生物制药课件2-1说课材料

1、生物制药课件2-1细 菌3、糖类 利用细菌可制取葡聚糖、聚果糖、脂多糖，还可生产单糖和寡糖。4、核苷酸类 5-AMP、5-肌苷酸、核苷及磷酸核糖。5、维生素 VB1、VB2、VB6、烟酸、生物素等。6、酶 -淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、几丁质酶等。放 线 菌 放线菌是最重要的抗生素产生菌，已有1000多种抗生素约2/3产自放线菌，其代谢产物也是重要的资源：1、氨基酸2、核苷酸类3、维生素（B族维生素、胡萝卜素等）4、酶（高温蛋白酶、中性和碱性蛋白酶、纤 维素酶、淀粉酶、脂肪酶等）真 菌 1、真菌是生产工业酶制剂的主要资源（淀粉酶、蛋白酶、果胶酶、纤维素酶等）2、有机酸（柠檬酸、葡萄糖酸苹果酸、抗坏

2、血酸等）3、核酸及其有关物质4、维生素（核黄素、-胡萝卜素）5、多糖酵 母 菌 1、酵母菌富含肌醇，维生素B1、B2、B6，尼克酸类胡萝卜素等。2、蛋白质与多肽（白地霉的蛋白质含量为菌体量的50%左右，是良好的食品与饲料）3、核酸（酵母菌富含RNA2.67%-10.0%，DNA0.03%-0.516%，因此酵母是核酸工业的原料）开发生物新资源 1、动植物细胞的大规模培养 利用动植物细胞大规模培养产生生物药品是细胞工程技术一大应用领域。 如用植物细胞培养技术产生生物碱、甾类、糖甙、香料、色素、杀虫剂； 如用动物细胞培养生产生物活性分子，如激素、免役淋巴细胞活素、单克隆抗体、各种疫苗。开发生物新资

3、源 2、应用基因重组技术建立“工程菌”或“工程细胞” 将所需要的基因在宿主细胞内表达，制造各种生物活性物质，是生物制药工业的重要发展领域，尤其适合于含量低、活性高的一些微量物质的生产。生物活性物质的存在方式 生物活性物质的存在方式与其生物功能 生物分子间的作用力生物活性物质存在方式与其生物功能 从生物活性物质的生物功能推断其存在部位和分布方式 生物活性物质分为“胞内”与“胞外”两种存在部位。“胞外”物质是由细胞产生，再释放出来的，因此两者没有严格界限。 尿中的尿激酶是由肾细胞产生的；血中的-球蛋白来自-淋巴细胞；而合成酶类，代谢酶类遗传物质和代谢中间产物则存在于胞内,如DNA聚合酶,细胞色素C

4、等。生物活性物质存在方式与其生物功能电子传递系统物质包括黄素蛋白，细胞色素类以及糖类，脂肪酸合成、氧化和氧化磷酸化有关的酶系大部分存在于线粒体中。消化酶虽然可分泌到胞外，但难以从消化道进行收集，只能由相应的腺体提取分离，而且这些酶在细胞内刚合成时常常是以无活性的酶原形式存在，提取时需要预先激活。细胞内的生物活性物质有些游离在胞浆中，有些结合于质膜或器膜上，或存在于细胞器内。因此，对于胞物质的提取要先破碎细胞，对于膜上物质则要选择适当的溶剂使其从膜上溶解下来。生物分子间的作用力生物分子的基本骨架各原子与基团间都是共价结合,整个分子的一级结构稳定.但分子间的连接主要是通过一些非共价键如氢键、金属键

5、、范德华力、疏水力、碱基堆积力所维系，键的性质差别较大，与生物分子的生物功能十分密切。生物分子的分离的原则：u在不损伤分子基本结构前提下，采取不同方 法解离；u分离操作条件温和，确保立体结构不受破坏；生物活性物质的存在特点 生物材料组成的复杂性 生物活性物质存在的特点生物材料组成的复杂性 生物材料中化学组成十分复杂。不同生物含有不同种类的活性物质同种生物，在细胞与细胞之间，组织与组织之间，由于细胞类型、年龄、分化程度的不同，都会改变活性物质的组成。生物活性物质存在的特点1、生物活性物质在生物体材料中含量较低，杂质含量很高，而且生理活性愈高的成分，含量往往愈低胰岛素在胰脏中的含量约为万分之二；脱

6、氧核糖核酸酶含量为十万分之四；胆汁中胆红素含量为万分之5-8。 因此直接从生物材料生产含量极低的生物活性物质没有太大的工业价值。生物活性物质存在的特点2、生物材料中的生化组成数量大，种类多u目的物与杂质的理化性质如溶解度，分子量，等电点等都十分接近，分离、纯化较困难u纯化过程中生物材料中有效成分的生理活性处于不断变化中 可能被材料中自身的代谢酶所破坏，或为微生物所分解，还可能在制备过程中受到酸、碱、盐、重金属离子、机械搅拌、温度等作用而改变其生理活性。 因此，整个操作过程要把防止目的物的失活作用放在首位。生物材料的准备 生物药物的制造主要包括以下工艺过程： 生物材料的选取与预处理； 从生物材料

