第六章DNA重组与克隆(陕西师范大学)

1、第六章DNA重组与克隆(陕西师范大学)DNA分子内或分子间发生遗传信息的重新组合称遗传重组或或基因重排。重组产物称为重组体。基因重组主要发生在减数分裂时同源染色体之间的交换。（形式多样）重组与进化关系密切，增加群体的遗传多样性，利于突变的优化组合。DNA重组接合作用 (conjugation)转化作用 (transformation)转导作用 (transduction)#转 座 (transposition)#同源重组 (homologous recombination)#位点特异的重组(site-specific recombination)异常重组发生在同源序列间的重组称为同源重组(ho

2、mologous recombination)，又称基本重组。是最基本的DNA重组方式，通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。 以E.coli的同源重组为例，了解同源重组机制的Holliday模型。6.1、同源重组Holliday模型中，同源重组主要4个关键步骤 两个同源染色体DNA排列整齐一个DNA的一条链断裂、并与另一个DNA对应的链连接，形成Holliday中间体通过分支移动产生异源双链DNA（立体异构）Holliday中间体切开并修复，形成两个双链重组体DNA，分别为：片段重组体(patch recombinant)拼接重组体(splice reco

3、mbinant) 片段重组体 ： 切开的链与原来断裂的是同一条链，重组体含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲本DNA。拼接重组体： 切开的链并非原来断裂的链，重组体异源双链区的两侧来自不同亲本DNA。 5555333355553333 内切酶 (recBCD)DNA侵扰(recA)分支迁移 (recA) 内切酶(recBCD) DNA 连接酶535353535353535353535353535333535335535353Holiday中间体53535353目 录片段重组体 （见模型图左边产物）： 切开的链与原来断裂的是同一条链，重组体含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲本DNA。拼接重组体

4、（见模型图右边产物）： 切开的链并非原来断裂的链，重组体异源双链区的两侧来自不同亲本DNA。 5353535353535353Holiday中间体535353535355533355553333555533335555333355553333内切酶(ruvC)内切酶(ruvC) DNA连接酶 DNA连接酶片段重组体拼接重组体目 录分支移动的过程伴随着DNA 的修复同源重组是减数分裂的原因。同源重组是由于碱基间的精确配对实现的异源双链与基因交换同源重组时会产生异源双链，从而发生基因交换。减数分裂后分离：（对异源双链区内不配对碱基的修复而进行的基因校正过程称作基因转换）基因转换频率在非对称异源双链

5、区较高。基因转换也可以在有丝分裂时姐妹染色体的等位基因间、有丝分裂与减数分裂时同一条染色单体上非等位重复基因之间发生Holliday 模型提出了同源重组的基本模式，但对于基因重组具体细节，异源双链的形成细节不清楚。在Holliday基础上提出了单链断裂模型和双链断裂模型，两个模型的区别在于解释重组期间DNA的修复的具体过程不一样。有供体受体之分。（受体：发生链断裂的分子P138-139）细菌的基因转移与重组低等生物也可以以转化、转导、结合等多种方式实现细胞间的基因转移。具体方式：接合、转化、转导、细胞融合。外源基因的命运：降解、暂时保留、与内源基因置换、整合。一、接合作用（conjugatio

6、n)当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互接触时，质粒DNA从一个细胞（细菌）转移至另一细胞（细菌）的DNA转移称为接合作用。F 因子编码表面排斥蛋白、切口酶、解螺旋酶、DNA转移通道蛋白等、F 因子可以与细菌染色体发生交叉连接而重组整合入细菌染色体二、转化作用（transformation)通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型。感受态细胞高浓度钙可以诱导感受态例：溶菌时，裂解的DNA片段被另一细菌摄取。三、转导作用（transduction)当病毒从被感染的细胞（供体）释放出来，再次感染另一细胞（受体）时，发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组。溶

7、 菌感 染重 组感 染细 菌噬菌体图 15-3 转导作用转导：通过病毒介导发生在供体细胞与受体细胞 之间的DNA转移及基因重组转导：当病毒从被感染的供体细胞释放出来，再次感染另一受体细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组即为转导作用转导(transduction)*转染(transfection)转染是转化的一种特殊形式。 由transformation（转化）和 infection（感染）两词构成。原指将噬菌体、病毒或以其为载体构建的重组子导入受体细胞的过程。通过感染方式将外来DNA引入宿主细胞，并导致宿主细胞遗传性状改变的过程称为转染。将任何类型DNA转移至动物细胞内的

