生命科学进展(人类干细胞研究进展)

1、1生命科学进展人类干细胞研究进展人类干细胞研究进展Progress of the study of Human Stem Cell 2Whats Stem Cell ? 干细胞是动物（包括人）胚胎干细胞是动物（包括人）胚胎及某些器官中具有及某些器官中具有自我复制自我复制和和多向多向分化潜能分化潜能的原始细胞，能分裂、产的原始细胞，能分裂、产生出表现型和基因型都和自己完全生出表现型和基因型都和自己完全相同的子细胞，同时还能分化为各相同的子细胞，同时还能分化为各类细胞，是重建、修复病损或衰老类细胞，是重建、修复病损或衰老组织、器官功能的理想种子细胞。组织、器官功能的理想种子细胞。 3 干细胞生物学

2、研究与应用几乎干细胞生物学研究与应用几乎涉及所有生命科学和生物医药学领涉及所有生命科学和生物医药学领域。除了在细胞治疗、组织器官移域。除了在细胞治疗、组织器官移植、基因治疗具重要意义外，还将植、基因治疗具重要意义外，还将在新基因发现与基因功能分析、发在新基因发现与基因功能分析、发育生物学研究、新药开发与药效以育生物学研究、新药开发与药效以及毒性评估等领域产生极其重要的及毒性评估等领域产生极其重要的影响。影响。4 干细胞研究干细胞研究1999年被年被Science评为十大科技进展评为十大科技进展之首；之首；2000年再度入选世年再度入选世界十大科技进展；界十大科技进展；5美国诺贝尔奖获得者吉尔伯

3、特预言美国诺贝尔奖获得者吉尔伯特预言 “用不了用不了50年，人类将能年，人类将能够培育出人体的所有器官。够培育出人体的所有器官。”6Characters of Stem Cellw 具有无限增殖分裂的能力；具有无限增殖分裂的能力；w 长期保持自我稳定的能力；长期保持自我稳定的能力；w 长期保持分化成其它细胞的可能性；长期保持分化成其它细胞的可能性； w 产生新细胞是对组织（细胞）损伤的反产生新细胞是对组织（细胞）损伤的反应；应；w 以对称或不对称两种方式进行生长：或以对称或不对称两种方式进行生长：或保持不分化状态，或不可逆地向终末分保持不分化状态，或不可逆地向终末分化（化（由细胞质中调节分化蛋

4、白不均匀分由细胞质中调节分化蛋白不均匀分配决定配决定）。）。 7干细胞研究重要事件干细胞研究重要事件(1)w 1981年，Evans等获得小鼠胚胎干细胞；w 1990年，Piedrahita等获得猪和绵羊的胚胎干细胞；w 1991年，Meineeke-Tillmann等获得山羊胚胎干细胞；w 1992年，Satio等获得牛胚胎干细胞；w 1992年，Sukoyan等获得水貂胚胎干细胞；w 1993年，Oraves等获得兔胚胎干细胞；w 1995年，Thomson等获得恒河猴胚胎干细胞；w 1996年，Pain等获得鸡胚胎干细胞；8干细胞研究重要事件干细胞研究重要事件(2)w 1997年美国华盛

5、顿大学的多纳尔托马斯报告说，将正常人的骨髓移植到病人体内，可以治疗造血功能障碍；w 1998年，Thomson和Shamblott实验室分别用人的胚泡和早期胚胎的生殖嵴培养出胚胎干细胞（ES）和生殖嵴干细胞（Embryonic germ stem cell）；9w 在一些原本认为不可更新的组织中发现干细胞，如：亚脑室区、侧脑室区和嗅球的连接处以及海马区；w 目前已发现存在干细胞的组织有：骨髓、外周血、脐血、血管、脑、脊髓、皮肤、骨骼肌、肝脏、胰腺、角膜、视网膜、牙齿和消化系统上皮等。干细胞研究重要事件干细胞研究重要事件(3)10w 1999年年12月，美国科学家在月，美国科学家在美国科学美国科

6、学院院刊院院刊报告说，小鼠肌肉组织的成体报告说，小鼠肌肉组织的成体干细胞可以干细胞可以“横向分化横向分化”为血液细胞。为血液细胞。随后，世界各国的科学家相继证实，成随后，世界各国的科学家相继证实，成体干细胞，包括人类的体干细胞，包括人类的成体干细胞具有成体干细胞具有可塑性可塑性。避开了伦理争议和异体免疫排。避开了伦理争议和异体免疫排斥问题。斥问题。 干细胞研究重要事件干细胞研究重要事件(4)11w 20002000年年5 5月，日本把干细胞技术的出现视作在月，日本把干细胞技术的出现视作在生命科学和生物技术领域赶超欧美国家的绝生命科学和生物技术领域赶超欧美国家的绝好机遇。在好机遇。在200020

7、00年度启动的年度启动的“千年世纪工程千年世纪工程”中，日本把干细胞工程作为四大重点之一，中，日本把干细胞工程作为四大重点之一，并且在第一年度就投入并且在第一年度就投入108108亿日元的巨额资金；亿日元的巨额资金；w 美国总统美国总统20002000年年8 8月月4 4日宣布：美国政府自今日宣布：美国政府自今日起准许用政府经费进行已有人体胚胎干细日起准许用政府经费进行已有人体胚胎干细胞研究；胞研究；w 20002000年年1212月月1919日，英国下议院也超过日，英国下议院也超过2 23 3的的多数票通过了允许克隆人类早期胚胎，并从多数票通过了允许克隆人类早期胚胎，并从中提取干细胞进行医疗

8、研究的决议。中提取干细胞进行医疗研究的决议。干细胞研究重要事件干细胞研究重要事件(5)12w 2001年年1月，英国议会上院通过法案，允许科月，英国议会上院通过法案，允许科学家克隆人类早期胚胎，并利用它进行医疗学家克隆人类早期胚胎，并利用它进行医疗研究。研究。 w 2001年年4月，美国科学家发现，从病人臀部和月，美国科学家发现，从病人臀部和大腿处抽取的脂肪中，含有大量类似干细胞大腿处抽取的脂肪中，含有大量类似干细胞的细胞，这些细胞可以发育成健康的软骨和的细胞，这些细胞可以发育成健康的软骨和肌肉等。这一发现有可能使脂肪成为干细胞肌肉等。这一发现有可能使脂肪成为干细胞的主要来源。科学家今后可能将

