生物药物分析与检测：第七章 杂志与安全检查

1、标题 第七章 杂志与安全检查第一节 药物的杂质和杂质限量检查 一、杂质的种类和来源 杂质（impurities）是指： 1. 有毒副作用的物质 2. 本身无毒副作用，但影响药物的稳定性和疗效的物质（一）杂质的种类 药物中的杂质按来源分为 1. 一般杂质：指在自然界中分布广泛，在多种药物生产和贮藏过程中容易引入的杂质。如酸、碱、水份、重金属等。一般杂质其检查方法收载在中国药典的附录中。 2. 特殊杂质：指某一个或某一类药物的生产或贮藏过程中引入的杂质。如阿司匹林中的游离水杨酸、异烟肼中的游离肼、甾体激素中的其他甾体。特殊杂质检查方法收载在中国药典正文各药品的质量标准中。（二）药物中杂质的来源1.

2、 生产过程中引入（1）原料、反应中间体及副产物 （2）试剂、溶剂、催化剂类 （3）生产中所用金属器皿、装置以及其他 不耐酸、碱的金属工具所带来的杂质2. 贮藏过程中产生 水解、氧化、分解、异构化、晶形转变、聚合、潮解和发霉等 易发生水解反应的结构： 酯、内酯、酰胺、卤代烃、苷类等易发生氧化反应的结构： 醚、醛、酚羟基、巯基、亚硝基、双键等（三）药物的纯度与化学试剂的纯度 药物的纯度考虑杂质的生理作用，药品只有两个等级：合格或不合格。 化学试剂有很多等级，如基准试剂、优级纯（GR）、分析纯（AR）、化学纯（CP）、色谱纯、光谱纯。二、杂质的限量检查(一)杂质限量检查方法 杂质限量指药物中允许杂质

3、存在的最大量。通常用百分之几或百万分之几（ppm）来表示。 1. 对照法 取限度量的杂质对照品配制成对照液，与一定量的供试品配制成的供试品溶液，在相同的条件下处理，比较反映结果，以判断供试品中所含有的杂质是否符合限量规定。 特点：不需知道杂质的准确含量3. 比较法 测定杂质的绝对含量，如测定吸收度、pH值等，与规定限量值比较。 特点：准确测定杂质的量，不需对照品 2. 灵敏度法 系指在供试品溶液中加入试剂，在一定反应条件下，不得有正反应出现。 特点：不需对照品 （二）杂质限量的计算供试品量允许杂质存在的最大量杂质限量=供试品量标准溶液浓度标准溶液体积杂质限量=例1，检查某药物中的的砷盐，取标准

4、砷溶液2ml（每1ml相当于1g的As）制备标准砷斑，砷盐限量为0.0001，应取供试品的量为 A. 0.20g B. 2.0g C0.020g D. 1.0g E. 0.10g已知：c1 g/ml1106 g/mlV2ml L0.0001%一、氯化物检查法（一）原理：对照法 第二节 一般杂质检查（二）检查方法 除另有规定外，取各药品项下规定量的供试品，加水溶解使成25ml（溶液如显碱性，可滴加硝酸使成中性），再加稀硝酸10m1；溶液如不澄清，应滤过；置50ml纳氏比色管中，加水使成约40m1，摇匀，即得供试溶液。另取各药品项下规定量的标准氯化钠溶液，置50ml纳氏比色管中，加稀硝酸10m1，

5、加水使成40m1，摇匀，即得对照浴液。于供试溶液与对照溶液中，分别加入硝酸银试液1.0m1，用水稀释使成50m1，摇匀，在暗处放置5分钟，同置黑色背景上，从比色管上方向下观察，比较，即得。（三）测定条件 1. 标准NaCl溶液 10gCl/ml，50ml溶液中含5080g的Cl所显浑浊梯度明显，相当于标准NaCl溶液58ml。 2. 反应需在硝酸酸性条件下进行，且以50ml供试溶液中含稀硝酸10ml为宜。（1）加速AgCl浑浊的形成； （2）产生较好的乳浊； （3）避免弱酸银盐如碳酸银、磷酸银以及氧化银沉淀的形成。 3. 试剂：硝酸银 5. 避光、暗处放置5分钟后比浊，因氯化银见光易分解。 4