7、中提取有效活性物质； 有效成分的分离，纯化； 后处理及制剂生物材料的选取选取生物材料时需考虑其来源、价格、目的物含量，杂质的种类，数量和性质等1、有效成分的含量u生物品种 根据目的物的分布，选择富含有效成分的生物品种是选材的关键。 如制备催乳素，不选用禽类，鱼类，微生物，应以哺乳动物为材料。u合适的组织器官 如制备胃蛋白酶只能选用胃为原料；免役球蛋白从血液或富含血液的胎盘组织提取；透明质酸酶由睾丸提取等。u生物的生长期生物的生长期对生理活性物质的含量影响很大。 如凝乳酶只能以哺乳期小牛、仔羊的第四胃为材料，成年牛、羊胃不适用； 提取胸腺素应选用幼年动物胸腺为原料。同时，动物的营养状况，产地、季

8、节对活性物质的含量也有影响。选取生物材料时需考虑其来源、价格、目的物含量，杂质的种类，数量和性质等1、有效成分的含量u生物品种 根据目的物的分布，选择富含有效成分的生物品种是选材的关键。 如制备催乳素，不选用禽类，鱼类，微生物，应以哺乳动物为材料。u合适的组织器官 如制备胃蛋白酶只能选用胃为原料；免役球蛋白从血液或富含血液的胎盘组织提取；透明质酸酶由睾丸提取等。u生物的生长期生物的生长期对生理活性物质的含量影响很大。 如凝乳酶只能以哺乳期小牛、仔羊的第四胃为材料，成年牛、羊胃不适用； 提取胸腺素应选用幼年动物胸腺为原料。同时，动物的营养状况，产地、季节对活性物质的含量也有影响。选取生物材料时需

9、考虑其来源、价格、目的物含量，杂质的种类，数量和性质等1、有效成分的含量生物材料的选取2、杂质情况难于分离的杂质会增加工艺的复杂性，严重影响收率、质量和经济效益。应避免与目的物性质相似的杂质对纯化过程的干扰。如胰脏含有磷酸单脂酶和磷酸二脂酶，两者难于分开，故不选用胰脏为原料制备磷酸单脂酶，而改用前列腺为原料，因它不含磷酸二脂酶，使操作较为简化。2、杂质情况难于分离的杂质会增加工艺的复杂性，严重影响收率、质量和经济效益。应避免与目的物性质相似的杂质对纯化过程的干扰。生物材料的选取3、来源应选用来源丰富的材料，尽量不与其他产品争原料，最好一物多用，即综合利用。如用胰脏生产弹性蛋白酶和激肽释放酶，胰

10、岛素与胰酶等；用人胎盘生产-球蛋白，胎盘脂多糖及胎盘水解物；用人尿生产尿激酶、HCG等生物材料的采集与保存生物活性物质易矢活与降解，因此1、采集时必须保持材料的新鲜。防止腐败、变质与微生物污染 如胰脏采摘后要及时，防止胰岛素活力下降；胆汁不可在空气中久置，以防止胆红素氧化；酶原提取要及时，防止酶原激活转变为酶生物材料的采集与保存2、生物材料的采摘必须快速、及时速冻，低温保存3、选取材料要求完整，尽量不带入无用组织4、符合卫生要求，不可污染生物及其他有害物质生物材料的采集与保存生物材料的保存方法：u速冻u冻干u有机溶剂脱水u制成“丙酮粉”u浸存于丙酮与甘油中生物材料的采集与保存动物细胞的培养与保

11、存动物细胞培养技术是1907年R.G帕拉逊在试管内对蛙的神经组织培养成功后建立的后来陆续成功培养了哺乳动物、昆虫、鱼类等各种动物细胞。利用培养的细胞生产疫苗、干扰素、尿激酶、促红细胞生成素和单克隆抗体等已进入工业化生产动物细胞的培养与保存动物细胞制药:由于动物细胞培养（animal cell culture)在规模和可靠性方面都不断发展，而且从中得到的蛋白质也被证明是安全有效的，因此人们对动物细胞培养的态度已经发生了改变。实际上，对于一些人用和兽用的重要蛋白质药物，尤其是那些相对较大、较复杂或糖基化（glycosylated)的蛋白质来说，动物细胞培养是首选的生产方式。动物细胞的培养与保存动物