9、不必从胚胎的主要来源。科学家今后可能将不必从胚胎组织或骨髓中提取干细胞，从而既可降低成组织或骨髓中提取干细胞，从而既可降低成本，又能避免伦理上的争论。本，又能避免伦理上的争论。 干细胞研究重要事件干细胞研究重要事件(6)13w 2001年年4月，美国国立卫生研究院决定月，美国国立卫生研究院决定取消原定举行的人类胚胎干细胞研究经取消原定举行的人类胚胎干细胞研究经费申请案的审查会议。该申请案是美国费申请案的审查会议。该申请案是美国第一例人类胚胎干细胞研究经费申请案。第一例人类胚胎干细胞研究经费申请案。这意味着布什政府将不对人类胚胎干细这意味着布什政府将不对人类胚胎干细胞研究进行资助。胞研究进行资助

10、。 干细胞研究重要事件干细胞研究重要事件(7)14干细胞研究重要事件干细胞研究重要事件(8)w 2005年年2月加拿大科学家在人体脐带中发现一月加拿大科学家在人体脐带中发现一种新的干细胞源，这一发现为促进骨髓移植种新的干细胞源，这一发现为促进骨髓移植治疗和组织修复带来新的希望。治疗和组织修复带来新的希望。w 这种干细胞可以生成骨胳、软骨、肌肉和其这种干细胞可以生成骨胳、软骨、肌肉和其他结缔组织。把在结缔组织中发现的这些干他结缔组织。把在结缔组织中发现的这些干细胞分离、培养几周，生成了足够多的细胞。细胞分离、培养几周，生成了足够多的细胞。w 这项发现将对骨髓移植有促进作用。骨髓移这项发现将对骨髓

11、移植有促进作用。骨髓移植经常用于治疗白血病、某些癌症以及免疫植经常用于治疗白血病、某些癌症以及免疫系统功能紊乱。系统功能紊乱。15干细胞研究重要事件干细胞研究重要事件(9)w 2004年年12月，月，法国科学家发现，通过培法国科学家发现，通过培育人类干细胞可以将每个干细胞转化为育人类干细胞可以将每个干细胞转化为200万个红血球。万个红血球。 w 该发现向着数十年来批量制造红细胞的该发现向着数十年来批量制造红细胞的目标又迈进了一大步，该研究将最终使目标又迈进了一大步，该研究将最终使得血液短缺成为历史。得血液短缺成为历史。 16干细胞研究重要事件干细胞研究重要事件(10)w 2005年年1月，月，

12、台大医院陈耀昌等医生从满月生台大医院陈耀昌等医生从满月生产的新鲜胎盘，分离出胎盘间质干细胞，是产的新鲜胎盘，分离出胎盘间质干细胞，是介于介于“胚胎干细胞胚胎干细胞”与与“成体干细胞成体干细胞”间的间的新种干细胞；新种干细胞；w 放入培养基中诱导分化，大约放入培养基中诱导分化，大约5 5到到7 7天后，干天后，干细胞分别成功分化为神经、脂肪、成骨细胞。细胞分别成功分化为神经、脂肪、成骨细胞。w 与脐带血干细胞相比，一只胎盘约重与脐带血干细胞相比，一只胎盘约重700700800800克，脐带血只有克，脐带血只有80809090克，胎盘干细胞的数量克，胎盘干细胞的数量更充裕；更充裕；17干细胞研究重

13、要事件干细胞研究重要事件(11)w 2005年年1月月30日日在美国威斯康星大学工作的在美国威斯康星大学工作的中国科学家张素春和李学军报告说，他们成中国科学家张素春和李学军报告说，他们成功功地地用人类胚胎干细胞分化出了运动神经元用人类胚胎干细胞分化出了运动神经元； w 发现只有在相当于人类胚胎发育第三周到第发现只有在相当于人类胚胎发育第三周到第四周这一段时间里，胚胎干细胞才有可能分四周这一段时间里，胚胎干细胞才有可能分化成运动神经元化成运动神经元； w 首先首先要要将胚胎干细胞分化成神经干细胞，然将胚胎干细胞分化成神经干细胞，然后使神经干细胞生长为运动神经元祖细胞，后使神经干细胞生长为运动神经

14、元祖细胞，最后才使祖细胞变成运动神经元最后才使祖细胞变成运动神经元； 18干细胞分类干细胞分类o全能性干细胞（Totipotent stem cell）；o多能性干细胞(Pluripotent stem cell)；o单能性干细胞(Unipotent stem cell)；19干细胞分类干细胞分类20干细胞的可塑性干细胞的可塑性w 科学证明，一种组织的成体干细胞可以产生其它的组织和细胞。骨髓干细胞 神经细胞神经干细胞 造血细胞骨髓肌间叶干细胞 造血细胞提示：成人组织干细胞可能存在广谱的分化潜能； 干细胞工程不一定取自胚胎干细胞； 微环境对干细胞转化具非常重要的作用；21干细胞分化的调控干细胞分

15、化的调控w 迄今为止，触发和控制细胞分化的机制尚不明了；是预先程序化还是受环境的调控是一个有争议的话题；w 内在调控： 转录因子，端粒酶活性，结构蛋白等以各种方式影转录因子，端粒酶活性，结构蛋白等以各种方式影响干细胞的有丝分裂、分裂部位及染色体的功能；响干细胞的有丝分裂、分裂部位及染色体的功能；w 外在调控(微环境)：v 整合素：细胞受损时，胞外信息通过整合素传递给干细胞受损时，胞外信息通过整合素传递给干细胞，以触发跨膜信号转导，调控干细胞的基因表达；细胞，以触发跨膜信号转导，调控干细胞的基因表达；v细胞因子：干细胞因子，干细胞生长因子，白细胞介干细胞因子，干细胞生长因子，白细胞介素，表皮细胞

