角化细胞培养研究进展

1、会计学1角化细胞培养研究进展角化细胞培养研究进展皮肤主要由表皮和真皮组成，中间由基底膜隔开；表皮由上至下分别为角质层、颗粒层、棘层和基底层；KC主要来源于基底层。1.皮肤结构和KC来源表皮干细胞定向祖细胞终末分化KC凋亡KC10-14d干细胞含量较少，通常处于静息状态，分裂缓慢，短时间获取大量干细胞难度大；而定向祖细胞具有分化潜能且分裂较快的优点。桥粒和角化包膜形成2.KC分化过程1. KC通过PRR识别病原体Kollisch等(2005)用RT-PCR方法发现KC可表达不同的TLR亚型。PGN、poly (I:C)和flagelli可分别与KC的TLR2、TLR3和TLR5结合，从不同程度刺

2、激KC分泌IL-8说明KC可通过TLR识别细菌上的病原相关分子模式(PAMP)，分泌IL-8等物质清除病原体。2. KC分泌AMP杀灭病原体Glaser等(2005)用抗菌测试 试 验 发 现 抗 菌 肽S100A7可特异性的杀死大肠杆菌。ONG等(2005)研究发现LL-37能有效杀灭葡萄球菌。KC在抵抗外来微生物入侵中的另一个重要作用是产生大量的AMP。阳离子抗菌肽主要有LL-37、防御素和S100蛋白家族(Harder and Schroder, 2005)。1.以以3T3细胞作为滋养层细胞作为滋养层 1975年，Rheinwald等首次成功地在体外连续培养人正常KC。 他们把射线灭活的

3、鼠3T3细胞作为滋养层，将胰蛋白酶消化后的单个KC接种于其上，发现KC能明显抑制3T3细胞，且自身生长良好，并将3T3滋养层细胞不断推至培养皿边缘。图中红色为KC，蓝色为3T3细胞1.以以3T3细胞作为滋养层细胞作为滋养层Alain等(1986)用3T3滋养层培养法成功培养了人头皮毛囊KC。5d18d2.以成纤维细胞作为滋养层以成纤维细胞作为滋养层Alain等(1989)首先介绍了用自体成纤维细胞代替3T3细胞作为滋养层，成功培养了人头皮毛囊KC。真皮成纤维细胞 丝裂霉素C或射线有丝分裂后细胞成纤维细胞滋养层KC接种6d3weeksWilkinson等(1987)率先用无滋养层方法成功分离培养

4、了狗KC。皮肤组织分离酶4孵育18h表皮KC培养、传代20孵育45min特定培养基吸管吹吸Hager等(1999)用无滋养层方法成功分离培养了小鼠KC，并将其传至第19代，但只有前10代细胞具有分化能力。真皮胶原酶纱布过滤、离心混合细胞成纤维细胞成纤维细胞条件培养基HCMEMEM.06EMEM.06(1:1)KC培养基Caldelari等(2000)在Wilkinson方法基础上成功分离培养了17.5d小鼠胚胎KC，并在传至第61代依然保持分化活性。17.5d小鼠胚胎皮肤分离酶 defined keratinocyte-SFM表皮KC培养、传代剪碎胰酶消化defined keratinocyt

5、e-SFM提高Ca2 +浓度后，Keratin和E-cadherin表达呈阳性，且浆膜外形成排列紧密的角蛋白网络，细胞间形成稳定的连接结构，说明细胞仍保持分化活力。1.霍乱毒素霍乱毒素(CT)CT是分子量为8400D的蛋白质，由A和B两个亚基组成。B亚基可将腺苷酸环化酶结合到细胞表面，A亚基可激活腺苷酸环化酶。Green(1978)发现浓度为10-11-10-9M的CT均可有效促进细胞生长。1.霍乱毒素霍乱毒素(CT)说明当细胞密度较低时，CT可提高cAMP浓度并促进细胞增殖；当细胞密度增高时，CT可降低cAMP浓度，从而抑制高密度细胞生长。 Natsuko等(1982)细胞密度较低时，CT可

6、促进DNA和蛋白质合成；细胞密度增加后，CT抑制DNA和蛋白质合成向培养基中加入浓度范围为10-14-10-8M的CT后6h，可成百倍的提高胞内cAMP浓度。2.表皮生长因子表皮生长因子(EGF)EGF是分子量为6045D的多聚肽，最先由Cohen(1962)从鼠颌下腺中分离，并发现其具有促进新生小鼠表皮生长和成熟的作用。Rheinwald等(1977)将EGF加入KC培养基后发现，EGF不仅可以促进KC生长，还能增加其寿命。2.表皮生长因子表皮生长因子(EGF)Wilkinson等(1987)也发现EGF可促进狗KC增殖，而且EGF和CT具有协同效应。2.表皮生长因子表皮生长因子(EGF)M

7、iguel等(2001)的发现说明EGF主要通过提高端粒酶的活性来延缓细胞衰老。细胞每次分裂，端粒会缩短一点，当端粒消耗完之后，细胞便会凋亡；而端粒酶可阻止端粒缩短，也就是说端粒酶可延缓细胞凋亡。3.钙离子钙离子(Ca2+)Hennings等(1980)发现在低Ca2+浓度(0.09mM)中，KC以单层形式聚合，并形成“铺路石”样；在高Ca2+浓度(1.14mM)中时，KC会向垂直方向角化并形成4-5层细胞，随后从培养皿上脱落，接种后5d，增殖细胞比例不到60%。0.09mMKC增殖1.14mMKC已分化最先被发现生长受到钙离子影响的细胞是鼠3T3细胞(Boynton等，1974)和人WI-3

8、8成纤维细胞(Boynton等，1977) 。作者发现，当钙离子浓度低于0.5mM时，这两种细胞生长均受到抑制。3.钙离子钙离子(Ca2+)Ca2+浓度小于0.3mM时，细胞数量增多；大于0.3mM时，细胞数量减少。Ca2+浓度小于0.3mM时，含有角化包膜细胞比例较少；大于0.3mM时，含有角化包膜细胞比例增多。说明Ca2+浓度大于0.3mM时，Ca2+会抑制细胞增殖并促进细胞分化。Steven,等(1983)3.钙离子钙离子(Ca2+)1，25-D3可通过诱导PLC-1表达来促进involucrin和 transglutaminase表达1，25-D3可通过诱导PLC-1表达来提升胞内Ca2+浓度。说明1，25-D3可通过诱导PLC-1表达来提升胞内Ca2+浓度，最后促进involucrin和 transglutaminase表达，引起细胞分化。Xie,等(2001）1. KC通过PRR识别病原体Kollisch等(2005)用RT-PCR方法发现KC可表达不同的TLR亚型。PGN、poly (I:C)和flagelli可分别与KC的TLR2、TLR3和TLR5结合，从不同程度刺激KC分泌IL-8说明KC可通过TLR识别细菌上的病原相关分子模式(P