6、. 供试液和对照液稀释后，再加硝酸银溶液，使生成白色浑浊而不是白色沉淀。 6. 比浊方法：同置于黑色背景上，自上向下观察。 7. 平行操作，操作温度一般控制在3040。例2. 中国药典 （2005年版） 规定，检查氯化物杂质时，一般取用标准氯化钠溶液（10gCl/mL）58mL的原因是（ ）A. 使检查反应完全B. 药物中含氯化物的量均在此范围C. 加速反应D. 所产生的浊度梯度明显E. 避免干扰 二、硫酸盐检查法（一）原理:对照法（二）测定条件 1. 标准K2SO4溶液0.1mg/mL，50mL溶液中含0.10.5mg的所显浑浊梯度明显，相当于标准K2SO4溶液15mL。 2. 反应需在盐酸

7、酸性条件下进行，且以50mL供试溶液中含稀盐酸2mL为宜。 3. 试剂：氯化钡 4. 供试液和对照液稀释后，再加氯化钡溶液，使生成白色浑浊而不是白色沉淀 5. 比浊方法：同置于黑色背景上，自上向下观察。 例3：药物中硫酸盐检查时，所用的标准对照液是（ ） A. 标准氯化钡 B. 标准醋酸铅溶液 C. 标准硝酸银溶液 D. 标准硫酸钾溶液 E. 以上都不对 三、铁盐检查法1. 原理：对照法（一）硫氰酸盐法ChP（2005）、USP（28）2. 检查方法 除另有规定外，取各药品项下规定量的供试品，加水溶解使成25ml，移置50ml纳氏比色管中，加稀盐酸4ml与过硫酸铵50mg，用水稀释使成 35m

8、1后，加30%硫氰酸铵溶液3ml，再加水适量稀释成50ml，摇匀；如显色，立即与标准铁溶液一定量制成的对照溶液（取各药品项下规定量的标准铁溶液，置50ml纳氏比色管中，加水使成25ml，加稀盐酸4ml与过硫酸铵50mg，用水稀释使成35m1后，加30%硫氰酸铵溶液3ml，再加水适量稀释成50ml，摇匀）比较，即得。3. 测定条件 （1）用FeNH4(SO4)212H2O（硫酸铁铵）配制标准铁贮备液（加入硫酸防止Fe3+的水解），标准铁溶液临用前稀释而成，标准铁溶液10g Fe3+/ml，50ml溶液中含1050g的Fe3+显色梯度明显，一般取标准铁溶液1.05.0ml。（2）反应需在盐酸酸性条

9、件下进行，且以50ml供试溶液中含稀盐酸4ml为宜。 （3）试剂：硫氰酸铵。加过量硫氰酸铵，使反应向正反应方向进行。（4）检查Fe2+和Fe3+ （5）铁盐检查时，加氧化剂氧化Fe2+为Fe3+。加过硫酸铵可氧化Fe2+为Fe3+，同时可防止光线使硫氰酸铁还原或分解褪色。硝酸后加热也可氧化Fe2+为Fe3+。（6）比色方法：同置于白色背景上，自上向下观察。4. 干扰及排除（1）为了提高灵敏度或供试管与对照管色调不一致时，可用正丁醇提取后，分取正丁醇层比色。 （2）具环状结构的有机药物，需经700800炽灼破坏处理后再依法检查。 （二）巯基醋酸法 （BP：对照法）本法灵敏度较高，但试剂较贵 例4

