医学分子生物学-上课用-12.基因诊断

1、2022-6-271第十二章 基因诊断Chapter12 Gene Diagnosis 2022-6-272F第一节 基因诊断基础F第二节 遗传病的基因诊断F第三节 传染病的基因诊断F第四节 肿瘤的基因诊断F第五节 基因诊断在法医学上的应用 本章内容提要2022-6-273l基因诊断之父简悦威 1976年加州大学华裔科学家 Kan YW用核酸分子杂交技术首次对一例地中海贫血进行诊断。Yuet Wai Kan 1936 第一节第一节 基因诊断的技术和方法基因诊断的技术和方法2022-6-274一、基因诊断的概念、特点及临床意义一、基因诊断的概念、特点及临床意义 基因诊断： 就是用分子生物学技术，

2、通过检测基因及基因表达产物的存在状态，对人体疾病作出诊断的方法。基因诊断检测的目标分子是DNA、RNA或者蛋白质。 2022-6-275诊断依据(遗传物质改变)：1. DNA、RNA或蛋白质水平变化，如病毒基因及其转录产物在体内从无到有、癌基因表达水平从低到高；2. 基因结构变化，如点突变引起基因失活、染色体转位引起基因异常激活或灭活。2022-6-276基因诊断的特点： 高特异性 高灵敏性 早期诊断性 应用广泛性2022-6-277二、基因诊断中常用的分子生物学技术二、基因诊断中常用的分子生物学技术l核酸分子杂交（Nucleic acid hybridization） l聚合酶链式反应(PC

3、R) l单链构象多态性（SSCP） l限制性片段长度多态性（RFLP） lDNA序列测定（DNA sequencing） l生物芯片（biochips） lWestern免疫印迹（Western blot） l免疫组织化学诊断 2022-6-278（一）核酸分子杂交 指两条单链核酸在一定条件（温度、盐离子和有机溶剂浓度）下，按碱基互补的原则重新配对形成双链的过程。2022-6-279核酸分子杂交流程 待测核酸制备滤膜上核酸固化杂交去除未杂交的探针检测杂交信号核酸探针制备探针标记加入标记探针2022-6-2710 提取DNA限制性内切酶消化DNA以产生特定长度的片段凝胶电泳分离 变性处理DNA转

4、印到膜上并使其牢固结合将标记的探针与膜上DNA片段杂交，分析杂交信号。1. Southern 印迹杂交2022-6-2711 RNA经变性琼脂糖凝胶电泳后，转移到固相支持物上，通过分子杂交检测特定的mRNA分子的含量与大小。2. Northern印迹杂交2022-6-27123. 斑点杂交（dot blotting） 将RNA或DNA变性后直接点样于硝酸纤维素膜或尼龙膜上，用于基因组中特定基因及其表达产物的定性及定量的研究。2022-6-27134. 反向斑点杂交 先将探针固定于硝酸纤维素膜或尼龙膜上，将样品RNA或DNA标记变性后进行杂交。改变了传统杂交方法中一次杂交只能检测一种样品的局限，

5、大大提高了基因诊断的效率。2022-6-2714 寡核苷酸中的碱基错配会大大影响杂交分子的稳定性，可用人工合成的针对正常和突变ASO探针进行反向斑点杂交，检测点突变，大大提高检测结果的可靠性。等位基因特异性寡核苷酸 (allele specific oligonucleotide, ASO）2022-6-2715ASO1ASO2NHMGAGCACATGTN：正常基因；：正常基因；H：杂合子基因；：杂合子基因；M：突变基因：突变基因2022-6-27165. 原位分子杂交l荧光原位杂交 (fluorescence in situ hybridization, FISH）2022-6-2717荧光

6、原位杂交（FISH）2022-6-2718（二） 聚合酶链式反应 (polymerase chain reaction, PCR）模板引物dNTP Mg2+ Taq DNA聚合酶变性延伸退火2022-6-2719基因诊断中常用的PCR衍生技术:lRT-PCRl荧光定量PCRl多重-PCRlPCR-ASOlAS-PCRlPCR-SSCPlPCR-RFLP2022-6-27201. RT-PCR2022-6-27212. 荧光定量PCR荧光标记引物荧光标记引物2022-6-2722 3. 多重PCR 多重多重PCR示意图示意图 A：普通：普通PCR；B：多重：多重PCR2022-6-27234.