16、生长因子，成纤维细胞生长因子，肝细素，表皮细胞生长因子，成纤维细胞生长因子，肝细胞生长因子等；胞生长因子等；22干细胞培养干细胞培养w 饲养层细胞：提供附植环境；提供附植环境；饲养层细胞分泌物对维持干细胞的生长、抑饲养层细胞分泌物对维持干细胞的生长、抑制分化起重要作用；制分化起重要作用；人类胚胎干细胞（人类胚胎干细胞（ES）可用小鼠纤维母细胞）可用小鼠纤维母细胞作饲养层，但效果不十分理想；可用人输卵作饲养层，但效果不十分理想；可用人输卵管上皮细胞作饲养层；管上皮细胞作饲养层；w 培养液；23干细胞的伦理和社会问题干细胞的伦理和社会问题(1)w生殖性克隆；w治疗性克隆；24干细胞的伦理和社会问题

17、干细胞的伦理和社会问题(2)w 英国2000年通过了准许在严格管理的条件下克隆人类早期胚胎进行干细胞研究；w 美国总统布什在2001年8月宣布，美国政府将仅仅支持对已有的胚胎干细胞进行研究；w 德国不仅只允许研究2002年1月30日以前产生的胚胎干细胞，而且还必须是在没有其它可选择的情况下才能进行。25干细胞的伦理和社会问题干细胞的伦理和社会问题(3)w 中国对胚胎干细胞研究，即治疗性克隆持支持态度。中科院副院长陈竺院士2002年7月指出：“一个体外的胚胎在有限的时间，如14天里，尚属一般的生物细胞，此时还没有神经细胞和脑细胞的产生，既无知觉也无感觉，因此科学界一般认为它在此时还不是一个道德意

18、义上的人。人类干细胞研究给21世纪医学的革命性发展带来可能，因此总的平衡利弊，还是要支持”。2526干细胞的伦理和社会问题干细胞的伦理和社会问题(4)w 2005年年2月月18日，经过激烈的辩论，第日，经过激烈的辩论，第59届联合国大会法律委员会以届联合国大会法律委员会以71票赞成、票赞成、35票反对、票反对、43票弃权票弃权的表决结果，以决的表决结果，以决议的形式通过一项政治宣言，要求各国议的形式通过一项政治宣言，要求各国禁止有违人类尊严的任何形式的克隆人。禁止有违人类尊严的任何形式的克隆人。27Determination of Stem Cell干细胞的鉴别干细胞的鉴别w 细胞周期特征：细

19、胞周期特征： 慢周期性（标记滞留法）；慢周期性（标记滞留法）； 无限增殖能力，形成细胞克隆；无限增殖能力，形成细胞克隆； w 干细胞表面受体鉴别：干细胞表面受体鉴别： 荧光素标记；荧光素标记； 受体结合标记；受体结合标记；28Three Steps on the Research of Stem Cellw 获得干细胞系获得干细胞系 ; ;w 建立干细胞诱导分化模型建立干细胞诱导分化模型 ; ;w 将上述干细胞或干细胞培育体系植入动将上述干细胞或干细胞培育体系植入动物或人的相应器官或组织，考察其效果。物或人的相应器官或组织，考察其效果。29Three Steps on the Research

20、 of Stem Cell （1）w 获得干细胞系：获得干细胞系： 这是本研究最重要的第一步。可以这是本研究最重要的第一步。可以从动物或人的早期胚胎或各器官、组织从动物或人的早期胚胎或各器官、组织中分离并经鉴定，且能在体外长期保持中分离并经鉴定，且能在体外长期保持干细胞特性（一般应稳定传干细胞特性（一般应稳定传25代以上）；代以上）； 30Three Steps on the Research of Stem Cell （2）w 建立干细胞诱导分化模型：建立干细胞诱导分化模型： 可利用基因工程手段引入外源目的可利用基因工程手段引入外源目的基因（对原有致病基因进行置换改造），基因（对原有致病基因

21、进行置换改造），探索诱导干细胞向特定组织、器官分化探索诱导干细胞向特定组织、器官分化的化学或的化学或/和物理条件；和物理条件； 31Three Steps on the Research of Stem Cell （3）w将上述干细胞或干细胞培育体系植将上述干细胞或干细胞培育体系植入动物或人的相应器官或组织中，入动物或人的相应器官或组织中，考察其效果。考察其效果。 32Merits of stem cell therapyMerits of stem cell therapy干细胞治疗的优点干细胞治疗的优点w 低毒性（或无毒性），一次治疗有效；w 不需要完全了解疾病发病的确切机理； w 用自身

22、干细胞移植，可避免产生免疫排斥反应。 33胚胎干细胞研究步履蹒胚胎干细胞研究步履蹒跚跚 成体干细胞研究如火如荼成体干细胞研究如火如荼34将体细胞核注入去核卵母细胞将体细胞核注入去核卵母细胞35胚胎干细胞的来源胚胎干细胞的来源w 早期胚胎细胞团分离（早期胚胎细胞团分离（ES）；）；w 胚胎生殖嵴分离的胚胎生殖细胞胚胎生殖嵴分离的胚胎生殖细胞（EG）；）； 两者的形态、标志、体内分化两者的形态、标志、体内分化潜能及种系传递功能都相似。潜能及种系传递功能都相似。36胚胎干细胞胚胎干细胞w 受精后受精后57d，胚胎由大约，胚胎由大约140个细胞组个细胞组成，呈空心圆球状，即成，呈空心圆球状，即胚泡。胚

