生化第12章dna生物合成

1、复制翻译 蛋白质（病毒） RNA（病毒）逆转录转录RNA翻译蛋白质DNA复制中心法则（The central dogma）DNA的生物合成(复制)DNA Biosynthesis，Replication 第 12 章复制(replication)指遗传物质的传代，以亲代DNA为模板，dNTP (dATP dGTP dCTP dTTP)为原料，按碱基配对规律合成子代DNA的过程。复制亲代DNA子代DNA问题：1. 在复制过程中DNA双螺旋如何解旋将双链打开？ 2. 在复制过程中DNA的两条链是否同时作为模板复制子链？复制的基本规律Basic Rules of DNA Replication 第一

2、节一、半保留复制 (semi-conservative replication)子链继承母链遗传信息的几种可能方式 密度梯度实验 DNA半保留复制模型 按半保留复制方式，子代DNA与亲代DNA的碱基序列一致，即子代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的保守性。 半保留复制的意义遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，但不是绝对的。原核生物复制时，DNA从起始点(origin)向两个方向解链，形成两个延伸方向相反的复制叉(replication fork) 。 二、双向复制 (bidirectional replication)复制中的放射自显影图像A. 环状双链DNA及复制起始点B. 复制中的两

3、个复制叉C. 复制接近终止点(termination, ter)oriterA B C53oriorioriori535533553复制子(replicon)3三、复制的半不连续性 (semi-discontinuous replication) 353535解链方向领头链(leading strand)随从链(lagging strand)3535 半不连续性 复制过程中，领头链连续复制，而随从链不连续复制的现象。 冈崎片段(okazaki fragment) 不连续复制的片段 DNA复制的酶学和拓扑学变化The Enzymology and Topology of DNA Replicat

4、ion第二节 参与DNA复制的物质 模板(template) : 解开成单链的DNA母链底物(substrate): dNTP DNA聚合酶(polymerase): 简写为 DNA-polRNA引物(primer): 提供3-OH使dNTP聚合其他的酶和蛋白质因子一、复制的化学反应 目 录磷酸二酯键的生成N1OH35+dN2TPN1N2-OH35+PPiDNA pol聚合反应的特点：聚合 新链的延长只可沿53方向进行。 DNA新链生成需引物和模板；全称：依赖DNA的DNA聚合酶 (DNA-dependent DNA polymerase, DDDP)简称：DNA-pol活性：1. 53 聚合

5、活性 2. 核酸外切酶活性二、DNA聚合酶DNA-pol 的 53聚合作用35 5335DNA-pol15/625 3 OHP35外切5 3外切53内切酶(Endonuclease)（限制性内切酶）5335外切5 3外切(Exonuclease)外切酶与内切酶作用图解16/621. 原核生物的DNA聚合酶共同点：1. 53 的聚合活性 2. 35 外切酶活性DNA-polDNA-pol DNA-pol 功能：对复制中的错误进行校读，对复制和 修复中出现的空隙进行填补。DNA-pol （109kD）DNA-pol I 5 3外切酶活性的功能切除引物，切除突变片段5317/62DNA-pol I

6、35外切酶活性的功能校读（proofread）功能53AG17/62323个氨基酸小片段5 核酸外切酶活性大片段/Klenow 片段 604个氨基酸DNA聚合酶活性 5核酸外切酶活性N 端C 端枯草杆菌蛋白酶DNA-pol Klenow片段是实验室合成DNA，进行分子生物学研究中常用的工具酶。 DNA-pol （120kD） DNA-pol II基因发生突变，细菌依 然能存活。 它参与DNA损伤的应急状态修复。 功能: 是原核生物复制延长中真正起催化作用的酶。 DNA-pol (250kD)DNA-po l 同时合成领头链和随从链 段2. 真核生物的DNA聚合酶DNA-pol 起始引发，有引物

7、酶活性。延长子链的主要酶，有解螺旋酶活性。参与低保真度的复制。在复制过程中起校读、修复和填补缺口的作用。仅存在于线粒体DNA复制中。DNA-pol DNA-pol DNA-pol DNA-pol 三、复制的保真性 (fidelity) 1. 遵守严格的碱基配对规律 ATGC2. 聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能 DNA pol 靠其大分子结构协调非共价(氢键)与共价键(磷酸二酯键) 的有序形成。 嘌呤的化学结构能形成顺式和反式构型，与相应的嘧啶形成氢键配对时，嘌呤应处于反式构型。 DNA pol III 在催化磷酸二酯键形成之前完 成对碱基的选择；对反式嘌呤核苷酸的亲和 力较顺式的大。3.