12、细胞的生长培养液：u平衡盐溶液u天然培养基u合成培养液动物细胞的培养与保存u平衡盐溶液1、具有维持渗透压，控制酸碱平衡作用2、供给细胞生存所需要的能量和离子3、是配置各种培养基的基础溶液 常用的有Hanks平衡盐溶液 及Earle平衡盐溶液动物细胞的培养与保存u天然培养基1、有血浆、鼠尾胶原、鸡胚浸出液、血清等；2、该培养基营养成分高，成分复杂，来源受限制动物细胞的培养与保存u合成培养基 是根据天然培养基的成分，用化学物质模拟配方组成1、如199培养液，Eagle培养液，DMEM培养液，F12培养液，RPM1640等；2、只能维持动物细胞的生存；3、要使细胞繁殖，还要补充适量天然培养基，常用的

13、是人血清或牛血清，尤其是同源血清效果更好；动物细胞的培养与保存u合成培养基 是根据天然培养基的成分，用化学物质模拟配方组成4、血清对细胞附着和保护有明显作用，且能中和毒物，使细胞不受损害；5、但血清中含有600多种蛋白质，给产物分离、纯化增加了困难，也提高了成本，因此目前正在转向使用人工无血清培养基用于制药的动物细胞1、由动物细胞表达和合成的蛋白质具有正确的氨基酸序列；2、在加工过程中还能以正确的方式进行折叠和修饰，且大多数能以天然形式分泌到培养基中，从而确保了所生产的蛋白质具有与天然产物一致的生物活性、免疫原性和体内寿命；3、这些特点使得动物细胞成为表达和生产基因工程抗体、蛋白质疫苗和治疗药

14、物等生物产品的理想宿主。用于制药的动物细胞常用的细胞系包括CHO（Chinese hamster ovary)，MRC-5人淋巴母细胞，BHK，鼠杂交瘤细胞（hybridoma cell)系，重组NS0，SP2/0，FRhl-2，BIRMA-1细胞系，BL-2细胞，ES-15ES-4细胞系，MS201细胞系等。动物细胞的大规模培养大规模哺乳动物细胞培养（animal cell culture）的主要障碍： 供氧限制 副产物积累 更加智能化的过程控制 动物细胞对机械剪切力的极度敏感 培养贴壁细胞系动物细胞的大规模培养u由于贴壁型细胞系放大存在困难，所以许多产品现在使用悬浮培养细胞系，包括悬浮适应

15、的CHO细胞系或鼠骨髓瘤细胞。u通过恰当的反应器设计或加入保护剂如Pluromic F68，可将搅拌和通气造成的机械剪切损伤减至最小悬 浮 培 养动物细胞的大规模培养u由于贴壁型细胞系放大存在困难，所以许多产品现在使用悬浮培养细胞系，包括悬浮适应的CHO细胞系或鼠骨髓瘤细胞。u通过恰当的反应器设计或加入保护剂如Pluromic F68，可将搅拌和通气造成的机械剪切损伤减至最小悬 浮 培 养动物细胞的大规模培养u可以通过设计更加智能化的灌流补 料系统（不断除去代谢废物），或 使用Lonza设计的谷氨酰胺合成酶表 达系统（降低了代谢废物的形成）， 来减少代谢副产物的积累。悬 浮 培 养动物细胞的大

16、规模培养贴 壁 培 养贴壁培养在工业放大上存在其特有的问题：因为贴壁细胞有贴壁需求，为了得到最大的细胞密度，反应器的比表面积就需要最大化。培养方式的选择 究竟选择何种培养方式进行放大生产，要以产品和市场为导向进行选择。当然，悬浮培养具有易放大的特点，可以按照1：5的放大速率是迅速达到10000L的规模，设备具有一定的通用性：但贴壁培养更容易达到高密度培养。动物细胞的大规模培养培养方式的选择 有的产品如凝血因子在培养液中极不稳定，只能采用灌流培养方式进行生产； 而有的产品，如抗体，相对较为稳定，就可以采取批式培养。对于市场就可以满足要求，如Amgen的thEPO动物细胞的大规模培养 在选择培养方

17、式之前，除了考察目的产物的性质之外，宿主细胞的特性也是决定性的因素之一。CHO细胞也可经过有目的的驯化，改变原来贴壁、依赖血清的生长特性，可以在无蛋白培养基中进行悬浮培养而不改变目的产物的单细胞产率。培养方式的选择动物细胞的大规模培养发酵过程的控制 动物细胞大规模培养的影响因素很多，除了搅拌、溶氧、pH、温度等因素的影响之外，如何控制细胞的代谢，减少有害废物如乳酸及氨在发酵液中的积累，成为动物细胞发 酵专家的课题。动物细胞的大规模培养化学限定培养基的开发 开发无血清培养基的主要目的是用成分明确的新材料来替代不确定的血清成分，而又能保留血清的基本功能。但是，许多血清替代物仍面临与血清同样的问题。