23、泡。w 胚泡中央的腔称胚泡中央的腔称“囊胚腔囊胚腔”；w 胚泡囊胚腔一侧的细胞群即为胚泡囊胚腔一侧的细胞群即为胚胎干细胚胎干细胞胞；w 胚胎干细胞可能发育成完整的个体，或胚胎干细胞可能发育成完整的个体，或演变成构成人体任何器官、组织的演变成构成人体任何器官、组织的200多种细胞；多种细胞；37小鼠小鼠4细胞胚细胞胚w 刚刚分裂成刚刚分裂成4 4个细胞哺乳动物胚胎，其细胞就个细胞哺乳动物胚胎，其细胞就有了不同的发育特征，每个细胞可能不是全有了不同的发育特征，每个细胞可能不是全能的能的; ; 38桑椹胚阶段的克隆胚桑椹胚阶段的克隆胚39人胚干细胞40人早期胚胎人早期胚胎囊胚囊胚41人胚干细胞42T

24、he Characters of ESC w 饲养层依赖的；饲养层依赖的；w 有抑制因子存在时呈未分化状态；有抑制因子存在时呈未分化状态；w 无抑制因子存在时可被诱导成各种细胞；无抑制因子存在时可被诱导成各种细胞；w 悬浮培养时可形成拟胚体，并有序分化；悬浮培养时可形成拟胚体，并有序分化；43常用滋养层常用滋养层w 小鼠成纤维细胞无限系（小鼠成纤维细胞无限系（STO）；）；w 小鼠原始胚胎成纤维细胞（小鼠原始胚胎成纤维细胞（PMEF）；）； 上述两种细胞都可以分泌成纤维细胞生上述两种细胞都可以分泌成纤维细胞生长因子（长因子（Fibroblast Growth Factor，FGF）和分化抑制因

25、子（）和分化抑制因子（Leukemia Inhibitory Factor，LIF），既有助于），既有助于ES细胞增殖，又能抑制细胞凋亡和分化；细胞增殖，又能抑制细胞凋亡和分化；44Cultivation of ESCw ESC置于滋养层上；w 放入CO2（5%）培养箱中，3739,饱和湿度；w 培养液：DMEM+15%胎牛血清+LIF+EGF（表皮生长因子）+IGF（胰岛素样生长因子）+胰岛素+-巯基乙醇； 45ESC的传代的传代w 用胰酶/EDTA消化ESC克隆；w 用微吸管或针将其打碎成单细胞或细胞团；w 移入新培养基；46ESC的鉴定的鉴定w 细胞小，核较大，明显，有细胞小，核较大，明

26、显，有1至多个核仁；至多个核仁；w 细胞间界限清晰，形态扁平；细胞间界限清晰，形态扁平；w 碱性磷酸酶（碱性磷酸酶（AKP）染色阳性；）染色阳性；w 细胞克隆如鸟巢状；细胞克隆如鸟巢状；w 胚胎阶段细胞特异表面抗原胚胎阶段细胞特异表面抗原SSEA-4强阳性、强阳性、SSEA-3弱阳性弱阳性；肿瘤相关抗原；肿瘤相关抗原TRA-1-60、TRA-1-81阳性；阳性；M-22-25、ESMA-7反应阳性；反应阳性；w 端粒酶活性高；端粒酶活性高；47EGC的鉴定的鉴定w 细胞克隆紧密堆积；细胞克隆紧密堆积；w 细胞界限不很清楚；细胞界限不很清楚；w 细胞核较大；细胞核较大；w 细胞表面具细胞表面具S

27、SEA-1、SSEA-3、SSEA-4、TRAS-1-60和和TRA-1-81抗原；抗原；48胚胎干细胞诱导分化胚胎干细胞诱导分化心肌、横纹肌细胞造血细胞上皮细胞49胚胎干细胞分化为特定器官胚胎干细胞分化为特定器官50The Key of the Research of ESCw 体外生长保持不分化；DIA、LIF和和HILD能抑制分化，有售；能抑制分化，有售；w 按需要定向分化；二甲亚砜可诱导肌细胞分化；二甲亚砜可诱导肌细胞分化；维甲酸可诱导神经细胞分化；维甲酸可诱导神经细胞分化；环六亚甲基双乙酰胺（环六亚甲基双乙酰胺（HMBA）；）；高密度生长时分化成多种不同类型细胞；高密度生长时分化成多

28、种不同类型细胞；低密度生长时仅分化成少数几种细胞；低密度生长时仅分化成少数几种细胞；w 条件不宜时易发生恶性转化；51ESC的分化诱导因子w 碱性成纤维细胞生长因子（碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）；）；w 转化生长因子转化生长因子1（TGF-1)；w 骨形态发生蛋白骨形态发生蛋白4（BMP-4）；）；w 造血生长因子（造血生长因子（HGF）；）；w 表皮生长因子（表皮生长因子（EGF）；）；w 维生素维生素A酸（酸（RA）；）；w 二甲亚砜（二甲亚砜（DMSO）；）；w 双环磷酸腺苷（双环磷酸腺苷（db-cAMP）；）； 5052胚胎干细胞研究胚胎干细胞研究(1)w 80年代中期我国科学家

29、建立小鼠胚胎干细胞系；w 1995年，汤姆森等从恒河猴囊胚中分离建立了世界第一株灵长类胚胎干细胞；w 1995年，华盛顿大学医学院的贝恩（G.Bain）用维生素A的衍生物视黄酸处理小鼠胚胎干细胞，使之转变成神经细胞；w 1998年，汤姆森等从不孕症治疗的夫妇捐献的处于囊胚的人早期胚胎中分离获得人胚胎干细胞；w 1998年，我国科学家培养出人胚胎干细胞，并先后诱导形成了浆细胞、造血干细胞；53胚胎干细胞研究胚胎干细胞研究(2)w 1998年吉尔哈特等从流产胚胎的生殖腺（Gonadal germ) 中分离出原始胚胎生殖细胞，经诱导，生成胚胎干细胞；w 1999年，在上海建立小鼠胚胎生殖嵴（EG）干