8、DNA-pol的核酸外切酶活性和及时校读A：DNA-pol 的外切酶活性切除错配碱基；并用其聚合活性掺入正确配对的底物。B：碱基配对正确，DNA-pol不表现活性。解链酶类：解螺旋酶拓扑异构酶单链DNA结合蛋白四、复制中的解链和DNA分子拓扑学变化 引物酶1. 解螺旋酶 (helicase)作用：断裂互补碱基间的氢键，使DNA成单链。DnaA、B (rep蛋白、解螺旋酶)、C等解螺旋酶ATP2. 单链DNA结合蛋白(single stranded DNA-binding protein, SSB) 作用：防止单链DNA重新形成双链，防止 单链DNA被核酸酶水解。3. 引物酶 (primase)

9、 55催化RNA引物合成的酶叫引物酶，它是一种特殊的RNA聚合酶。DNA合成需在RNA引物的基础上进行。RNA引物53534. DNA拓扑异构酶 (topoisomerase, Topo) DNA正超螺旋与负超螺旋负超螺旋正超螺旋DNA双螺旋拓扑异构酶10 8 局部解链后解链过程中正超螺旋的形成解链过程中正超螺旋的形成 拓扑异构酶作用特点既能水解 、又能连接磷酸二酯键 拓扑异构酶 拓扑异构酶 分 类切割DNA双链，此时不需ATP；尔后由ATP供能，使DNA分子成负超螺旋再连接切口。不需ATP，切割双链DNA中的一链，使DNA松弛后, 连接切口。Topo:Topo: 临床上使用的某些抗肿瘤药（如

10、喜树碱，鬼臼乙叉甙等）是通过抑制Topo酶活性而杀死肿瘤细胞的。 作用机制 五、DNA连接酶 (DNA ligase) 作用方式 催化DNA双链的3羟基和相邻的5磷酸基团形成磷酸二酯键，从而把两段相邻的DNA链连成完整的链。DNA连接酶ATPATPHO5335DNA连接酶ATPAMP+PPi5353目 录 在复制中起最后接合缺口的作用； 在DNA修复、重组及剪接中起缝合缺口作用； 基因工程的重要工具酶之一。 功能 参与DNA复制的主要成员主要成员主要作用DnaADnaB (解螺旋酶)SSBDnaG (引物酶)TOPODNA-pol DNA-polDNA连接酶DnaC 识别复制起始位点 解开DN

11、A双链 运送和协同DnaB 合成RNA引物 维持已解开单链DNA的稳定 使打结、缠绕、正超螺旋的DNA松驰 DNA复制 水解引物、填补空隙、修复作用 催化双链DNA中单链缺口的连接DNA生物合成过程The Process of DNA Replication第三节复制的起始复制的延长复制的终止（一）复制的起始 (initiation )需要解决两个问题：1. DNA解开成单链，提供模板。2. 合成引物，提供3-OH末端。一、原核生物的DNA生物合成 由特定蛋白质识别复制起始位点(ori)，在解螺旋酶、TOPO酶及单链DNA结合蛋白的共同作用下，DNA解链，解旋，形成复制叉。倒Y1. DNA解链

12、E.coli复制起始点 oriC E.coli复制起始点oriC跨度为245bp，有3组串联重复序列和2对反向重复序列。E.coli复制起始点 oriC GATTNTTTATTT GATCTNTTNTATT GATCTCTTATTAG 1 13 17 29 32 44 TGTGGATTA-TTATACACA-TTTGGATAA-TTATCCACA58 66 166 174 201 209 237 245 串联重复序列 反向重复序列5353 Dna A Dna B、 Dna CSSB3535复制叉的形成5335引物酶DnaC引发体解螺旋酶含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA复制起始区域的复

13、合结构称为引发体。 2. 引发体的生成3535引物是由引物酶催化合成的短链RNA分子。引物3 HO5引物酶DNA拓扑异构酶3. RNA引物合成（二）复制的延长 (elongation)复制的延长指在DNA-pol 催化下，dNTP以dNMP的方式逐个加入引物或延长中的子链上，其化学本质是磷酸二酯键的不断生成。 3AAGACCTATT55TTCTGGATAA3dATP+DNA pol 5 35dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTPOH 33DNA-pol领头链的合成随从链的合成阶段一阶段二阶段三阶段四1. 原核生物基因是环状DNA，双向复制的 汇合点就是复制的终止点。o

14、riter8232（三）复制的终止2. 领头链上的RNA引物被RNA酶水解后， 由DNA pol I 催化，由新合成链提供 3-OH补齐。原核生物基因是环状DNA，双向复制的复制片段在复制的终止点(ter)处汇合。oriter E.coli8232 ori terSV40500（三）复制的终止过程： 切除引物、填补空缺、连接切口555RNA酶OHP5DNA-pol dNTP55PATP ADP+Pi55DNA连接酶3. 随从链上不连续性片段的连接真核生物每个染色体是多复制子复制。复制有时序性，即复制子以分组方式激活。 复制的起始需要DNA-pol和pol参与。还需拓扑酶和复制因子 (repli

