分子生物学实验：4质粒DNA的双酶切

1、质粒DNA的双酶切1课件作者:蒋华云实验目的通过本实验掌握质粒DNA双酶切的原理和操作方法。2课件作者:蒋华云实验步骤质粒DNA双酶切的实验操作1琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果UVP凝胶成像系统记录结果（电泳图） 37度酶切1.5h原理讲解3课件作者:蒋华云实验仪器、材料与试剂制冰机水浴锅（37 ）琼脂糖凝胶电泳系统（电泳槽、电泳仪和制胶装置）紫外线透射仪（凝胶成像系统）10L移液枪和枪头20L移液枪和枪头浮板小离心管R-pGEX-4T-1质粒DNA4课件作者:蒋华云实验仪器、材料与试剂Xho酶（TaKaRa公司）EcoR酶（TaKaRa公司）10H Buffer（TaKaRa公司）无菌水DNA

2、marker 2000（TaKaRa公司）琼脂糖1TAE10mg/mL溴化乙锭溶液（EB）（0.5g/mL终浓度，20mL胶加1L）10Loading Buffer:1%SDS/50%Glycerol(甘油)/0.05%Bromophenol Blue(溴酚蓝)5课件作者:蒋华云EcoR1LXho1L10H Buffer2L质粒DNA10L12L1g无菌水6L4L总体积20L（无菌水补至总体积）质粒DNA双酶切的实验操作酶切反应条件：温度37，酶切1小时30分钟。 酶切反应体系取0.5mL无菌小离心管按上表在管中加入酶切反应体系酶切6课件作者:蒋华云实验原理分子生物学中常用的工具酶限制性内切酶

3、连接酶聚合酶 激酶、磷酸酶 核酸酶 回忆DNA结构7课件作者:蒋华云限制性内切酶（I型）限制性内切酶：能识别专一的核苷酸顺序，并在识别点附近的一些核苷酸上切割DNA分子中的双链，但是切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的。 (II型)限制性内切酶：能识别专一的核苷酸顺序，并在该顺序内的固定位置上切割双链。这类限制性内切酶的识别和切割的核苷酸都是专一的，因此，这种限制性内切酶是DNA重组技术中最常用的工具酶之一。（III型）限制性内切酶：也有专一的识别顺序，但不是对称的回文顺序,在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几个核苷酸对不是特异性的。因此，这种限制性内切酶切割后产生的一定长度

4、DNA片段，具有各种单链末端。因此不能应用于基因克隆。8课件作者:蒋华云(II型)限制性内切酶这种酶识别的专一核苷酸顺序最常见的是4个或6个核苷酸，少数也有识别5个核苷酸以及7个、8个、9个、10个和11个核苷酸的。 II 型限制性内切酶的识别顺序是一个回文对称顺序，即有一个中心对称轴，从这个轴朝二个方向“读”都完全相同。这种酶的切割可以有两种方式 ：9课件作者:蒋华云EcoR I 5端突出粘性末端Pst l 3端突出粘性末端EcoR 平头末端不同的末端10课件作者:蒋华云EcoR I识别序列和酶切EcoR I识别序列（回文顺序）酶切位点片段 1片段 211课件作者:蒋华云Xho识别序列和酶切

5、酶切位点片段 1Xho识别序列（回文顺序）片段 212课件作者:蒋华云连接酶DNA连接酶T4DNA连接酶大肠杆菌DNA连接酶RNA连接酶13课件作者:蒋华云DNA聚合酶依赖于DNA的DNA聚合酶大肠杆菌DNA聚合酶Klenow酶T4DNA聚合酶天然T7DNA聚合酶经修饰的T7DNA聚合酶（测序酶）TaqDNA聚合酶不依赖模板的DNA聚合酶（末端转移酶）依赖于RNA的DNA聚合酶（反转录酶）14课件作者:蒋华云RNA聚合酶依赖于DNA的RNA聚合酶不依赖于DNA的RNA聚合酶15课件作者:蒋华云结束！16课件作者:蒋华云DNA双螺旋结构17课件作者:蒋华云碱基互补配对、磷酸二酯键OCH2OPOOOBaseCH2OPOOOBaseOHSugarSugarO返回18课件作者:蒋华云实验四、质粒DNA的双酶切(板书)实验目的通过本实验掌握质粒DNA双酶切的原理和操作方法实验原理分子生物学中常用的工具酶。双酶切原理。实验步骤酶切反应体系和酶切1.5小时:取0.5mL离心管，按表加入试剂，反应1.5小时