30、细胞系；w 2000年，澳大利亚和新加坡科学家从人囊胚成功建立了2株人胚胎干细胞系，并从中分化得到神经祖细胞；w 2001年年1月月浙江大学药学院副院长楼宜嘉教授等通过药物诱导在体外将胚胎干细胞定向分化成心肌细胞，能搏动。54胚胎干细胞研究胚胎干细胞研究(3)w 2001年年8月月中国西北农林科技大学窦忠英等从人胎儿原始生殖细胞分化得到能跳动的类心肌细胞，每分钟跳90次。w 2001年年11月月美国马萨诸塞州的先进细胞技术公司Jose Cibelli 等用化学药物处理77枚猴子的卵，其中4枚单性发育到囊胚期，从中分离出干细胞，诱导它们形成神经细胞、平滑肌细胞、心肌细胞和脂肪细胞等，从而有助于跨

31、有助于跨越伦理道德的障碍。越伦理道德的障碍。w 2001年，美国威斯康星大学的考夫曼等成功地让人胚胎干细胞分化成骨髓造血干细胞，并进一步培养成红细胞、白细胞和血小板；55胚胎干细胞研究胚胎干细胞研究(4)w 2001年美国科学家利用体细胞克隆技术体细胞克隆技术制造出人早期胚胎，并从中获得胚胎干细胞，避免了直接利用胚胎带来的伦理上的麻烦。w 2001年年12月月美国人种起源研究所把人胎人胎盘干细胞盘干细胞转化成神经细胞、血细胞、软骨细胞、皮肤细胞、肌细胞。56 美国马萨诸塞州的生物技术公司美国马萨诸塞州的生物技术公司Advanced Cell Technology 2001.11.25成功克隆出

32、人类胚胎，在克隆成功克隆出人类胚胎，在克隆人的技术上迈出了重要一步，不过该公司表示其目的人的技术上迈出了重要一步，不过该公司表示其目的不是为了克隆人，而是为了获得能够用于治疗帕金森不是为了克隆人，而是为了获得能够用于治疗帕金森综合症和青少年糖尿病等各种疾病的干细胞。综合症和青少年糖尿病等各种疾病的干细胞。57胚胎干细胞研究胚胎干细胞研究(5)w 2002年年2月月日本京都大学再生医学科学研究所用鼠胚胎干细胞鼠胚胎干细胞培育出胰岛细胞，并将它们转移到3只患糖尿病的实验鼠体内，一周后实验鼠的血糖值都正常。w 2002年年2月月美国马萨诸塞州的先进细胞技术公司从母牛耳朵取皮肤细胞的细胞核，与去核卵电

33、激融合（体细胞克隆）（体细胞克隆），形成早期胚胎。取出其中的胚胎干细胞，放在肾形可降解“支架”上生长，获得外形和功能都似牛肾的微型器官，可泌尿，存活数月，不被排斥。58胚胎干细胞研究胚胎干细胞研究(6)w 2002年年3月月剑桥大学乔治戴利和鲁道夫耶尼施等对鼠胚干细胞的免疫缺陷基因免疫缺陷基因进行修复进行修复后，再将其植入鼠体，结果修复了鼠的免疫系统缺陷。w 2002年年3月月美国麻省理工学院罗伯特兰格等利用人胚干细胞培育出可能形成血人胚干细胞培育出可能形成血管的组织，管的组织，将它们注入免疫抑制的鼠中，未受排斥，14天后形成毛细血管网。59胚胎干细胞研究胚胎干细胞研究(7)w 2002年年1

34、0月月中国河北农业大学桑润滋教授等在国内首次分离出山羊早期胚胎的类胚胎干山羊早期胚胎的类胚胎干细胞和类生殖细胞细胞和类生殖细胞，经培养、分化试验，获得了类神经细胞和上皮细胞。w 2002年年10月月广州中山大学附属第二医院黄绍良教授等在国内首次建立三个中国人胚胎干细胞系CHE1、CHE2和CHE3，并采用分阶段方法成功诱导小鼠胚胎干细胞发育成造血干细胞。60胚胎干细胞研究胚胎干细胞研究(8)w 美国威斯康星大学把胚胎干细胞培养成血小板、红细胞和白细胞。w 2003年日本三菱化学生命科学研究所科学家将老鼠的胚胎干细胞与能够生成BMP4蛋白质的细胞一同培育后，植入老鼠的睾丸，胚胎干细胞逐渐转变成精

35、胚胎干细胞逐渐转变成精子细胞。子细胞。61胚胎干细胞研究胚胎干细胞研究(9)w 2005年2月，美国北卡罗莱纳州大学的研究人员报告，用一种生长因子处理培养的小鼠胚胎干细胞，再用纤维原细胞生长因子将胚胎干细胞处理7天，使胚胎干细胞分化成类似前体细胞的早期内皮层细胞；w 然后将这种细胞注射到小鼠的肝脏中，从而导致肝脏细胞持续生产第九因子，逆转了一种类型的血友病。这种类型的小鼠血友病与人类的B型血友病很相似 ；w 4个月后这些细胞仍不被免疫系统所排斥；62胚胎干细胞研究胚胎干细胞研究(10)w 2005年2月以色列魏茨曼科学学院的耶尔瑞瑟教授说，在猪胚胎受孕的第六周取出的胚胎肝脏、胰腺和肺的先质组织

36、移入老鼠体内，既不会发生被移植组织发育成畸胎瘤的危险，又可以看到被移植组织成功地发育成健康的细胞群；w 该实验为异种器官移植奠定了理论基础；该实验为异种器官移植奠定了理论基础； 63胚胎干细胞研究胚胎干细胞研究(11)w 国家973计划首席科学家曹谊林2005年1月透露：他们从兔子眼内分离了小小1平方毫米的角膜缘干细胞，移植手术后8周，这块“复制品”变成透明状，令兔子的眼睛重放光明。w 随着组织工程技术不断发展与完善，这一成随着组织工程技术不断发展与完善，这一成果今后将运用于临床，它意味着，果今后将运用于临床，它意味着，“人体器人体器官复制工厂官复制工厂”的梦想离我们又近了一步。的梦想离我们又