18、动物细胞的大规模培养动物细胞的保存保 存 方 法v组织块保存法v组织悬浮保存法v单层细胞保存法v低温冷冻保存组织块保存法如人胚胎肾块在40C可保存2周，具体方法是取出新生胎儿肾脏剪成小块，洗涤后加生长培养液，于40C过夜，换液一次，可置冰箱保存。动物细胞的保存组织悬浮保存法如用胰蛋白酶分散的新鲜猴肾细胞悬浮液，40C保存1024小时后，离心收集细胞，用新鲜生长培养液再悬浮，于40C至少可保存3周。动物细胞的保存单层细胞保存法本法是通过降低温度来延长细胞的正常代谢时间。如人羊膜细胞280C可保存1个月，人二倍体细胞300C可保存2周，中间换液可保存1个月。动物细胞的保存低温冰冻保存法将细胞冻存于

19、700C低温冰箱中或液氮中，再低温冰箱中可冻存1年以上 ， 在 液 氮 中 可 长 期 保 存 。v细胞冻存速度v保存剂v冻结方法v冻存细胞的复苏动物细胞的保存低温冰冻保存法微生物菌种的选育与保存1、菌种的分离微生物种类繁多，易于培养，是工业化生产各种生物药物的主要材料。v含菌样品的收集v富集培养v菌种的纯化微生物菌种的选育与保存1、菌种的分离微生物菌种的选育与保存含菌样品的收集根据微生物的生态特点，从自然界取样，分离所需菌种。v如到堆积和腐烂纤维素的地方取样分离纤维素酶产生菌；v到温泉附近取样分离高温蛋白酶产生菌；微生物菌种的选育与保存富集培养收集到的样品若含所需要的菌较多，可直接分离；若含

20、所需要的菌很少，就需要进行富集培养。v通过富集培养，使所需的菌大量生长，以利筛选；v同时控制温度，pH或营养成分即可；微生物菌种的选育与保存菌种纯化在自然条件下，各种类型的菌混杂在一起生活，需要进行分离，以获得的纯种。v稀释分离法；v划线分离法；微生物菌种的选育与保存2、菌种的筛选v筛选对象的选择v培养方式的确定微生物菌种的选育与保存筛选对象的选择筛选前，先要考虑哪些微生物是筛选的对象。v如有报道，则可根据文献收集可能性最大的微生物进行筛选；v如无报道，则可根据一般常识，以不同的种属代表，先进行广泛比较。微生物菌种的选育与保存培养方式的确定v固体培养 常用麸皮、稻末、米糠等农副产品作为营养源，

21、加少量水，制成固体培养基，接种猴在适合的温度下培养，使菌生长，并形成所需的活性物质。v液体培养 用三角瓶装适量的液体培养基，接种后，在摇床上震荡培养一定时间。此条件与发酵罐相似，筛出的菌种适合于发酵罐扩大培养。微生物菌种的选育与保存随机选择法一般程序： 采用诱变剂诱变处理微生物，增殖培养，经过稀释涂布，随机选择部分或全部单菌落，逐个测定他们的生物活性，最后挑出产量或其他性能比亲代菌株优秀的突变株。v常用的诱变剂有碱基类似物 5-溴尿嘧啶，5-溴脱氧尿苷，羟氨，亚硝酸，烷化剂，紫外线照射，电离辐射。微生物菌种的选育与保存一般从两方面考虑：v根据环境因素考虑添加诱导物核降低阻遏物浓度；v从遗传学角

22、度考虑将生产菌种诱发突变成为组成型和增加基因拷贝的途径来达到分离高产菌株的目的根据代谢的调节机理选择高产突变株微生物菌种的选育与保存3、菌种的选育无论抗生素、氨基酸、核苷酸或酶制剂的发酵生产，从自然界直接分离菌种，都不能立即适应实际生产需要。只有通过诱变，选育才能使产量成倍，成百倍地提高。v随机选择法v根据代谢的调节机理选择高产突变株。微生物菌种的选育与保存4、菌种的保藏v菌种的退化和防止 退化随时间的推移菌种的一个或多个特性逐步减退或消失，最终导致营养细胞的死亡，一般把菌株的生活力，产孢子能力的衰退和特殊产物产量的下降统称为退化。菌种退化现象的综合比较鉴别：v单位容积中发酵液的活性物质含量；

23、v琼脂平皿上的单菌落形态；v不同培养时期菌体细胞的形态和主要遗传特征；v发酵过程的pH变动情况；v发酵液的气味、色泽微生物菌种的选育与保存菌种退化的防止v防止基因突变基因突变是菌种退化的一个重要原因，减少突变是防止退化的重要措施，应用低温保藏法可以减少突变的发生微生物菌种的选育与保存菌种退化的防止v采用双重缺陷型利用营养缺陷型作为生产菌株时，回复突变可导致产量下降，采用双重缺陷标志可间接而有效地防止突变微生物菌种的选育与保存菌种退化的防止v制定科学管理制度使用菌种时大批制作平行的菌种斜面，少转接传代微生物菌种的选育与保存菌种退化的防止v分离单菌落在建立新菌株和使用过程中认真进行单菌落分离，再多

