成效及研制抗SARS病毒基

15、因工程疫苗打下了基矗参考文献:1TanYJ,LiSG,HngJ.haraterizatinfviralprteinsendedbytheSARSrnavirusgeneJ.AntiviralResearh,2022,65(2):69-78.2梅林,李京,闫婕,等.SARS冠状病毒编码卵白质及其基因阐发的研究希望J.细胞与分子免疫学杂志,2022,20(1):126-128.3LiP,GldanN.PhylgenisandbiinfratisfSARSVJ.TRENDSirbi,2022,12(3):106-111.4秦宇,李梅,刘中华,等.抗sarsV重组纤突卵白单克隆抗体的制备和断定J.细胞与分子免疫学杂志,2022,21(5):611-612.5杨清武,朱佩芳,王正国,等.人TLR4的B细胞上风表位方案、合成及其免疫原性检测J.中华微生物学和免疫学杂志,2002,22(4):362.6KauayaPT,radSF,DiGergerA,etal.Glysylatindepedentpeptideantigeni