37、近了一步。w 在目前我国在目前我国200万万因角膜疾患而失明的因角膜疾患而失明的患者中，患者中，每年仅有每年仅有20002500例能够手术。例能够手术。 64胚胎干细胞研究面临的挑战胚胎干细胞研究面临的挑战w 如何维持体外培养时细胞不分化？如何维持体外培养时细胞不分化？w 如何定向诱导干细胞分化？如何定向诱导干细胞分化？w 如何增殖已定向分化的细胞？如何增殖已定向分化的细胞？w 如何诱导生成所需的组织或器官？如何诱导生成所需的组织或器官？w 如何创造如何创造“万能万能”干细胞？干细胞？w 胚胎干细胞是否安全？胚胎干细胞是否安全？65w脐血干细胞（约占脐血组织的脐血干细胞（约占脐血组织的0.4%

38、）；）；w骨髓造血干细胞（约占骨髓造血骨髓造血干细胞（约占骨髓造血组织的组织的0.1%）；）；w外周血干细胞（约占外周血单核外周血干细胞（约占外周血单核细胞的细胞的0.10.01%） ；它们各自的优缺点？它们各自的优缺点？造血干细胞造血干细胞Hematopoietic Stem Cell (1)66造血干细胞造血干细胞Hematopoietic Stem Cell (2)w 从胚胎发育第从胚胎发育第4个月开始至终生，骨髓个月开始至终生，骨髓是主要的造血器官；是主要的造血器官；w 造血干细胞的两个重要特征：造血干细胞的两个重要特征：高度的高度的自我更新或自我复制能力，自我更新或自我复制能力， 可

39、分化为可分化为各类血细胞各类血细胞(不对称分裂不对称分裂)；w 造血干细胞仅占骨髓有核细胞的造血干细胞仅占骨髓有核细胞的0.5%；67造血干细胞造血干细胞Hematopoietic Stem Cell (3)w 成熟血细胞的产生过程：成熟血细胞的产生过程： 造血干细胞造血干细胞 造血祖细胞造血祖细胞 前体细胞前体细胞 成熟血细胞成熟血细胞68Differentiation of Blood Cells from Hematopoietic Stem Cell造血干细胞分化成各类血细胞造血干细胞分化成各类血细胞造血干细胞（4）69Differentiation of Blood Cells fr

40、om Hematopoietic Stem Cell造血干细胞（5）70脂肪干细胞分化成血管脂肪干细胞分化成血管w2004年年9月，日本大阪大学的中神月，日本大阪大学的中神启德等提取、培养实验鼠的启德等提取、培养实验鼠的脂肪干脂肪干细胞细胞，并把它们注入鼠受损的血管，并把它们注入鼠受损的血管周围。周围。4周后，实验鼠血管内皮细周后，实验鼠血管内皮细胞数约为对照的胞数约为对照的1.5倍，实验鼠受损倍，实验鼠受损腿部的血流量增加了腿部的血流量增加了15%。造血干细胞（6）71The Surface Markers of Hematopoietic Stem Cell造血干细胞的表面标志（1）w C

41、D34分子是目前应用最广泛的造血干分子是目前应用最广泛的造血干细胞的表面阳性标志；细胞的表面阳性标志；w CD34分子是一种跨膜粘蛋白，在造血分子是一种跨膜粘蛋白，在造血干细胞、造血祖细胞、小血管内皮细胞干细胞、造血祖细胞、小血管内皮细胞以及胚胎成纤维细胞表面表达；以及胚胎成纤维细胞表面表达；w CD34+细胞不全是造血干细胞，但造血细胞不全是造血干细胞，但造血干细胞表面都具有干细胞表面都具有CD34分子；分子；w Lin-CD34-细胞中有些是比细胞中有些是比CD34+造血干造血干细胞更原始的前体细胞；细胞更原始的前体细胞；造血干细胞（7）72Molecular Antigen of CD3

42、4 CD34抗原分子w 酸性的糖基化酸性的糖基化I型蛋白，型蛋白，MW=100115kD；w 构成：主肽区构成：主肽区31aa，胞外区，胞外区258aa，跨膜，跨膜区区23aa，胞桨区，胞桨区73aa；其中苏氨酸和丝；其中苏氨酸和丝氨酸各占氨酸各占35%；w 编码基因长编码基因长26kb，含，含8个外显子，位于个外显子，位于染色体染色体1q12-ter区；区；73w 有人认为，有人认为，AC133分子是造血干细胞和分子是造血干细胞和造血祖细胞的特异标记；造血祖细胞的特异标记；w 有人认为，有人认为，KDR（血管内皮生长因子受（血管内皮生长因子受体体2）是可定义造血干细胞、并使之区）是可定义造血

43、干细胞、并使之区别于造血祖细胞的功能标志；别于造血祖细胞的功能标志；The Surface Markers of Hematopoietic Stem Cell造血干细胞的表面标志（2）造血干细胞（8）74w 将血液经密度梯度离心获得包括将血液经密度梯度离心获得包括CD34+细胞的有核细胞，然后以细胞的有核细胞，然后以CD34的特异的特异抗体进行标记，通过流式细胞仪或免疫抗体进行标记，通过流式细胞仪或免疫吸附等方法把吸附等方法把CD34+细胞与未被标记的细胞与未被标记的CD34-细胞分离；细胞分离；w 造血干细胞大多处于细胞静止期，对活造血干细胞大多处于细胞静止期，对活体染料拒染。如何利用？体

44、染料拒染。如何利用？w 造血干细胞移植后能迅速向骨髓回归，造血干细胞移植后能迅速向骨髓回归，如何利用该特点？如何利用该特点？造血干细胞（9）Screening and Isolation of Hematopoietic Stem Cell造血干细胞的筛选分离75Detection of Hematopoietic Stem Cell造血干细胞的检测w 确认小鼠造血干细胞的唯一标准：长期体确认小鼠造血干细胞的唯一标准：长期体内重建造血能力（内重建造血能力（LTR）；）；w 对人骨髓细胞造血活力的检测一直依赖体对人骨髓细胞造血活力的检测一直依赖体外检测：外检测：长期培养启动细胞活力检测（长期培养