24、制作平行的菌种斜面微生物菌种的选育与保存菌种退化的防止v选择培养条件选择有利高产菌株（或其他有利性状）而不利于低产菌株（或其他不利性状）的培养条件微生物菌种的选育与保存常用的菌种保藏方法保藏方法的原则：v使菌种不死亡v使菌种的原有特性不变斜面保存法矿油法冷冻干燥法组织与细胞的破碎2、化学法用稀酸、稀碱、浓盐、有机溶剂或表面活性剂（如胆酸盐、氯化十二烷基吡啶）处理细胞，可破坏细胞结构释放出内容物组织与细胞的破碎3、生物法v组织自溶法 利用组织中自身酶的作用改变、破坏细胞结构，释放出目的物称为自溶。自溶过程酶原被激活为酶既便于提取又提高了效率，但不适用于易受酶降解的目的物的提取组织与细胞的破碎3、

25、生物法v酶解法用外来酶处理生物材料如用溶菌酶处理某些细菌；用胰酶处理猪脑生产脑安泰；用作专一性分解的酶还有：细菌蛋白酶、纤维素酶、蜗牛酶、酯酶等组织与细胞的破碎3、生物法v噬菌体法 用噬菌体感染细菌、裂解细胞，释放出内容物组织与细胞的破碎1、物理方法v磨切法v压力法压榨、高压、减压v震荡法超声波震荡破碎细的菌细胞，频率 10200kHz，该法产热较多，注意冷却细胞器的分离为获得结合在细胞器上的一些生化成分或酶系，常常要先得到特定的细胞器再进一步分离有效成分，所得细胞器的含量和纯度可用电镜观察。匀浆破碎细胞离心分离细胞器的分离差速离心分离各种细胞器匀浆700g10 分0.34mol/L蔗糖上清沉

26、淀（细胞核、膜碎片）8500g10 分8500g10 分上清沉淀（线粒体、溶酶体）上清（细胞质可溶性成分）沉淀（微粒体）第 二节 生物活性物质的提取 提取 是利用制备目的物的溶解特性，将目的物与细胞的固形成分或其他结合成分分离，使其由固相转入液相或从细胞内的生理状态转入特定溶液环境的过程。一、物质的性质与提取浸渍用冷溶剂溶出固体材料中的物质浸煮用热溶剂溶出目的物液-液提取将目的物从某一溶剂系统转 入另一溶剂系统提取的分类物质的性质与提取方法的选择要取得好的提取效果，最重要的是要针对生物材料和目的物的性质选择合适的溶剂系统与提取条件。溶解性质、分子量、等电点、存在方式、稳定性、比重、粒度、粘度、

27、目的物含量，主要杂志种类及溶解性质，有关酶类的特征等。 其中，最主要的是目的物与主要杂质在溶解度方面的差异以及它们的稳定性生物材料及其目的物与提取有关的一些性状：物质的性质与提取方法的选择v对酶类药物提取要防止辅酶的丢失和其他失活因素的干扰；v对蛋白质类药物要防止其高级结构的破坏，即变性作用，应避免高热，强烈搅拌，大量泡沫，强酸、碱及重金属离子的作用；v多肽类及核酸类药物需注意避免酶的降解作用，提取过程应在低温并添加某些酶抑制剂；v对脂类药物应特别注意防止氧化，减少与空气的接触，如添加抗氧化剂，通氮气及避光等。提取过程中的一些注意事项：活性物质的保护措施v采用缓冲系统 防止提取过程重某些酸碱基

28、团的解离导致溶液pH值的大幅度变化，使某些活性物质变性失活或因pH变化影响提取效果对于一些生物大分子，如蛋白质、酶及核酸类药物常采用下列保护措施：磷酸盐缓冲液，柠檬酸缓冲液，Tris缓冲液，醋酸缓冲液，硼酸缓冲液等活性物质的保护措施v添加保护剂 防止某些生理活性物质的活性基团及酶的活性中心受破坏。对于一些生物大分子，如蛋白质、酶及核酸类药物常采用下列保护措施：如巯基是许多活性蛋白质和酶的催化活性基团，极易被氧化，故提取时，常添加某些还原剂，如半胱氨酸，-巯基乙醇，还原型谷胱甘肽等。提取某些酶时常加入适量底物以保护活性中心活性物质的保护措施v抑制水解酶的作用 抑制水解酶对目的物的作用是提取操作中

29、的最重要保护性措施之一，可根据不同水解酶的性质采用不同方法。对于一些生物大分子，如蛋白质、酶及核酸类药物常采用下列保护措施：如需要金属离子激活的水解酶（如DNAse）常加入EDTA或用柠檬酸缓冲液，以降低或除去金属离子使酶活力受到抑制。二、物质的性质与溶解度 是固相分子间的相互作用及固-液两相分子间两种作用力综合平衡的结果，前者是“阻力”后者是“助力”。溶解度溶剂的选择原则是减少“阻力”，增加“助力”。即最大限度地削弱生物分子间的作用力，尽可能地增加目的分子与溶剂分子间的相互作用力物质溶解度的一般规律其涵义是相似物溶解于相似物v溶质与溶剂分子结构上的相似；v溶剂与溶质分子间的作用力相似。“相似