10、. 中国药典（2005年版）规定，硫氰酸铵法检查铁盐时，加入过硫酸氨的目的是（ ） A. 使药物中铁盐都转变为Fe3+ B. 防止光线使硫氰酸铁还原或分解褪色 C. 使产生的红色产物颜色更深 D防止干扰 E便于观察、比较 四、重金属检查法（以铅为代表）中国药典（2005年版）共收载四法。 2. 测定条件（1）用硝酸铅配制标准铅贮备液（加硝酸防止Pb2+水解），标准铅溶液临用前稀释而成，标准硝酸铅溶液10g Pb2+/ml，适宜比色范围为35ml溶液中含1020g的Pb2+。（2）本法用2ml pH3.5的醋酸盐缓冲液控制溶液pH值为33.5。（3）显色剂：从ChP（1990）开始改用硫代乙酰胺

11、做显色剂。 （一）第一法硫代乙酰胺法1. 原理：对照法 适用于溶于水、稀酸和乙醇的药物。 （1）供试品如有色，需经处理后方可检查。 A. 外消色法：在对照管中加稀焦糖溶液或其他无干扰的有色溶液。 B. 内消色法 C. 改用第四法，微孔滤膜过滤法3. 干扰及排除 （2）若供试品中有微量Fe3+存在，会氧化硫化氢生成单质硫，干扰比色，加入抗坏血酸或盐酸羟胺（0.51.0g）还原Fe3+为Fe2+，可消除干扰。（3）若供试品为铁盐，Fe3+在盐酸中生成HFeCl62-，用乙醚提取除去，剩余微量铁在氨碱性溶液中，加KCN掩蔽，然后用第三法检查。（4）若药物本身能生成不溶性硫化物时，可加入掩蔽剂消除干扰

12、。如ZnSO4中重金属的检查，要在碱性下加KCN掩蔽Zn2+后，依第三法检查。 （二）第二法炽灼残渣法 适用于含芳环、杂环以及不溶于水、稀酸、乙醇及碱的有机药物。 500600炽灼后的残渣，经处理后，依一法检查。 1. 原理 对照法2. 操作方法 含钠及氟的有机药物应用铂坩埚、石英坩埚或硬质玻璃蒸发皿（因可腐蚀瓷坩埚，带入大量重金属）。 （三）第三法硫化钠法 适用于溶于碱而不溶于稀酸或在稀酸中生成沉淀的药物。如磺胺类、巴比妥类。 1. 原理：对照法 2. 测定条件 （1）NaOH碱性条件下（2）显色剂：硫化钠 （四）第四法微孔滤膜法 适用于含25g重金属杂质及有色供试液的检查。 依一法检查，结

13、果微孔滤膜过滤后比较色斑。 例5. 中国药典(2005年版)重金属检查法中，所使用的显色剂是（ ） A. 硫化氢试液 B. 硫代乙酰胺试液 C. 硫化钠试液 D. 氰化钾试液 E. 硫氰酸铵试液五、砷盐检查法 （一）古蔡法 ChP(2005)、BP(2004)1. 原理：对照法 AsH3遇HgBr2试纸生成黄色棕色的砷斑，与2ml标准砷溶液在相同条件下生成的砷斑比较。2. 操作方法（1）标准砷斑用2ml标准砷溶液制备（2）如供试品需经有机破坏，则标准砷溶液应平行操作3. 测定条件 （1）标准砷溶液临用新配，1gAs/ml。 （2）酸为反应物，酸量应足够，所以加浓盐酸5ml。 （3）酸性氯化亚锡

14、及碘化钾的作用是：A. 还原As5+为As3+，加快反应速度；B. 碘化钾被氧化生成的I2又可被氯化亚锡还原为I-，I-与反应中生成的Zn2+能形成稳定的配位离子，有利于生成砷化氢的反应不断进行；C. 氯化亚锡与锌作用，在锌表面形成锌锡齐，使氢气均匀而连续地发生。 （4）醋酸铅棉花的作用是消除锌粒及供试品中少量硫化物的干扰，醋酸铅棉花60mg装管高度6080mm。 （5）锌粒应无砷（6）砷斑不稳定，应立即观察4. 干扰及排除（1）供试品若为硫化物、亚硫酸盐、硫代硫酸盐时，加HNO3，使氧化成硫酸盐，以除去干扰，如硫代硫酸钠中砷盐的检查。 （2）供试品若为铁盐，需先加酸性氯化亚锡试液，将Fe3+