45、启动细胞活力检测（LTC-ICLTC-IC）: :将待测将待测细胞在基质细胞层上培育细胞在基质细胞层上培育5 58 8周后，移到半固体周后，移到半固体培养基中培养，凡能够形成混合细胞集落的即培养基中培养，凡能够形成混合细胞集落的即为为LTC-ICLTC-IC阳性；阳性；高增殖力集落形成细胞活力检测（高增殖力集落形成细胞活力检测（HPP-CFC）：）：骨髓细胞在多种造血刺激因子存在时在体外半骨髓细胞在多种造血刺激因子存在时在体外半固体培养基中培养固体培养基中培养1012d后能形成大集落（直后能形成大集落（直径径0.5mm）者；）者；造血干细胞（10） 76Transplantation of h

46、ematopoietic stem cell造血干细胞移植（1）w 造血干细胞具有“归巢”（homing）的特性：经复杂的分子间作用，由外周循环向骨髓迁移、识别和定位；w 介导血液干细胞与骨髓微环境成分之间粘附作用的糖蛋白分子称粘附分子粘附分子；w 粘附分子按其结构和效应分为五类： 选择素、整合素、免疫球蛋白超家选择素、整合素、免疫球蛋白超家族、钙粘蛋白族、钙粘蛋白以及CD44CD44分子分子；造血干细胞（11）77w造血干细胞移植成为恶性肿瘤大剂造血干细胞移植成为恶性肿瘤大剂量量“放疗放疗”和和“化疗化疗”后造血支持后造血支持治疗的主要措施；治疗的主要措施；w含异基因含异基因( (外源基因外

47、源基因) )的造血干细胞的造血干细胞转移，可使受者产生对供者特异的、转移，可使受者产生对供者特异的、终生的免疫耐受；终生的免疫耐受；Transplantation of hematopoietic stem cell造血干细胞移植（2）造血干细胞（12）78w造血干细胞用于基因治疗v具有自我更新能力，病人可能终生受益；v具有多向分化能力，可随血液循环到达靶细胞，发挥基因治疗作用；v目的基因产物可通过血循环到达靶器官；Transplantation of hematopoietic stem cell造血干细胞移植（3）造血干细胞（13）79Marrow Library骨髓库w 建立骨髓库是造血

48、干细胞移植的必然需建立骨髓库是造血干细胞移植的必然需要；要；w 美国骨髓供者库是世界最大的骨髓库，美国骨髓供者库是世界最大的骨髓库，已有注册志愿者已有注册志愿者350多万人；多万人；w 台湾骨髓资料捐赠中心已有登记志愿者台湾骨髓资料捐赠中心已有登记志愿者24万人。已经为约万人。已经为约200人（其中大陆近人（其中大陆近100人）提供了骨髓；人）提供了骨髓；w 大陆已登记的捐赠骨髓志愿者约大陆已登记的捐赠骨髓志愿者约24万人；万人；w 我国有大约我国有大约400万名白血病患者等待合适万名白血病患者等待合适的骨髓移植；的骨髓移植；造血干细胞（14）80Application of Immunolo

49、gical Repressor in HSCT免疫抑制剂在造血干细胞移植中的应用w 环孢菌素环孢菌素A A（CsACsA）；）；w 氨甲喋呤（氨甲喋呤（MTXMTX）；）；w 霉酚酸酯（霉酚酸酯（MMFMMF）；）； 也可以将上述药物联合使用；也可以将上述药物联合使用；造血干细胞（15）81w 将造血干细胞置于与以往不同的环境中，将造血干细胞置于与以往不同的环境中，使其分化受到周围细胞产生的信号的调使其分化受到周围细胞产生的信号的调节，可能分化成多种非造血组织的细胞；节，可能分化成多种非造血组织的细胞； 骨髓干细胞骨髓干细胞 横纹肌、心肌、软骨、骨、横纹肌、心肌、软骨、骨、 肝细胞、神经胶质细

50、胞、血肝细胞、神经胶质细胞、血 管内皮细胞、肺基质细胞；管内皮细胞、肺基质细胞；外周血干细胞外周血干细胞 肝细胞、肾细胞、小肠、肝细胞、肾细胞、小肠、 皮皮 肤及血管的内皮细胞；肤及血管的内皮细胞；Transdifferentiation of Hematopoietic Stem Cell造血干细胞的横向分化造血干细胞（16）82Peripheral Blood Stem Cell Transplantation（PBSCT）外周血干细胞移植v优点优点：无需麻醉，采集方便，可重采；无需麻醉，采集方便，可重采；重建造血功能快，免疫功能恢复早；感染重建造血功能快，免疫功能恢复早；感染等并发症轻；

51、混入肿瘤细胞的机会较少；等并发症轻；混入肿瘤细胞的机会较少；v缺点：细胞少，仅占外周血有核细胞的缺点：细胞少，仅占外周血有核细胞的0.01%0.1%0.01%0.1%，相当于骨髓干细胞的，相当于骨髓干细胞的1% 10%1% 10%；操作较复杂；要有一定条件和设备；费用操作较复杂；要有一定条件和设备；费用比骨髓干细胞移植高；比骨髓干细胞移植高；v外周血外周血CD34+细胞是造血干细胞移植的细胞是造血干细胞移植的重要来源。重要来源。造血干细胞（17）83How to harvest PBSC ?wPhysical methods: o根据细胞大小、形态、密度等离心根据细胞大小、形态、密度等离心收集

52、；收集；wImmunity reaction:o免疫磁珠纯化法；免疫磁珠纯化法；o流式细胞仪；流式细胞仪；造血干细胞（18）84Amplification of PBSC in vitrowIL-1、IL-3、IL-6、G-CSF、GM-CSF和和SCF等等6种因子为最佳组合，种因子为最佳组合，可使有核细胞扩增可使有核细胞扩增1300倍；倍；w还有用还有用IL-1、IL-3、IL-6、SCF结结合合EPO；造血干细胞（19）85How to rise the percentage of peripheral blood stem cellw 抗癌药物；抗癌药物；w 硫酸葡聚糖；硫酸葡聚糖；w