30、相溶”原则水在生化物质提取中的作用v水是高度极化的极性分子，具有很高的介电常数；v在水溶液中，水分子自身形成氢键的趋势很强，有极高的分子内聚力；v水分的存在可使其他生物分子间的氢键减弱，而与水分子形成氢键；水是提取生化物质的常用溶剂v水合作用水分子使溶质分子的离子键解离，可促使蛋白质、核酸、多糖等生物大分子与水形成了水合分子或水合离子从而促使它们溶解于水或水溶液中。三、提取效率 无论采用什麽巧妙的提取方法，在生物材料中总要残留部分目的物，残留量的多少取决于所选择的溶剂系统的种类、用量、提取次数以及操作条件。四、影响提取的因素 1、温度多数物质的溶解度随提取温度的升高而增加，而且较高的温度可以降

31、低物料的粘度，有利于分子扩散和机械搅拌。应用有机溶剂提取生化成分时，一般在较低的温度下进行提取，一方面是为了减少溶剂挥发损失和生产安全；另一方面是为了减少活力损失。三、提取效率 残留量公式：Xn=X0KW/(KW+L)X0 目的物的总量，gK目的物 的固相/液相的分配系数L溶剂体积，mLW生物材料重量，gn提取次数2、酸 碱 度多数生化物质在中性条件下甲稳定，所以提取用的溶剂系统原则上应避免过酸或过碱，pH值一般应控制在49范围内。为了避免目的物的溶解度，往往要避免在目的物的等电点附近进行提取。3、盐 浓 度盐离子存在能减弱生物分子间离子键及氢键的作用力，稀盐溶液对蛋白质等生物大分子有助溶作用

32、，这是由于盐离子作用于生物大分子表面，增加了表面电荷，使之极性增加，水合作用增强，促使形成稳定的双电层，此现象称为“盐溶”。氯化钠溶液，磷酸盐缓冲液，焦磷酸钠缓冲液，醋酸缓冲液，柠檬酸缓冲液。五、提取方法 1、用酸、碱、盐水溶液提取用酸、碱、盐水溶液可以提取各种水溶性、盐溶性的生化物质。这类溶剂提供了一定的离子强度，pH值及相当的缓冲能力。提 取 方 法2、用表面活性剂提取表面活性剂分子兼有亲水和疏水基团，在分布于水-油界面时有分散、乳化和增溶作用。表面活性剂又称“去垢剂”。表面活性剂可分为阴离子型，阳离子型，中性与非离子型去垢剂。离子型表面活性剂作用强，但易引起蛋白质等生物大分子的变性，非离

33、子表面活性剂变性作用小，适合于用水，盐系统无法提取的蛋白质活酶的提取。提 取 方 法3、有机溶剂提取用有机溶剂提取生化物质可分为：v固-液提取v液-液提取（萃取）提 取 方 法3、有机溶剂提取v固-液提取 常用于水不溶性的脂类、脂蛋白、膜蛋白结合酶等常用的有机溶剂有：甲醇乙醇、丙酮、丁醇等极性溶剂以及乙醚、氯仿、苯等非极性溶剂。选用有机溶剂的原则：相似相溶提 取 方 法3、有机溶剂提取v液-液萃取 是利用溶质在两个互不混溶的溶剂中溶解度的差异将溶质从一个溶剂相向另一个溶剂相转移的操作。影响液-液萃取的因素主要有：目的物在两相的分配比（分配系数K）有机溶剂用量提 取 方 法3、有机溶剂提取液-液

34、萃取时溶剂的选择要注意以下几点：选用溶剂必须具有较高选择性，各种溶质在所选的溶剂中之分配系数差异越大越好；在萃取后，溶质与溶剂要容易分离与回收；两种溶剂的密度相差不大时，易形成乳化，不利于萃取液的分离；要选用无毒，不易燃烧的价廉易得的溶剂第 三节 生物活性物质的浓缩与干燥一、生物活性物质的浓缩v蒸发蒸发v减压浓缩减压浓缩v盐析浓缩盐析浓缩v有机溶剂沉淀浓缩有机溶剂沉淀浓缩v用葡聚糖凝胶（用葡聚糖凝胶（Sephadex）浓缩）浓缩v用聚乙二醇浓缩用聚乙二醇浓缩v超滤浓缩超滤浓缩v真空减压浓缩与薄膜浓缩真空减压浓缩与薄膜浓缩生物活性物质的浓缩2、有机溶剂沉淀浓缩在生物大分子的水溶液中，逐渐加入乙醇

