基因工程的基本操作程序3)

1、 根据已知蛋白质根据已知蛋白质的氨基酸序列，推测的氨基酸序列，推测出相应的出相应的mRNAmRNA序列，序列，然后按照碱基互补配然后按照碱基互补配对原则，推测出它的对原则，推测出它的结构基因的核苷酸序结构基因的核苷酸序列，再通过化学方法，列，再通过化学方法，以单核苷酸为原料合以单核苷酸为原料合成目的基因成目的基因。蛋白质的氨基酸序列蛋白质的氨基酸序列mRNAmRNA的核苷酸序列的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列推测推测推测推测目的基因目的基因化学合成化学合成（三）化学方法人工合成目的基（三）化学方法人工合成目的基因因从基因文库中获取从基因文库中获取利用利用PCRPCR技术扩增

2、技术扩增利用化学方法人工合成利用化学方法人工合成归纳：获取目的基因的方法归纳：获取目的基因的方法 用一定的用一定的_切割切割 质粒，使其出现一个切质粒，使其出现一个切 口，露出口，露出_。 用用_切断目切断目 的基因，使其产生的基因，使其产生_ _ _。 将切下的目的基因片段插入质粒的将切下的目的基因片段插入质粒的_处，处， 再加入适量再加入适量_，形成了一个重组，形成了一个重组 DNADNA分子（重组质粒）分子（重组质粒）限制酶限制酶黏性末端黏性末端同一种限制酶同一种限制酶相同的黏性末端相同的黏性末端切口切口DNADNA连接酶连接酶1.1.过程过程: :二、二、构建表达载体构建表达载体 核心

3、核心2.2.基因表达载体的目的基因表达载体的目的（1 1）使目的基因在受体细胞中稳定存在）使目的基因在受体细胞中稳定存在并可以遗传给下一代；并可以遗传给下一代；（2 2）使目的基因能够表达和发挥作用。）使目的基因能够表达和发挥作用。 科学家在培育抗虫棉时，经历了多次失败，科学家在培育抗虫棉时，经历了多次失败，才获得成功。才获得成功。 起初把苏云金芽孢杆菌的起初把苏云金芽孢杆菌的抗虫基因抗虫基因插入载插入载体质粒中，然后导入棉花的受精卵中，结果抗体质粒中，然后导入棉花的受精卵中，结果抗虫基因在棉花体内没有表达。虫基因在棉花体内没有表达。 然后在插入抗虫基因的质粒中插入然后在插入抗虫基因的质粒中插

4、入启动子启动子( (抗虫基因首端抗虫基因首端) )，导入棉花受精卵，长成的棉，导入棉花受精卵，长成的棉花植株还是没有抗虫能力。科学家又在有启动花植株还是没有抗虫能力。科学家又在有启动子、抗虫基因的质粒中插入子、抗虫基因的质粒中插入终止子终止子( (抗虫基因末抗虫基因末端端) )，导入棉花受精卵，结果成长的植株，有了，导入棉花受精卵，结果成长的植株，有了抗虫能力。抗虫能力。 作为基因工程表达载体，只需作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？么？ 不可以。不可以。 3.3.基因表达载体的组成：基因表达载体的组成：a a、目的基因、目的基因b

5、 b、启动子、启动子c c、终止子、终止子d d、标记基因、标记基因思考思考1： 表达载体为什么一定要有启动子？表达载体为什么一定要有启动子？ （1 1）生物之间进行基因交流，只有）生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能使用受体生物自身基因的启动子才能有利于基因的表达；有利于基因的表达； （2 2）通过）通过cDNAcDNA文库获得的目的基因文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体没有启动子，只将编码序列导入受体细胞无法转录。细胞无法转录。思考思考2：终止子的作用是什么？终止子的作用是什么？ 终止子是位于基因尾端的一段特终止子是位于基因尾端的一段特殊的殊的DNA片

6、断，能终止片断，能终止mRNA的转录。的转录。 是为了鉴别受体细胞中是否含有目是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来。出来。思考思考3：标记基因有什么作用？标记基因有什么作用？思考思考4 4：为了增强目的基因的表达水平，为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调控元件，如增往往还要增加一些其他调控元件，如增强子等；强子等；二者都有标记基因和复制原点两部分二者都有标记基因和复制原点两部分DNADNA片段。表片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构终止子三部分