15、还原为Fe2+。如枸橼酸铁铵中砷盐的检查。（3）具环状结构的有机药物，要先行有机破坏后再进行检查。 常用的有机破坏方法： 碱破坏法：石灰法、无水碳酸钠碱融法； 酸破坏法：如葡萄糖中砷盐的检查。（4）本法适用于不含Sb或含Sb量小于100g的供试品。 （二）Ag-DDC法 ChP(2000)、USP（24）1. 原理：对照法 砷化氢与Ag-DDC（二乙基二硫代氨基甲酸银）溶液作用，还原Ag-DDC为红色胶态银，直接比色或于510nm波长处测定吸收度，进行比较。 用有机碱吸收反应产生的HDDC有利于反应的进行。USP（28）用吡啶，ChP（2005）用三乙胺。 本法适用于含Sb量小于500g的供试

16、品，可用于砷盐的限量检查和微量砷盐的含量测定。例6：古蔡氏法中，SnC12的作用有： A. 使As5+As3+ B. 除去H2SC. 除去I2 D. 组成锌锡齐E. 除去其它杂质 例7：Ag-DDC法检查砷盐的原理为：砷化氢与AgDDC吡啶作用，生成的物质是（ ） A. 斑砷B. 锑斑 C. 胶态砷 D. 三氧化二砷 E. 胶态银六、澄清度检查法 检查药物中的微量不溶性杂质，用作注射剂的原料药一般应作此项检查。 1. 检查方法：对照法 2. 浊度标准液的配制 中国药典规定用浊度标准液作为澄清度检查的标准。 反应原理：乌洛托品在偏酸性条件下水解产生甲醛，甲醛与肼缩合生成甲醛腙，不溶于水，形成白色

17、浑浊。 级 号 0.5 1 2 3 4 浊度标准原液（ml） 2.5 5.0 10.0 30.0 50.0水（ml） 97.5 95.0 90.0 70.0 50.0. 100硫酸肼溶液与10乌洛托品溶液等量混合配制浊度标准贮备液 浊度标准原液 浊度标准液（5个级号）3. 判断：药典中规定的“澄清”，系指供试品溶液的澄清度相同于所用溶剂，或未超过0.5号浊度标准液。4. 溶剂：水、酸、碱、有机溶剂有机酸的碱金属盐类药物强调用“新沸过的冷水”七、溶液颜色检查法 控制药物中有色杂质限量的方法。 ChP(2005)采用三种方法检查：目视比色法、分光光度法、色差计法。1. 目视比色法 即与标准比色液比

18、较的方法，全波长范围定性观察。观察方法： 标准比色液的配制 2. 分光光度法 单一波长定量3. 色差计法 本法是通过色差计直接测定供试溶液和标准比色液与水之间的色差值，对其颜色进行定量表述和分析的方法。 测色仪器一般为光电积分型色差计。 八、干燥失重法测定 干燥失重是指药物在规定条件下经干燥后所减失的重量，主要是水分，也包括其它挥发性物质。测定方法有：常温干燥失重法、干燥剂干燥法、减压干燥法等。 （一）常压恒温干燥法 适用于受热较稳定的药物。干燥温度一般为105。 干燥操作：一般在干燥温度2干燥24hr再称至恒重。第二次及以后各次称重均应在规定条件下继续干燥1h后进行。 炽灼残渣：第二次及以后