35、，丙酮等有机溶剂，可以使生物物质的溶解明显降低，从溶液中沉淀出来，这也是浓缩样品的常用方法。其优点：溶剂易于回收，样品不必透析除盐在低温操作下，对多种生物大分子较为稳定生物活性物质的浓缩3、用葡聚糖凝胶(Sephadex）浓缩向1L左右的稀样品溶液中，加入固体的干葡聚糖凝胶G-25，缓慢搅拌30分钟，葡聚糖凝胶吸水膨胀，进行吸滤，生物大分子全部留在溶液中，如此重复数次，可在短时间内使溶液浓缩到100mL。生物活性物质的浓缩1、盐析浓缩用添加中性盐的方法来使某些蛋白质（或酶）从稀溶液中沉淀出来，从而达到样品浓缩目的。蛋白质在水溶液中的溶解度是由蛋白质周围亲水基团与水形成水化膜的程度，以及蛋白质分

36、子带有电荷的情况决定的。当用中性盐加入蛋白质溶液，中性盐对水分子的亲和力大于蛋白质，于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失。同时，中性盐加入蛋白质溶液后，由于离子强度发生改变，蛋白质表面电荷大量被中和，更加导致蛋白溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀。常用的中性盐有：硫酸铵，硫酸钠，硫酸镁，硫酸钾生物活性物质的浓缩4、用聚乙二醇浓缩将待浓缩液放入透析袋，袋外敷以聚乙二醇，袋内的水分很快被袋外的聚乙二醇所吸收，在极短的时间内，可以浓缩几十倍至上百倍。生物活性物质的浓缩5、超滤浓缩应用不同型号超滤膜浓缩不同分子量的生物大分子。超滤浓缩有：固定末端式系统，搅拌式系统，管状流动式系统，细管流式系统

37、生物活性物质的浓缩6、真空减压浓缩与薄膜浓缩v真空减压浓缩在生物药物生产中使用较为普遍，具有生产规模较大，蒸发温度较低，蒸发速度较快等优点。浓缩目的：除去挥发性溶剂，保持物料的 生物活性。二、生物活性物质的干燥干燥是使物质从固体或半固体状经除去存在的水分内或它种溶剂，从而获得干燥物品的过程。干燥的目的：提高药物或药剂的稳定性，以利保存与运输；使药物或药剂有一定的规格标准；便于进一步处理生物活性物质的干燥水分在干燥的物料中，有三种存在形式v表面水v毛细管中的水v细胞内的水水分在固体物料中的存在形式可能是单一的，也可能是多样的。因此，干燥应缓慢进行，使各种形式的水能被逐步去除。生物活性物质的干燥常

38、用的干燥法有：v减压干燥v喷雾干燥v冷冻干燥第 四节 生物物质的分离纯化方法一、生物制药中分离、制备方法的特点二、生物制药中分离制备方法的基本原理三、分离纯化的基本程序和实验设计四、分离纯化方法步骤优劣的综合评价五、制备物均一性的鉴定一、生物制药中分离、制备方法的特点生化分离技术包括：v生化分离分析v生化制备v生化分离分析主要对生物体内各组分加以分离后进行定性、定量鉴定，它不一定要把某组分从混合物中分离提取出来；v生化制备主要是为了获得生物体内某一单纯组分。生物制药中分离、制备方法的特点生化制药中分离、制备方法有下列特点：1、生物材料组成非常复杂；一种生物材料常含有成千上万中成分，各种化合物的

39、形状、大小、分子量和理化性质都各不相同；不少化合物迄今未知；生物活性物质在分离进程中仍处于不断代谢变化中，因此，常无固定操作方法。生物制药中分离、制备方法的特点4、生物制药中的分离方法几乎都在溶液中进行，各种参数（温度、pH、离子强度等）对溶液中各种组分的综合影响常无法固定，以致许多实验设计理论性不强。很多实验结果常带有很大的经验成分，因此，要使实验获得重复，从材料、方法、条件及试剂药品等都必须严格地加以规定。生物制药中分离、制备方法的特点2、有些化合物在生物材料中含量极微，因此分离操作步骤多，不易获得高收率；3、生物活性成分离开生物体后，易变性，破坏，分离进程必须十分小心地保护这些化合物的生

40、理活性，这也是生物制药中分离、制备的难点；生物制药中分离、制备方法的特点6、生物产品最后均一性的证明与化学上纯度的概念不完全相同因生物分子对环境反应十分敏感，结构与功能关系比较复杂，故对其均一性的评估常常是有条件的，或者只能通过不同角度测定，最后才能给出相对“均一性”的结论。二、生物制药中分离制备方法的基本原理生化制药中的分离制备技术大都根据混合物中不同组分分配率的差别，把他们分配于可用机械方法分离的两个或几个物相中（如有机溶剂抽提、盐析、结晶等）。或者将混合物置于某一物相（大多数是液相）中，外加一定作用力，使多组分分配于不同区域，从而达到分离目的（如电泳、超离心、超滤等）生物制药中分离、制备