7、PCR-ASOASO1ASO2NHMGAGCACATGTN：正常基因；：正常基因；H：杂合子基因；：杂合子基因；M：突变基因：突变基因2022-6-27245. AS-PCR（allele specific PCR） 等位基因特异PCR：根据引物3端的互补与否，设计一对与正常或突变模板配对的特异引物.2022-6-2725（三）单链构象多态性分析(single-strand conformation polymorphism， SSCP) DNA 的突变造成DNA片段中碱基序列不同，变性为单链后在中性聚丙烯酰胺凝胶中的构象不同（单链构象多态性），利用迁移率的差别可使各种序列不同的单链分离开来。

8、2022-6-2726PCR-SSCP分析原理2022-6-2727正常人纯合突变杂合突变+ PCR-SSCP分析 2022-6-2728 （四）限制性片段长度多态性分析（restriction fragment length polymorphism, RFLP） 由于DNA 变异产生新的酶切位点或原有的酶切位点消失，在用限制性核酸内切酶消化时产生不同长度或不同数量的片段。 可借助核酸分子杂交或PCR进行检测。2022-6-2729ABCDEFGGAATTCCTTAAGF EcoR 限制性内切酶位点的变化EBGC +DADEFBGCA2022-6-2730GAATTCCTTAAG基因组DNA

9、的E.coR酶切电泳图谱2022-6-2731lPCR-RFLP 设计适当的扩增引物，使扩增片段包括某一个或数个限制性内切酶识别序列，在PCR扩增后用该限制酶切割PCR产物，根据电泳后酶切片段长度变化，即可作出诊断。2022-6-2732（五） DNA序列测定（DNA sequencing）2022-6-2733DNA序列测定原理(双脱氧末端终止法)2022-6-2734左侧：正常；右侧：突变 序列分析用于基因诊断2022-6-2735（六）生物芯片（biochip）l基因芯片（gene chip）l蛋白质芯片（protein chip）基因芯片杂交流程示意图2022-6-2736基因诊断中常

10、用的分子生物学方法比较基因诊断中常用的分子生物学方法比较方法基本原理核酸分子杂交错配时杂交信号减弱或消失PCR变异引起扩增产物不同SSCP突变引起核酸二级结构改变RFLP基因变异改变酶切图谱DNA测序序列比对寻找差异生物芯片多元杂交寻找信号差异2022-6-2737三、基因诊断技术路线与方法三、基因诊断技术路线与方法l直接诊断：直接分析致病基因分子结构及表达是否异常l间接诊断：利用多态性遗传标志与致病基因进行连锁分析2022-6-2738（一）直接诊断途径必要条件：l被检测基因变化与疾病发生有直接因果关系;l被检基因正常分子结构已被确定;l被检基因致病的分子机制（突变位点或表达变化）已知.20

11、22-6-27395/5/3/3/RFLP1. 点突变的检测 （1）有限制性内切酶位点改变40 -珠蛋白生成障碍性贫血症基因密码子17突变的检测 M：pBR322 DNA/Msp I; 1:未酶解片段； 2：A/ A； 3： A/ T； 4： T/ T注：由于54bp、114 bp、72 bp片段及分子量标准中低于200 bp的片段太小，在0.8的琼脂糖凝胶中不易被观察到PCR-RFLP分析 -珠蛋白生成障碍性贫血症 2022-6-2741斑点杂交、反向斑点杂交AS-PCR、PCR-SSCP、 PCR-ASO、PCR产物直接测序5 5 3 3 （2）无限制性内切酶位点改变2022-6-2742