15、cation factor, RF)。 增殖细胞核抗原(proliferation cell nuclear antigen, PCNA)在复制起始和延长中起关键作用。（一）复制的起始二、真核生物的DNA生物合成 领头链3535亲代DNA5335随从链引物核小体（二）复制的延长 染色体DNA呈线状，复制在末端停止。 复制中岡崎片段的连接，复制子之间的 连接。 染色体两端DNA子链上最后复制的RNA 引物，去除后留下空隙。（三）复制的终止53355335+53333555染色体复制危机反转录和其他的复制方式Reverse Transcription and Other DNA Replicati

16、on Ways第四节反转录酶 (reverse transcriptase) 反转录 (reverse transcription)现象RNADNA 逆转录酶一、反转录病毒和反转录酶 又称为逆转录酶，为依赖RNA的DNA聚合酶，(RNA-dependent DNA polymerase, RDDP)反转录酶是多功能酶，有三种酶活性：1. 反转录活性：即以RNA为模板合成DNA2. RNase活性：水解RNA:DNA中的RNA3. DNA pol活性：以DNA为模板合成DNA反转录病毒细胞内的逆转录过程RNA 模板反转录酶DNA-RNA 杂化双链RNA酶单链DNA反转录酶双链DNA反转录酶 A

17、AA A T T T TAAAASI核酸酶 DNA聚合酶碱水解 T T T T分子生物学研究可应用反转录酶，作为获取基因工程目的基因的重要方法之一，此法称为cDNA法。 以mRNA为模板，经反转录合成的与mRNA碱基序列互补的DNA链。 试管内合成cDNAcDNA complementary DNA二、反转录研究的意义 反转录酶和反转录现象，是分子生物学研究中的重大发现。 反转录现象说明：至少在某些生物，RNA同样兼有遗传信息传代与表达功能。对反转录病毒的研究，拓宽了20世纪初已注意到的病毒致癌理论。 端粒帽 染色体 端粒帽端粒帽端粒DNA端粒结合蛋白三、端粒酶 端粒(telomere)指真核

18、生物染色体线性DNA分子末端的结构 对外: 抵御核酸酶等外界 因素的袭击保护染色体结构和功能的完整性染色体对内: 染色体DNA的末端复制问题功能 维持染色体的稳定性 维持DNA复制的完整性 结构特点 由末端单链DNA序列和蛋白质构成。 末端DNA序列是多次重复的富含T、G 碱基的短序列。TTTTGGGGTTTTGGGG 功能 维持染色体的稳定性 维持DNA复制的完整性The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2009Elizabeth H. Blackburn 1/3 of the prizeUniversity of California San F

19、rancisco, CA, USA 1948 (in Hobart, Tasmania, Australia) Carol W. GreiderJohns Hopkins University School of Medicine Baltimore, MD, USA Harvard Medical School; Massachusetts General Hospital Boston, MA, USA; Howard Hughes Medical Institute 1961 - for the discovery of how chromosomes are protected by

20、telomeres and the enzyme telomeraseJack W. Szostak 1/3 of the prize1/3 of the prize 1952 (in London, United Kingdom) 端粒酶 (telomerase)端粒酶RNA (human telomerase RNA, hTR)端粒酶协同蛋白 (human telomerase associated protein 1, hTP1)端粒酶反转录酶 (human telomerase reverse transcriptase, hTRT) 组成: 作用： 填补子链5 -末端引物水解后留下的

21、空隙，防 止DNA缩短。端粒酶催化作用的爬行模型 正常细胞：细胞分裂细胞分裂 衰老死亡 细胞年轻化 端粒酶 重新引入抗衰老端粒、端粒酶与细胞衰老 约85%的肿瘤组织有端粒酶活性; 癌细胞在某些机制的作用下启动端粒酶表达而使染色体端粒稳定地维持在一定长度; 从而使癌细胞得以持续增殖、转移并获得永生。 端粒、端粒酶与肿瘤DNA损伤（突变）与修复DNA Damage (Mutation) and Repair第五节遗传物质的结构改变而引起的遗传信息改变，均可称为突变 (mutation)。在复制过程中发生的DNA突变称为DNA损伤 (DNA damage)。从分子水平来看，突变就是DNA分子上碱基的改变。 一、突变的意义（一）突变是进化、分化的分子基础（二）突变导致基因型改变（三）突变导致死亡（四）突变是某些疾病的发病基础二、引发突变的因素 物理因素: 紫外线 (ultra violet, UV)、各种辐射 UV化学因素三、突变的分子改变类型错配 (mismatch)缺失 (deletion)插入 (insertion)重排 (rearrangement)框移(frame-shift) DNA分子上的碱基错配又称点突变 (point mutation)发生在同型碱基之间，即嘌呤代替另一嘌呤，或嘧啶代替另一嘧啶。转换发生在异型碱基之