41、方法的特点5、为了保护目的物的生理活性及结构上的完整性，生物制药中分离方法多采用温和的“多阶式”方法进行，即“逐级分离”为了纯化一种生化物质常常要联用几个，甚至十几个步骤，并不断变换各种不同类型的分离方法，才能达到目的。二、生物制药中分离制备方法的基本原理生物大分子分离纯化的主要原理：1、根据分子形状和大小不同进行分离。如差速离心，超速离心，膜分离（透析，电渗析）与超滤法，凝胶过滤法；2、根据分子电离性质（带电性）的差异进行分离。如离子交换法，电泳法，等电聚焦法；二、生物制药中分离制备方法的基本原理3、根据分子极性大小及溶解度不同进行分离。如溶剂提取法，逆流分配法，分配层析法，盐析法，等电点沉

42、淀法；4、根据物质吸附性质的不同进行分离。如选择性吸附与吸附层析法；5、根据配体特异性进行分离亲和层析法。三、分离纯化的基本程序和实验设计对于生物体内某一组分，特别是未知结构的组分的分离制备设计大致可分为五个基本阶段：v确定制备物的研究目的及建立相应的分析鉴定方法；v制备物的理化性质稳定性的预备实验；v材料处理及抽体方法的选择；v分离纯化方法的摸索；v产品的均一性测定。三、分离纯化的基本程序和实验设计分离纯化是生化制备的核心操作。由于生化物质种类成千上万，因此分离纯化的实验方案也千变万化，没有一种分离纯化方法可适用于所有物质的分离纯化，同时一种物质也不可能只有一种分离纯化方法。三、分离纯化的基

43、本程序和实验设计1、分离纯化早期使用方法的选择选择原则是： 从低分辨能力到高分辨能力，而且负荷量较大者为合适。三、分离纯化的基本程序和实验设计2、各种分离纯化方法的使用程序v生化物质的分离都是在液相中进行，故分离方法主要根据物质的分配系数，分子量大小，离子电荷性质及数量和外加环境条件的差别等因素为基础；v安排纯化顺序时，还要考虑有利于减少工序，提高效率；v对于一未知物通过各种方法的交叉应用，有助于进一步了解目的物的性质。三、分离纯化的基本程序和实验设计3、分离后期的保护性措施v必需注意避免产品的损失；v为了取得足够量的样品，需要加大原材料的用量。五、制备物均一性的鉴定均一性： 是指所获得的制备

44、物只具有一种完全相同的成分。v均一性的评价常须经过数种方法的验证才能肯定。v生物分子纯度鉴定方法很多，常用的有：溶解度法，化学组成分析法，电泳法，免疫学方法，离心沉降分析法，各种色谱法，生物功能测定法，以及质谱法等四、分离纯化方法步骤优劣的综合评价v分辨能力v重现性v方法本身回收率v对每一步骤方法的优劣记录，体现在所得产品重量及活性平衡关系上第 五节 生物制药中试放大工艺设计一、生物制药中试放大工艺特点二、中试放大方法与内容一、生物制药中试放大工艺特点v收率稳定，质量可靠；v操作条件已经确定；产品，中间体及原料的分析方法已经制定；v生物材料的资源（包括菌种，细胞株等）已确定并已系统鉴定；v进行

45、过物料平衡，“三废”问题已有初步的处理方法；v提出中试规模及所需材料的规格和数量；v提出安全生产的要求一、生物制药中试放大工艺特点在考察工艺条件的研究阶段中，必须注意和解决下列问题：v原辅材料规格的过渡试验v设备选型与材料质量试验v反应条件限度试验v原辅材料，中间体及产品质量分析方法研究v下游工艺的研究二、中试放大方法与内容中试放大方法：v经验放大法v相似放大法v数学模型放大法v经验放大法主要是借经验通过逐级放大（实验装置，中间装置，中型装置和大型装置）来摸索反应器的特征。 制药工艺研究中试放大主要采用经验放大法，这是化工科研中采用的主要方法。二、中试放大方法与内容中试放大的研究内容主要有：v

46、工艺路线与各步反应方法的最后确定v设备材质与型号的选择v反应器的规模选择及反应器搅拌器型式与搅拌速度的考察v生产反应条件的研究v工艺流程与操作方法的确定二、中试放大方法与内容中试放大的研究内容主要有：v物料衡算v安全生产与“三废”防治措施研究v原辅材料，中间体的物理性质和化工常数的测定v原辅材料，中间体质量标准的制定v消耗定额，原料成本，操作工时与生产周期等的计算第 六节 生物制药工艺技术的发展一、生物制药工艺的发展二、生物药物制剂工艺的发展生物制药工艺的发展一、生物药物类型与品种的发展v生化药物1、治疗酶与诊断用酶u超氧化物歧化酶（SOD）猪、牛、马SOD已投放市场u凝血酶由人、牛、猪血或兔脑提取分离，也可由酵母、细菌产生uL-天冬酰胺酶由大肠杆菌，粘质赛氏杆菌产生u尿激酶由人尿提取