12、 在DNA序列上有一段较长序列的重新排布。包括数十个碱基到数千个碱基的丢失、插入、替换、重复和倒位等，以及染色体突变或畸变，包括染色体的易位、缺失或染色三体（如唐氏综合征）等. 2. 基因重排的检测 核酸分子杂交与PCR. 43-基因不同程度缺失引起不同类型的-地贫12正常基本正常+轻度贫血 + +轻度贫血0高度贫血 + 0Hb Barts综合征 0 02022-6-2744BamHIBamHI212 10 kb14 kbprobe -珠蛋白生成障碍性贫血的直接基因诊断-珠蛋白基因不同程度的缺失可引起不同类型的 -珠蛋白生成障碍性贫血2022-6-2745 -珠蛋白生成障碍性贫血的直接基因诊断

13、aa/aaaa/a-aa/- -a -/a -a -/- - -/- -14kb10kb正常正常缺缺1缺缺2缺缺2缺缺3缺缺42022-6-27463. 基因表达异常的检测p mRNA的定量或长度分析：RT-PCR、Northern印迹杂交、定量RT-PCR等。p 蛋白质变化：Western Blot .2022-6-2747（二）间接诊断途径1. 采用原因：(1) 致病基因未知或基因结构不确定(2) 致病突变机理不清(3) 致病位点不便检测间接诊断：检测与致病基因连锁的遗传标记。2022-6-2748 2. 遗传标记 DNA多态性：指群体中的DNA分子存在至少两种不同的类型，即个体间同一染色

14、体的相同位置上核苷酸序列存在一定的差异或变异。 多在进化中形成，本身并不致病，只是与某些遗传性致病基因有一定连锁关系。 2022-6-2749三代遗传标记： RFLP VNTR; STR SNP2022-6-27507.6 kb13 kb患者正常(1) RFLP标记的连锁分析镰状红细胞性贫血病(HBS)的间接基因诊断Hpa7.6 kb13 kbSouthern印迹杂交N H PN：正常；H：杂合子；P：患者（纯合子）；黄色区域为探针2022-6-2751l重复序列以各自核心序列（重复单元）首尾相连多次重复，称为串联重复序列，其重复次数在人群中存在变异，形成多态性。l串联重复序列散在分布于染色体

15、上。l重复单位为625 bp，称为小卫星DNA。重复单位为26 bp，如（TA）n, (CGG)n等，称为微卫星DNA。（2）串联重复序列长度多态性分析2022-6-2752串联重复序列长度多态性分析 串联重复序列两侧含有一些核酸限制性内切酶的酶切位点，切割后产生不同长度的DNA片段。 串联重复序列两侧序列是保守的，可设计特定引物进行PCR，PCR产物长度不同。2022-6-2753 第二节第二节 遗传病的基因诊断遗传病的基因诊断一、血红蛋白病（hemoglobinopathy） （一）镰状细胞贫血病 （二）-珠蛋白生成障碍性贫血症 二、血友病（Hemophilia） 甲型血友病 三、脆性X综

16、合征 2022-6-2754l正常（N）的ASO探针： 5-ACT CCT GAG GAG AAG TCT GC-3 l突变（M）的ASO探针： 5-ACT CCT GTG GAG AAG TCT GC-31. 镰状细胞贫血病的ASO杂交法检测 一、血红蛋白病（一）镰状细胞贫血病2022-6-2755斑点杂交结果，N：正常；M：突变N-ASOM-ASO正常 突变 突变纯合子 杂合子 纯合子2022-6-275653正常基因1.15 kb(CCT GAG G)53突变基因1.35 kb(CCT GTG G)Mst酶切位点（CCTNAGG）2. 镰状细胞贫血病的限制性内切酶谱分析2022-6-27