8、过程均可叫转染。细菌的细胞融合由于细胞质膜融合导致的基因转移和重组。（原生质体融合）细菌的同源重组的酶学机制1、RecBCD（外切核酸酶）和 Chi 位点具有解旋酶（再旋）活性、ATPase活性、核酸外切酶活性、 序列特异性的单链内切酶活性单链内切酶活性和解旋酶活性使DNA产生具有游离末端的单链 RecA的作用位点RecBCD有固定切割位点原核生物的重组酶学机制已经比较清楚Chi 位点出现几率很高，是RecBCD的靶位点GCTGGTGG3 RecBCD的识别和切割位点a、 RecBCD结合在DNA的平 头末端（产生机制不清楚）b、 外切、解链、移动 （ATP）c、 兔耳状 loop 结构产生再

9、旋酶活性低于解旋酶活性）d、 RecBCD 在 loop 单链区的 chi 位点3方46NT处切 断单链（单链内切酶） chi位点：GCTGGTGG 目前发现的重组热点 E.coli 含 1000 个、Euk.e、 RecBCD 切割产生3单链末端 2、RecA 蛋白 （1） 活性a、 RecA 有单、双链 DNA 结合活性 b、 RecA 有 NTPase 活性（底物差异活性） 与单链 DNA 结合时活性最大-依赖于 DNAc、 RecA 有启动一个分子的单链侵入到另一双螺旋分子 的能力，即联会同源 DNA （但其靶 DNA 必须有缺口结合DNA）RecA入侵单链被置换连RecA引发链侵入模

10、型RecA引起的链交换和Holliday结构的生成 （2）RecA 蛋白催化双链和单链 DNA 的反应阶段a、 联会前阶段（缓慢） RecA 与单链结合b、 单链与双螺旋的互补链迅速配对，形成双链连接分子 Holliday（5侵入）c、 从双螺旋结构中缓慢置换一条链产生一段长的异源双链 DNA 反应结束时，RecA 结合到双链上 其中单链同化有固定的方向 入侵单链进入的方向是53， 双链 DNA 的互补链是35 RecBCD 和 RecA 的共同作用RecBCD产生游离单链-RECA 因子接到重组反应 3、原核同源重组的其它蛋白 需要 E.coli 中三个基因 ruvA,ruvB 和 ruvC

11、 的产物 a、 RuvA 识别 Holliday 结构的连接点b、 RuvB 为分枝迁移提供动力（ATPase 1020bp/s） c、 RuvC 核酸内切酶-专一性识别 Holliday 结构的连接点 体外切段连接点以拆分重组体 E.coli 重组的各阶段 （损伤修复）损伤DNA复制产生缺口RecA链交换第二次链交换DNApol通过DNA合成填满缺口RuvA,B分枝迁移RuvC切割Holliday连接点真核生物同源重组机制自学7.2、位点专一性重组（ site-specific recombination）1、概念：发生在专一序列而顺序极少相同的DNA分子间 的重组（包括一些基因表达调节、发

12、育过程中DNA重排）噬菌体基因组整合到细菌染色体基因组中属此种重组2、特征： 在特定的结合序列部位，有专一的酶催化断裂重接 -产生精确的DNA重排 都具有整合作用的两个基本特征a、 典型的保守性重组-交换是相互的和保存原先的DNAb、 发生在噬菌体和细菌DNA短同源序列的专一性核苷酸上二、phage的整合与切除（溶原和裂解状态）1、实现机制：均是通过-细菌DNA和DNA上特定位点之间的重组2、特定位点-附着位点（attachment site att） E.coli attB 含BOB三序列 23bp phage attP 含 POP三序列 240bp 核心序列 “O”完全一致 （同源部分）

13、-位点特异性重组发生的地方 B,B,P,P-臂3、整合过程 整合后的附着位点为 attL（BOP） attR（POB） 整合位点-attB、attP 切除位点-attL、attR 整合过程需要整合酶 （integrase Int）（编码） 和寄主的整合宿主因子IHF （integration host factor） 共同作用溶源性细菌(lysogen)溶菌周期（lysis）原噬菌体4、整合分子机制 核心序列O全长15bp，富含A-T 发生在O内的重组交换位点相距 7bp 整合酶的结合位点：attP 240bp、attB 23bp(两者的作用不同) attP位点的负超螺旋为重组所必须-加强了I

14、nt和IHF的亲和力 -高剂量的蛋白维持单链重组所必需的结构 Int结合 -核心序列的反向位点（切割位置） -结合在att臂上（臂与核心区靠近）intIHFXis 整合体及其作用 整合体（intasome）- Int和IHF结合到attP时的复合物 整合体捕获attB 说明- a、attB和attP的最初识别靠Int 识别两序列的能力 b、两序列的同源性在链交换时为 重要因素 Int蛋白能切断DNA，并使它重新连接，近而使holliday结构拆分 重组时attP和attB部位交叉断裂，互补单链末端进行交叉杂交例（二）细菌的特异位点重组沙门氏菌H片段倒位决定鞭毛相转变 hix为反向重复序列，它们