19、各次称重均应在规定条件下继续炽灼.5h后进行。 （二）干燥剂干燥法适用于受热易分解或挥发的供试品。干燥剂：硅胶、浓硫酸、P2O5 。（三）减压干燥法 适用于熔点低，受热不稳定或水分难赶除的药物。 除另有规定外，压力应在2.67kPa（20mmHg）以下。 例. 干燥失重测定的方法有（ ）A炽灼（500600）法B常压恒温干澡法C减压干燥法D干燥剂干燥法E减压干燥剂干燥法九、易炭化物检查法 检查药物中遇H2SO4易炭化或易被氧化呈色的微量有机杂质。 方法：H2SO4炭化后与对照液比较。 对照液：（1）“溶液颜色检查”项下的标准比色液；（2）由比色用氯化钴液，比色用重铬酸钾液，比色用硫酸铜液按规定

20、方法配成的对照液；（3）高锰酸钾液 检查不含金属的有机药物或挥发性无机药物中混入的无机杂质(金属氧化物或无机盐类)。1. 原理 样品炭化后+ H2SO4湿润700800炽灼至恒重炽灼残渣（硫酸灰分） 限量一般为0.1%0.2% 十、炽灼残渣检查法 3. 注意事项 （1）供试品的取样量应根据炽灼残渣限量和称量误差决定。 （3）若残渣需留作重金属检查，则500600炽灼至恒重。 （2）含氟的药物对瓷坩埚有腐蚀，应采用铂坩埚。（4）加硫酸处理是使杂质转化为稳定的硫酸盐，并帮助有机物炭化例. 炽灼残渣检查法一般加热恒重的温度为（ ） A. 500600 B. 600700 C. 700800 D. 8

21、001000 E. 10001200例. 炽灼残渣的限量一般为（ ）A. 1B. 0.51C. 0.40.5D. 0.20.3E. 0.10.2第三节 特殊杂质的检查方法 一、利用药物和杂质在物理性质上的差异（一）臭味及挥发性质的差异 例如：黄凡士林中异性有机物检查：本品2.0g,直火加热无辛味。浓过氧化氢中不挥发性杂质检查：10ml水浴蒸干残渣15mg （二）颜色差异 例如：磺胺嘧啶中有色偶氮苯化合物的检查：取本品2.0g，加NaOH试液10ml，加水25ml，与黄色3号比色液比，不得更深。 （三）溶解行为的差异 例如：吡哌酸中碱中不溶物吡哌酸甲酯（I）和（II）检查 （四）旋光性质的差异

22、例如：硫酸阿托品中莨菪碱的检查：本品溶液(50mg/ml)-0.4 （五）对光吸收性质的差异 1. 紫外分光光度法： 例如: 地蒽酚中二羟基蒽醌的检查 再如：苯丙醇中苯丙酮的检查：可利用供试液的吸收度比来控制杂质;纯品苯丙醇A247nm/A258nm= 0.59; 99.5% 时A247nm/A258nm= 0.79;因此规定供试品A247nm/A258nm 0.79; 即所含苯丙酮 0.5%.2. 原子吸收分光光度法： 是通过测定药物中所含待测元素原子蒸气，吸收发自光源的该元素特定波长的程度，以求出药物中待测元素的 含量。 3.红外分光光度法： 主要用于药物中无效或低效晶型检查，如甲苯咪唑中

23、A晶型检查。4.荧光分析法 例如：利血平中氧化产物检查利血平(无荧光)3,4-二去氢利血平(I)(黄绿色荧光)3,4,5,6-四去氢利血平(II)(蓝色荧光) (六)吸附或分配性的差异 1.薄层色谱法(TLC) (1)杂质对照品法 例如:盐酸左旋咪唑中检查2,3-二氢-6-苯基咪唑2,1-b噻唑盐 硅胶G 苯:甲醇:冰HAC 样品 对照品。（2）主成分自身对照法2.纸层析法(PC) 常用于极性大的药物的分离、分析，如地高辛中的有关杂质的检查。3.高效液相色谱法(HPLC)（1）峰面积归一化法：L% = Ai /(Ai + A主）100%（2）不加校正因子主成分对照法 对照品液为供试品的稀释液，

