实验六 DNA重组技术_第1页
实验六 DNA重组技术_第2页
实验六 DNA重组技术_第3页
实验六 DNA重组技术_第4页
实验六 DNA重组技术_第5页
已阅读5页，还剩19页未读， 继续免费阅读

下载本文档

版权说明：本文档由用户提供并上传，收益归属内容提供方，若内容存在侵权，请进行举报或认领

文档简介

1、1、什么是DNA重组技术？ 2、重组DNA操作的一般流程3、DNA重组所需要的基本工具 1、获得目的基因；2、与表达载体连接，形成新的重组DNA分子；3、用重组DNA分子转化受体细胞，并能在受体细胞中复制和遗传；4、对转化子筛选和鉴定；5、对获得外源基因的细胞或生物体通过培养，获得所需的遗传性状或表达出所需要的产物。 3、DNA重组所需要的基本工具（1） 准确切割DNA的工具，“” 限制酶；（2） DNA片段的连接工具，“” DNA连接酶；（3） 基因转移工具，“” 载体质粒。 自身不能互补的黏性末端（用两种以上不同的酶处理）（平末端酶处理）带有相同的黏性末端（用相同的酶或同尾酶处理）自身能互

2、补的黏性末端（仅用一种酶处理）带有不同的黏性末端（用不同的酶处理）对不同末端间连接的方法亦不同：对不同末端间连接的方法亦不同：带有相同的黏性末端自身能互补的黏性末端自身不能互补的黏性末端带有不同的黏性末端 根据其所需求的辅助因子的不同，可分为两大类：DNA连接酶类型连接酶类型1）需要ATP参与的 T4 DNA连接酶被T4 噬菌体感染的E.coli , 表达基因的来源为T4 噬菌体。催化DNA上相邻碱基的5磷酸与3羟基间之间形成磷酸二酯键；具有连接亲和（相互匹配）黏性末端DNA以及平末端DNA的作用，加入PEG（聚乙二醇）可促进平末端DNA间的连接速度。酶先与ATP形成酶-ATP共价复合物，再与

3、DNA作用，AMP转移至DNA缺口5-磷酰基上形成焦磷酸碱而活化5-磷酰基，然后再与3-羟基形成磷酸酯碱，完成连接过程。 根据其所需求的辅助因子的不同，可分为两大类：DNA连接酶类型连接酶类型1）需要ATP参与的 T4 DNA连接酶2）需要NAD（尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸）参与的E.coli DNA连接酶1967年从 E.coli 中能够发现分离催化带互补5磷酸或3羟基突出的双链DNA间催化连接，连接平末端的效率极低（只补缺口，不能封闭裂口）。 1）连接酶的用量2）作用的时间与温度3）底物浓度 一般情况下，酶浓度高，反应快，产量高；但：酶是保存在50%甘油里的 高浓度甘油会严重影响连接效果！反应速度随温度的提高而增加；DNA连接酶的最适温度是37但：37时，黏性末端间的氢键结合不稳定，因此，常采用较低的温度反应，如： 16，连接1216h；一般采用提高DNA的浓度来增加重组比例；但：反应体积太大，连接效果也很差；因此，载体与目的基因宜采用等物质的量进行连接。经BamH和Xho酶切过的pBI121质粒和加有BamH和Xho酶切末端的银杏CHS基因恒温水浴锅、超净工作台、移液器、制冰机、PCR离心管、吸头、一次性手套等3）混匀后利用离心机

人人文库> 全部分类> 教育资料 > 课件下载

温馨提示

  • 1. 本站所有资源如无特殊说明，都需要本地电脑安装OFFICE2007和PDF阅读器。图纸软件为CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.压缩文件请下载最新的WinRAR软件解压。
  • 2. 本站的文档不包含任何第三方提供的附件图纸等，如果需要附件，请联系上传者。文件的所有权益归上传用户所有。
  • 3. 本站RAR压缩包中若带图纸，网页内容里面会有图纸预览，若没有图纸预览就没有图纸。
  • 4. 未经权益所有人同意不得将文件中的内容挪作商业或盈利用途。
  • 5. 人人文库网仅提供信息存储空间，仅对用户上传内容的表现方式做保护处理，对用户上传分享的文档内容本身不做任何修改或编辑，并不能对任何下载内容负责。
  • 6. 下载文件中如有侵权或不适当内容，请与我们联系，我们立即纠正。
  • 7. 本站不保证下载资源的准确性、安全性和完整性, 同时也不承担用户因使用这些下载资源对自己和他人造成任何形式的伤害或损失。

最新文档

评论

0/150

提交评论