15、之间的H片段可在Hin控制下进行特异位点重组(倒位)。H片段上有两个启动子P，其一驱动hin基因表达，另一正向时驱动H2和rH1基因表达，反向(倒位)时H2和rH1不表达。rH1为H1的阻遏蛋白基因。 H2鞭毛素 阻遏蛋白Hin重组酶转位片段hinH2IH1 H1鞭毛素hinH2IDNA启动序列H1启动序列沙门氏菌H片段倒位决定鞭毛相转变P1977.3、转座成分概述1、转座子(元)或转座元件(transposon or transposable element): 基因组上不必借助于同源序列就可以移动的DNA片段，它们可以直 接从基因组的一个位点移到另一个位点（供体和受体）转座（transpo

16、sition）：转座元的转移过程（不十分确切）2、发现和发展 1914 A. Emerson 1936 Marcus . M. Rhoabes 玉米果皮、糊粉层花斑突变 玉米籽粒糊粉层色素不稳定遗传机理 跳跃基因（jumping gene） 1947 冷泉港实验室（美） Barbara McClintocka) 不依赖供体序列与靶位点间序列的同源性b) 转座不是简单的转移，涉及转座子的复制Hotspots (热点)Regional preference ( 在3kb区域内的随机插入) d) 某些转座因子（Tn3）对同类转座因子的插入具有排他性 （免疫性）e) 靶序列在转座因子两侧会形成正向重复

17、 f) 转座因子的切除与转座将产生复杂的遗传学效应3、转座重组的特点c) 转座插入的靶位点并非完全随机（插入专一型）二、Prok.转座子种类 两种类型： 简单转座子（simple transposon） （插入序列 insertion sequence IS ） 复合转座子（composite transposon） 共同特征： a）两端有2040bp的IR(反向重复序列) b）具有编码转座酶（transposase）的基因1、插入序列（最简单的转座子称作插入序列） 最简单，是细菌染色体、质粒和某些噬菌体的正常组分 命名： IS编号（鉴定类型） 长度 7002000bp 特点： a）两端IR为

18、转座酶的识别位点（突变） b）插入靶位点后会出现靶位点的正向重复（39bp） IS 可以正反方向插入到DNA（宿主、质粒或某些噬菌体）， 常对插入位点后面的基因表达功能产生极性效应a) Tn / TnA family l 具有IR、转座酶基因、 调节基因（解离酶）、抗抗生素基因 l Tn1 (AmpR) Tn2 (AmpR) Tn3 (AmpR) Tn4 (AmpR StrR) Tn5 (KanR) Tn6 (kanR) Tn7 (StrR TmpR) Tn9 (CamR) Tn10 (TetR) 2.5 kb 20 kb Tn3 IR TnpA Res TnpR AmpR IR 38bp 3

19、8bp 转座酶 regulator - 内酰胺酶 2、复合转座子 两种类型 b）两端重复序列为IS的复合转座子 e.g. IS插入到功能基因两端，可能形成复合转座因子IS ISIS IS L IS R臂 中心区 臂transposition 当两个IS组件相同时，其中任一个都可行使转座功能 不同时，主要依靠一个 两侧的IS既可以是IR，又可以是DR状态（IR多）3 转座噬菌体 Mu phage （巨型转座子 ） C repressor for A, BB 33 kd 与转座有关A 70 kd 转座酶U, S 毒性蛋白attL, attR 与寄主同源，反向重复，转座必需 Gin G区倒位酶 at

20、t L C A B S U att R 150bp 1.5kb G 倒位区 38kbPgin 以E.coli为寄主的温和型噬菌体（溶源、裂解） Mu的插入途径a） 侵入的Mu在溶源化过程中任意插入寄主DNA （两侧各5bp的靶位点序列重复）b） 进入裂解生长后，复制产生后代Mu DNA几乎全部插入寄主 DNA中，并可继续转座（形成寄主DNA和Mu的共合体），噬 菌体成熟时，切段共合体包装三、转座子的转作机制及模式 三种类型：复制型、非复制型和保守型1、复制型转座模式 实质：转座子元件被复制并被移动到受体位点，最终转座过程 扩增了转座子的拷贝（供、受点） 需两种酶： 转作酶（作用于原拷贝两末端）