17、570.2 kb1.15 kb1.35 kb正常人携带者 患者 镰状细胞贫血病的限制性内切酶谱分析2022-6-27583. 镰状细胞贫血病的的PCR-RFLP分析 正常人的扩增产物经 Mst 消化可生成54 bp和56 bp两个片段（1），而镰状细胞贫血症患者的DNA片段不被酶切，仍为110 bp（2），杂合子可见三条带（3）2022-6-27591. PCR-RFLP分析 -珠蛋白生成障碍性贫血症基因密码子17突变的检测 M：pBR322 DNA/Msp I; 1:未酶解片段； 2：bA/ bA； 3：bA/ bT； 4：bT/ bT注：由于54bp、114 bp、72 bp片段及分子量标

18、准中低于200 bp的片段太小，在0.8的琼脂糖凝胶中不易被观察到（二） -珠蛋白生成障碍性贫血症2022-6-2760 -珠蛋白生成障碍性贫血症的反相斑点杂交分析2. 反相斑点杂交2022-6-2761二、血友病（Hemophilia）l甲型血友病是由于血浆凝血因子V（FV）缺陷造成。l甲型血友病的基因突变类型已有300余种，其中点突变占174种；另有部分患者是由于缺失或插入突变或内含子22的基因倒位所致。2022-6-27621. FV基因倒位的DNA印迹分析 将基因组DNA用Nco I，Dra I或Bcl I等内切酶（酶切位点位于交换点两侧）消化，用特异探针进行杂交分析，正常人表现为21

19、.5 kb、14 kb和16 kb三种类型。I型倒位患者表现为20、17.5和14 kb三种类型；型倒位患者表现为20、16和15.5 kb三种带型。在一些重型甲型血友病家系中还有其他异常带型出现。 2022-6-27632. FV基因突变的检测（1）依赖于FV基因内或旁侧的多态性标记的连锁分析（2）RFLP连锁分析（3）VNTR分析（4）短串联重复序列（STR）的连锁分析64三、脆性X综合征l脆性 X 智力低下基因1（FMR1）5非翻译区遗传不稳定的(CGG)n 重复序列的异常扩增以及相邻CpG 岛的异常甲基化。l正常人中约为 850 拷贝。l携带者增多到52200拷贝，相邻的CpG 岛未被

20、甲基化，称为前突变.l男性患者和脆性部位高表达的女性中，达到2001000拷贝，相邻的CpG岛也被甲基化，称为全突变.l全突变可关闭相邻FMR1基因的表达，FMR1 mRNA在几乎所有患者不表达或只有低表达，从而出现临床症状。2022-6-2765脆性X综合征常用基因诊断方法：1PCR-ASO 2DNA连锁分析 3Southern印迹杂交法4PCR扩增 2022-6-2766 一、病毒性疾病l甲型肝炎病毒（HAV） HAV系RNA病毒，利用RTPCR技术可从粪便中检测出甲型肝炎病毒的基因组RNA。 l乙型肝炎病毒（HBV） 设计保守区序列引物，扩增各型HBV DNA片段；设计位于可变区的引物扩

21、增某一亚型HBV DNA，以便分型。l丙型肝炎病毒（HCV） HCV为正链RNA病毒，先逆转录成cDNA，再进行巢式PCR检测HCV。 第三节第三节 传染病的基因诊断传染病的基因诊断2022-6-2767二、细菌引起的疾病l结核分枝杆菌 先设计一对特异性引物，用PCR技术扩增出一383 bp序列，再用探针杂交，灵敏度可达到100个细菌水平。l幽门螺杆菌（HP） 主要采用PCR技术：检测HP染色体DNA特异片段；检测HP尿素酶A基因；用PCR-RFLP鉴别HP菌株。2022-6-2768三、寄生虫及衣原体感染l疟原虫 l卡氏肺孢子虫l衣原体感染 诊断方法：核酸杂交和PCR技术 2022-6-27

22、69 第四节第四节 肿瘤的基因诊断肿瘤的基因诊断一、原癌基因与抑癌基因的检测 如原癌基因K-ras第12密码子点突变：GGT-TGT/GTT/GAT/GCT ；抑癌基因p53密码子130290之间的基因突变。二、常见肿瘤的基因诊断 BRCA基因突变与乳腺癌的易感性有关。 APC是结肠癌发生过程中第一个突变基因。 2022-6-2770一、原癌基因与抑癌基因的检测1原癌基因的检测： ras 基因家族由H-ras、K-ras和N-ras组成。最常见的突变是第12、13、59或第61位密码子的点突变。 胰腺癌、结肠癌、肺癌以K-ras突变为主，如第12位密码子突变，由编码甘氨酸的GGT突变为TGT、