24、进样测得A主；供试品液进样测得Ai。其Ai A主即为合格。（3）内标法加校正因子测定供试品中杂质的含量 对照品+内标 进样求校正因子（f)=(As/Cs)/(AR/CR) 供试品+内标 进样求AX.AS,则杂质浓度CX = f AX/(AS/CS)4.气相色谱法(GC) 主要用于药物中挥发性的杂质检查，其检查方法与HPLC法相同。二、利用药物和杂质在化学性上的差异（一）酸碱性的差异 1.规定消耗滴定液体积 例如己酸羟孕酮中正己酐、对甲苯磺酸检查：(NaOH 0.02mol/L) 取本品0.20g + 中性乙醇 + 溴麝香草酚蓝，微蓝色0.50ml 2.pH法 例如乙琥胺中2-甲基-2-乙基丁二

25、酸检查：0.01g/ml pH3.04.5. 3.指示剂法 例如苯巴比妥中苯基丙二酰脲检查：其水溶液不得使甲基橙显红色。（二）氧化还原性的差异 例如：盐酸吗啡中阿朴吗啡的检查：后者可被碘氧化生成水溶性绿色化 合物。因此ChP规定：本品50mg +4mlH2O+1dI2 + 5ml乙醚，乙醚层不得显红色；水层不得显绿色。（三）杂质与一定试剂反应产生沉淀 例一、间苯二酚中邻苯二酚检查：后者+Pb(Ac)2 白色 ChP规定：本品0.5g+10mlH2O+2d稀醋酸+0.5ml Pb(Ac)2 ，不得发生混浊，即为合格。（四）杂质与一定试剂反应产生颜色 例一、盐酸普萘洛尔中游离-萘酚检查：利用后者可

26、与重氮盐发生重氮化-偶合反应，生成偶氮染料。 ChP规定：供试品20mg+乙醇与10%NaOH液各2ml+重氮苯 磺酸试液1ml,放置3min；如显色，与0.3ml -萘酚对照液（20g/ml)比较不得更深。（五）杂质与一定试剂反应产生气体 ChP附录中收载氰化物的两种检查方法：第一法：改进普鲁士蓝法 原理：CN- + 酒石酸 HCN Fe(CN)64- Fe4Fe(CN)6第二法：气体扩散-三硝基苯酚锂法 原理：HCN扩散进入三硝基苯酚锂试液，生成异红紫酸盐，在 500nm波长处测定吸收度。Fe2+Fe3+ 第四节 热源检查法细菌内毒素检查细菌内毒素检查法是判断供试品中细菌内毒素是否符合规定

27、。 内毒素(Endotoxin)即革兰氏阴性菌细胞壁的脂多糖，其毒性成分为类脂A。菌体死亡崩解后释放出来。细菌内毒素检查包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法。供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。无菌检查 毒性试验法 急性毒性一、 基本概念二、 实验设计一、基本概念定义及试验意义 药物一次或24小时内一次剂量分两次给予试验动物，观察动物2-10天产生的毒性反应和死亡情况。 短时间内， 快速而剧烈的毒性反应 试验意义了解新药急性毒性的强弱 通过多种动物之间毒性反应的对比，为预测对人的毒性反应提供参考。为长期毒性试验及特殊毒性试验选择剂量提供依据。 结合测定药物在胃肠的吸收情况。 提示急性中毒死亡机制和其它药理活性信息。其它，新药在研制过程中，特别是早期阶段多由实验室小量合成提供。一、基本概念LD50定义50动物死亡统计学剂量相关参数:剂量反应（死亡）曲线的斜率致死所需要的时间毒效应症状一、基本概念 表1-1 某些化学物的半数致死量（LD50）化学物物 种LD50（mg/kg)乙醇小 鼠10,000 氯化钠小 鼠 4,000硫酸亚铁大 鼠 1,500硫酸吗啡大 鼠 900苯巴