53、吡喃聚合物；吡喃聚合物；w 四氢叶酸；四氢叶酸；w 造血生长因子（包括白细胞介素）；造血生长因子（包括白细胞介素）； 都是安全有效的干细胞动员剂；都是安全有效的干细胞动员剂；造血干细胞（20）86Cord Blood Stem Cell脐血干细胞(1)(CBSC)w 1984年，Boyce等发现人脐带血中含有造血干细胞，并预言脐带血可能是造血干细胞移植的一种新来源；w 1988年Gluckman第一次应用人脐带血移植治疗凡科尼（Fanconis）贫血患儿在巴黎获得成功；w 脐带血的优点：脐带血的优点：v含丰富的造血干细胞和含丰富的造血干细胞和/或祖细胞（约或祖细胞（约1%，与骨，与骨髓相同）；

54、髓相同）；v免疫原（抗原）性较弱（主要含不成熟免疫原（抗原）性较弱（主要含不成熟T细胞）；细胞）；v增殖快，集落形成率高；增殖快，集落形成率高；v所需细胞数少；所需细胞数少；v来源广泛；来源广泛；造血干细胞（21）87Cord Blood Stem Cell脐血干细胞(2)(CBSC)w脐血干细胞是将新生儿的脐血采集、脐血干细胞是将新生儿的脐血采集、冻存起来，主要供体重在冻存起来，主要供体重在3050kg以以下的幼儿、少年和少数成年患者使下的幼儿、少年和少数成年患者使用；用；(12108 8个个单核细胞单核细胞/kg体重，或体重，或0.51.0106 6个个CD34+细胞细胞/kg体重）体重）

55、;w对于多数成年人，怎么办？对于多数成年人，怎么办？w尝试移植尝试移植2份份HLA基本相符的脐血；基本相符的脐血；w体外扩增脐血干细胞；体外扩增脐血干细胞；造血干细胞（22）88Amplification of CBSC in vitrow IL-3IL-3与与KLKL或或FLFL组合，组合，8 8周后扩增约周后扩增约10001000倍，第倍，第1010周细胞数开始下降；周细胞数开始下降；w KLKL和和FLFL组合，可维持组合，可维持12141214周，扩增周，扩增1212万倍；万倍；w 纯化的纯化的CD34CD34+ +细胞，在加入细胞，在加入FLFL和和TPOTPO的培的培养基中，养基中

56、，2525周后可扩增周后可扩增5 5千万倍；千万倍；w 抑制因子抑制因子TGF-TGF-的抗血清的抗血清 可阻断脐血可阻断脐血细胞自分泌细胞自分泌TGF-TGF-的抑制作用，促进的抑制作用，促进CD34CD34+ +细胞增殖；细胞增殖；造血干细胞（23）89The Clinical Application of Cord Blood Stem Cells 脐血干细胞的临床应用w 1972年，年，Ende等报道应用脐血治疗白血病及再等报道应用脐血治疗白血病及再生障碍性贫血；生障碍性贫血；w 1988年，年，Glukman等对等对Fanconi贫血患者实施贫血患者实施亲属间脐血干细胞移植获得成功；

57、亲属间脐血干细胞移植获得成功；w 1994年，年，Issaragrisil等用脐血干细胞治疗重型等用脐血干细胞治疗重型-地中海贫血症女孩成功；地中海贫血症女孩成功；w 1998年，第一军医大学和中山医科大学用脐血年，第一军医大学和中山医科大学用脐血干细胞治疗重型干细胞治疗重型-地中海贫血症女孩成功；地中海贫血症女孩成功；w 全世界已经开展全世界已经开展1000多例；多例；造血干细胞（24）90w 移植是否成功取决于配型和细胞数；移植是否成功取决于配型和细胞数；w 移植前危险因素有哪些？移植前危险因素有哪些？w HLA不完全符合的移植成功率如何？不完全符合的移植成功率如何？w 远期疗效如何？远期

58、疗效如何？The Problems in the Clinical Application of Cord Blood Stem Cells 脐血干细胞临床应用存在的问题造血干细胞（25）91The Cord Blood Library脐血库w 19931993年，美国纽约开始建立脐血库。至年，美国纽约开始建立脐血库。至19981998年存有年存有87008700份，已为世界份，已为世界600600多例患者进行了多例患者进行了脐血移植；脐血移植；w 西欧、加拿大、日本和韩国等相继建立国家西欧、加拿大、日本和韩国等相继建立国家脐血库；脐血库；w 全世界已建立的脐血库全世界已建立的脐血库15015

59、0多个；多个；w 我国在北京、天津、上海、济南、杭州、成我国在北京、天津、上海、济南、杭州、成都和广州分别建立骨髓库，已有脐血都和广州分别建立骨髓库，已有脐血1500015000多多份。份。 远远不够远远不够造血干细胞（26）92Stem Cell and Tissue Engineering干细胞与组织工程w 组织、器官损伤或功能障碍是人类疾病组织、器官损伤或功能障碍是人类疾病和死亡的最主要原因。和死亡的最主要原因。w 现有组织、器官缺损的治疗途径及缺陷：现有组织、器官缺损的治疗途径及缺陷：v自体组织移植；自体组织移植；v异体组织移植；异体组织移植；v人工合成组织代用品；人工合成组织代用品；

60、干细胞与组织工程(1)93 Tissue Engineering 针对患者组织或器官缺损的情况，针对患者组织或器官缺损的情况，利用干细胞工程技术，诱导细胞定向分利用干细胞工程技术，诱导细胞定向分化，为其提供空间支持材料，在体内外化，为其提供空间支持材料，在体内外培育出所需的人体组织。培育出所需的人体组织。 今后可能进一步培育出人造器官。今后可能进一步培育出人造器官。干细胞与组织工程(2)94Three Steps on the Research of Tissue Engineeringw 制备干细胞，诱导定向分化；制备干细胞，诱导定向分化；w 建立由细胞和可降解材料构成的三维空建立由细胞和可