21、 解离酶（作用于复制后的拷贝） 模式： 两大步 a) 共合体形成 切口连接复制 b) 拆分 靶位点的DR形成2、非复制型转座模式 供体上最终产生双链断裂 供体位点如不能被修复则有致 死效应五、转座子的某些遗传学效应P157转座可以导致基因变异插入操纵子位置可以影响操纵子下游基因表达应用：难以筛选的基因转移基因定位标记筛选插入突变构建特殊菌株克隆难以进行表型鉴定的基因7.3.6 真核生物的转座成分P152自学 真核生物的转座成分根据转座机制目前分为两类： a) 转座机制与细菌的转座子类似需要转座酶、两端的IR,转座靶点序列随机， 遗传信息： DNADNA转座酶、转座因子两端的IR序列， 玉米的A

22、c-Ds元件、果蝇的P元件和FB元件等 b) 转作机制类似逆转录病毒 真核生物特有的转座机制（逆转录转座） 遗传信息： DNARNADNA 逆转录子转录成RNA,然后反转录成DNA,插入基因组，类似于逆转录病毒的作用 如：逆转录病毒、果蝇的copia元件、酵母的Ty元件逆转录酶和整合酶，P208逆转录酶生物学意义：影响其他基因表达，介导基因重排，促进基因的流动第 二 节 重组DNA技术DNA Recombination Technique 重组DNA技术的发展史年 的豌豆杂交试验1944年 的肺炎球菌转化实验1973年 美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组DNA分子1977年 美国南旧金山由博

23、耶和斯旺森建立世界上第一家遗传工程公司，专门应用重组DNA技术制造医学上重要的药物。1980年 开始建造第一家应用重组DNA技术生产胰岛素的工厂1997年 英国罗林研究所成功的克隆了多莉一、相关概念DNA克隆工具酶目的基因基因载体二、基本原理及操作步骤 本节主要内容一、重组DNA技术相关概念 克隆(clone)来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)，即无性繁殖。（一） DNA克隆DNA克隆应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子复制子(replicon)，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因

24、的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子，也称基因克隆或重组DNA (recombinant DNA) 。生物技术工程: 基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程等。目的 分离获得某一目的基因或DNA 获得目的基因的表达产物（蛋白质）基因工程(genetic engineering) 实现基因克隆所用的方法及相关的工作，又称重组DNA技术。（二）工具酶 限制性核酸内切酶 DNA聚合酶 逆转录酶 T4DNA连接酶 碱性磷酸酶 末端转移酶 Taq DNA聚合酶重组DNA技术中常用的工具酶工 具 酶功 能限制性核酸内切酶识别特异序列，切割DNADNA连接酶催化DNA中相邻的5磷酸基和3羟基末

25、端之间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接DNA聚合酶合成双链cDNA分子或片段连接缺口平移制作高比活探针DNA序列分析填补3末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53聚合、35外切活性，而无53外切活性。常用于cDNA第二链合成，双链DNA 3末端标记等反转录酶合成cDNA替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5羟基末端磷酸化，或标记探针末端转移酶在3羟基末端进行同质多聚物加尾碱性磷酸酶切除末端磷酸基限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)识别DNA的特异序列, 并在识别

26、位点或其周围切割双链DNA的一类核酸内切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G+Bam H作用：与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA， 保护自身DNA。分类：、类（基因工程技术中常用的是类）第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。命名：Hin d 属 系 株 序Haemophilus influenzae d株流感嗜血杆菌d株的第三种酶类酶识别序列特点： 回文结构(palindrome)切口：平端切口、粘端切口GGATCCCCTAGGBam HGTCCAGGCCTAGGAT

27、CC G+GGATCCCCTAGGHindGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍未端(compatible end)。Bam HBg l GGATCC CCTAGG AGATCT TCTAGAGCCTAG GATCC G+ATCTAG GATCT A（三）目的基因 cDNA (complementary DNA)基因组DNA (genomic DNA)（四）基因载体定义为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。常用载体质粒DNA噬菌

28、体DNA病毒DNA克隆载体(cloning vector)为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。表达载体(expression vector) 为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。载体的选择标准能自主复制；具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定；有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；分子量小，以容纳较大的外源DNA。1. 质粒 (plasmid)特点: 能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息, 会赋予宿主细胞一些遗传性状。 细菌染色体外的小型环状双链DNA分子。噬菌体DNA改造系统 gt