7、结构三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞借鉴借鉴细菌或病毒侵染细胞细菌或病毒侵染细胞的途径。的途径。（一）转化：（一）转化： 目的基因进入目的基因进入_内，并且在内，并且在 受体细胞内维持受体细胞内维持_和和_的过程的过程受体细胞受体细胞稳定稳定表达表达（二）（二）方法方法将目的基因导入将目的基因导入植物细胞植物细胞将目的基因导入将目的基因导入动物细胞动物细胞将目的基因导入将目的基因导入微生物细胞微生物细胞农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法显微注射法显微注射法感受态细胞感受态细胞1.1.将目的基因导入植物细胞将目的基因导入植物细胞 农杆菌转化法农杆

8、菌转化法 基因枪法基因枪法 花粉管通道法花粉管通道法1.1.将目的基因导入植物细胞将目的基因导入植物细胞（1 1）农杆菌转化法）农杆菌转化法特点：特点： 易感染双子叶植物和裸易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力物没有感染能力原理：原理： TiTi质粒上的质粒上的T-DNAT-DNA可以转移到受体细胞，可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的并整合到受体细胞染色体的DNADNA上。上。转化过程转化过程: :TiTi质粒质粒目的基因目的基因构建构建表表达达载载体体导入导入植植物物细细胞胞插入插入植物细胞植物细胞染色染色DNADNA表达表达新新性性状

9、状转入转入农农杆杆菌菌 基因枪法又称微基因枪法又称微弹轰击法，是弹轰击法，是利用压利用压缩气体产生的动力缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表将包裹在金属颗粒表面的表达载体面的表达载体DNADNA打打入受体细胞中入受体细胞中，使目，使目的基因与其整合并表的基因与其整合并表达的方法。达的方法。（2 2）基因枪法）基因枪法（3 3）花粉通道法）花粉通道法 植物花粉在柱头植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，前，剪去柱头，然后，

10、滴加滴加DNADNA（含目的基（含目的基因），使目的基因借因），使目的基因借助花粉管通道进入受助花粉管通道进入受体细胞。体细胞。胚珠花药花丝柱头花柱子房壁子房雄蕊雌蕊2.2.将目的基因导入动物细胞将目的基因导入动物细胞（1 1）方法：显微注射法）方法：显微注射法（将基因表达载体（将基因表达载体提纯，用显微仪注射到受精卵中）提纯，用显微仪注射到受精卵中）（2 2）操作程序）操作程序: :提纯含目的基因表达载体提纯含目的基因表达载体取受精卵取受精卵显微注射显微注射移植到子宫移植到子宫受精卵发育受精卵发育新性状动物新性状动物常用法：常用法：CaCa2+2+处理处理常用菌：大肠杆菌常用菌：大肠杆菌微生

11、物作受体细胞原因：微生物作受体细胞原因：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少过程：过程：CaCa2+2+处理大处理大肠杆菌肠杆菌感受态感受态细胞细胞表达载体表达载体与感受态与感受态细胞混合细胞混合感受态感受态细胞吸细胞吸收收DNADNA3.3.将目的基因导入微生物细胞将目的基因导入微生物细胞思考：为什么要用思考：为什么要用Ca2+处理受体细胞？处理受体细胞？用用CaCa2 2处理，增加细菌细胞壁的通透性处理，增加细菌细胞壁的通透性受体生物受体生物 植物植物 动物动物 微生物微生物受体细胞受体细胞导入方法导入方法受精卵受精卵体细胞体细胞受精卵受精卵细胞细胞/ /个体个体农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法显微注显微注射技术射技术用用CaCa2+2+处理成处理成感受态细胞感受态细胞采用基因工程的方法培育抗虫棉，下列导入目的基因的作法正确采用基因工程的方法培育抗虫棉，下列导入目的基因的作法正确的是（）的是（）A.A.将毒素蛋白注射到受精卵中将毒素蛋白注射到受精卵中B.B.将编码毒素蛋白的将编码毒素蛋白的DNADNA序