23、GTT或GAT，少数突变为GCT。 急性淋巴细胞白血病，慢性淋巴细胞白血病等以N-ras突变为主； 泌尿系统肿瘤则以H-ras突变为主。2022-6-2771 2. ras原癌基因突变常用的检测方法： PCR 及PCR-SSCP分析：扩增ras 基因第12位密码子点突变部位，再用SSCP技术进行分析，或者直接测序确定患者ras原癌基因的点突变。 核酸杂交技术（如ASO）：检测ras基因第12位密码子点突变。2022-6-27723抑癌基因p53的检测：lp53基因以密码子第175位、第248位、第249位、第273位及 第282位点突变率最高。在结直肠癌、乳腺癌、小细胞肺癌，都可见异常的p53

24、基因蛋白。lp53的基因诊断方法有： （1）PCR-SSCP （2）DNA序列分析 （3）PCR-RFLP2022-6-2773（一）乳腺癌1乳腺癌常见基因变异l5%10%乳腺癌患者有家族遗传性。乳腺癌高危家族中常有抑癌基因的BRCA基因（breast cancer gene）的突变。lBRCA1突变易致乳腺癌。突变分布于整个编码序列，没有明显的突变簇或突变热点。70%的缺失或插入导致编码序列的框移和翻译提前终止。lBRCA1在N端的一半部位截短，与乳腺癌和卵巢癌的高风险相关；而在C端截短则主要与乳腺癌高危有关。lBRCA2基因在30%40%的散发性乳腺癌有杂合性缺失（LOH）。突变提高乳腺癌

25、易感性。二、常见肿瘤的基因诊断2022-6-2774 2乳腺癌基因诊断方法 （1）PCR法检测BRCA1基因突变 （2）荧光原位杂交（FISH）检测BRCA2基因扩增。2022-6-2775（二）结肠癌1. 结肠癌常见基因变异l在癌发展过程的不同阶段发生不同的基因突变。lAPC是结肠癌发生过程中第一个突变基因。K-ras原癌基因突变也是结肠癌形成的早期事件。lDCC基因失活是结肠癌发展的晚期事件。抑癌基因DPC4和MADR2也可能会因18q等位基因丢失而失活。lp53基因的突变是结肠癌发展过程的晚期现象。lDNA修复基因也与结肠癌有关。如hMSH2、hMLH1、hPMS1或hPMS2基因的突变

26、所致的DNA错配修复缺陷与遗传性非息肉性结肠癌的发生有关。2022-6-2776 2结肠癌基因诊断方法 （1）PCR-SSCP法：对腺瘤样息肉病人APC基因PCR-SSCP技术进行分析。 （2）异源双链PCR法：检测APC基因变异。 （3）蛋白质免疫印迹法：检测因基因突变而缩短了的APC蛋白。2022-6-2777 第五节第五节 基因诊断在法医学上的应用基因诊断在法医学上的应用2022-6-2778l重复序列以各自核心序列（重复单元）首尾相连多次重复，称为串联重复序列，其重复次数在人群中存在变异，形成多态性。l串联重复序列散在分布于染色体上。l重复单位为625 bp，称为小卫星DNA。重复单位为26 bp，如（TA）n, (CGG)n等，称为微卫星DNA。一、DNA指纹与多态性遗传标记2022-6-2779l可变数目串联重复序列(VNTR) 人类染色体上小卫星DNA的高度可变区（HVR）是由头尾相连的串联重复序列（tandem repeat，TR）组成，TR的核心序列同源性很高，等位HVR的长度由于TR的重复次数不同而有很大的差别，具高度多态性。2022-6-2780 DNA长度多态除可用Southern印迹杂交法检测外