29、系列（插入型，适用cDNA克隆）EMBL系列（置换型，适用基因组克隆）2. 噬菌体(phage) M13噬菌体DNA改造系统（含lacZ基因）M13mp系列pUC系列 Multiple Cloning Sites3. 柯斯质粒(cosmid)pJB8的物理图谱酵母人工染色体 (yeast artificial chromosome, YAC)动物病毒DNA改造的载体腺病毒载体逆转录病毒载体杆状病毒载体其他二、重组DNA技术基本原理目的基因的获取重组DNA导入受体菌外源基因与载体的连接克隆载体的选择和构建重组体的筛选克隆基因的表达 以 质 粒 为 载 体 的DNA 克 隆 过 程（一）目的基因的

30、获取1. 化学合成法已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列 。2.基因组DNA文库(genomic DNA library)3. cDNA文库(cDNA library)4. 聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR) 1.化学合成法由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列组织或细胞染色体DNA基因片段克隆载体重组DNA分子含重组分子的转化菌限制性内切酶受体菌存在于转化细菌内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合2. 基因组DNA文库限制酶切位点限制酶消化 除去中间片段cos LR coscos L左臂R cos右臂真核生物染色体DNA限制酶部分消化 外源

31、DNA与载体DNA混合 连接反应 体外包装 用重组噬菌体感染大肠杆菌 20 Kb DNA 片段 cos LR cos20 Kb 外源 DNA 片段 基因文库mRNA cDNA 双链cDNA 重组DNA分子 cDNA文库 反转录酶 载体 受体菌 复制3.cDNA文库 逆转录酶A A A A T T T T AAAASI核酸酶 DNA聚合酶碱水解 T T T T是一种在体外利用酶促反应大量获得特异序列的基因组DNA或cDNA的专门技术，又称为无细胞的分子克隆。4. 聚合酶链反应（PCR）模板DNA引物4种dNTPTaq DNA聚合酶含Mg2+的缓冲液。PCR的反应体系（1）变性，加热至95 ，使模

32、板DNA解开成单链；（2）退火，温度降至适宜，使引物与模板互补结合；（3）延伸，温度升至72 ，DNA聚合酶以4种dNTP为底物，在引物的3-OH上，合成与模板互补的DNA新链。PCR的基本反应步骤及原理PCR反应条件变性95C延伸72C退火Tm-5CPCR反应的基本原理（三）外源基因与载体的连接1. 粘性末端连接方式：(1)同一限制酶切位点连接(2)不同限制酶切位点连接（二）克隆载体的选择和构建Bam H切割反应 GGATCC CCTAGGT4 DNA连接酶15CGATCC GGCCTAG+目的基因用 Bam H切割载体DNA用Bam H切割重组体载体自连目的基因自连同一限制酶切位点连接不同

33、限制酶切位点的连接Eco R切割位点Bg l切割位点+EcoR+ Bg l双酶切Eco R+ Bg l双酶切T4 DNA连接酶15C重组体配伍末端的连接情况和同一限制酶切位点连接相似。2. 平端连接适用于：限制性内切酶切割产生的平端粘端补齐或切平形成的平端目的基因载体限制性内切酶限制性内切酶T4 DNA连接酶15C重组体载体自连目的基因 自连3. 同聚物加尾连接在末端转移酶(terminal transferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。5335载体DNA5335目的基因限制酶或机械剪切限制酶 53 35 5 3 T(T)nT T(T)nT

34、35 5 3355 3 A(A)nA A(A)nA 35-核酸外切酶-核酸外切酶末端转移酶+ dATP末端转移酶+ dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nA T(T)nTT4 DNA连接酶15C重组体4. 人工接头(linker)连接由平端加上带有新的酶切位点的接头，再用限制性酶切产生粘性末端，而进行粘端连接。Eco REco REco R人工接头及其应用CCGAATTCG GGCTTAAGC5-3-Eco R受体菌条件安全宿主菌 限制酶和重组酶缺陷处于感受态(competent) 导入方式转化 (transformation)转染 (transfection)感染 (infection)

35、（四）重组DNA导入受体菌（五）重组体的筛选1. 直接选择法(1) 抗药性标记选择(2) 标志补救(marker rescue)(3) 分子杂交法原位杂交Southern印迹 2. 免疫学方法如免疫化学方法及酶免检测分析等(插入失活法)抗药性标记选择组氨酸缺陷型大肠杆菌无组氨酸的培养基酵母咪唑甘油磷酸脱水酶基因促进组氨酸合成DNA重组体标志补救 互补的检测原位杂交Southern印迹鸡的肌球蛋白的克隆和检出重组DNA技术操作过程可形象归纳为 小 结分分离目的基因 切限制酶切目的基因与载体接拼接重组体 转转入受体菌 筛筛选重组体 重组DNA技术操作的主要步骤载体质粒噬菌体病毒目的基因（外源基因）基因组DNA cDNA人工合成PC