王镜岩生物化学（上）课件014酶通论动力学

1、酶 通 论1一、酶的研究历史1897年，Buchner兄弟用不含细胞的酵母汁成功实现了发酵。提出了发酵与活细胞无关，而与细胞液中的酶有关。21913年，Michaelis和Menten提出了酶促动力学原理-米氏学说。31926年，Sumner从刀豆种子中别离、纯化得到了脲酶结晶，首次证明酶是具有催化活性的蛋白质。41982年，Cech对四膜虫的研究中发现RNA具有催化作用。5二、 酶Enzyme的概念绝大多数的酶都是蛋白质。酶催化的生物化学反响，称为酶促反响Enzymatic reaction。在酶的催化下发生化学变化的物质，称为底物substrate。酶是一类具有高效率、高度专一性、活性可调

2、节的生物催化剂Biocatalysts 。6用量少、催化效率高；改变化学反响速度，不改变化学反响平衡。酶本身在反响前后无变化。稳定底物形成的过渡状态，降低反响的活化能，从而加速反响的进行。三、酶催化作用的特点1、酶和一般催化剂的共性：7例如：过氧化氢的分解 无催化剂时： 无机催化剂胶态钯存在时： 过氧化氢酶存在时： 又如：蔗糖水解 无催化剂存在时：Ea=1338kj/mol 酸催化时：Ea=105kj/mol 蔗糖酶催化时：Ea=39kj/mol活化能：在一定的温度下，1 mol 分子全部进入活化态所需要的自由能。8催化剂改变了化学反响的途径，使反响通过一条活化能比原途径低的途径进行。92、酶

3、作为生物催化剂的特性1酶易失活凡能使蛋白质变性的因素如强酸、强碱高温等条件都能使酶破坏而完全失去活性。酶促反响一般在pH 5-8 水溶液中进行，反响温度范围为20-40C。10酶的催化作用可使反响速度提高10 101倍。 -淀粉酶催化淀粉水解，1克结晶酶在65C条件下可催化2吨淀粉水解。2高效性酶具有极高的催化效率转换数turnover number, TN：每秒钟每个/ mol 酶分子能催化底物发生变化的分子数 / mol ，表示酶的最大催化效率。等于催化常数kcat。11又称为特异性，是指酶在催化生化反响时对底物的选择性。 例如：蛋白酶催化蛋白质的水解；淀粉酶催化淀粉的水解；核酸酶催化核酸

4、的水解。3酶具有高度专一性 Specificity124酶活性受到调节和控制a.调节酶的浓度 诱导或抑制酶的合成或调节酶的降解：乳糖操纵子b.通过激素调节酶的活性 乳糖合成酶=催化亚基+调节亚基 -乳清蛋白)调节亚基：-乳清蛋白的合成受乳腺激素的调节 乳糖、IPTG 阻遏物 13d.抑制剂和激活剂对酶活性的调节 大分子：胰蛋白酶抑制剂 小分子：2，3二磷酸甘油酸c. 反响抑制调节酶活性如：苏氨酸生物合成为异亮氨酸 第一步反响：苏氨酸脱氨酶e.其他调节方式 别构调控、酶原激活、酶的可逆共价修饰和同工酶14四、酶的化学本质及其组成1、酶的化学本质绝大多数酶是蛋白质1酸碱水解、酶水解2变性3两性电解

5、质4胶体性质5蛋白质的颜色反响少数酶是RNA核酶151单纯酶类(simple enzyme)：仅由蛋白质组成 脲酶、溶菌酶、淀粉酶、脂肪酶、核糖核酸酶等2缀合酶类conjugated enzyme):全酶holoenzyme)=脱辅基酶 + 辅因子(cofactor)2、酶的化学组成据酶蛋白的化学组成分类酶的辅助因子主要有金属离子和有机化合物16辅酶(coenzyme)： 与酶蛋白结合较松，可透析除去。辅基(prosthetic group)： 与酶蛋白结合较紧，不能用透析法除去。酶蛋白决定酶专一性，辅助因子决定酶促反响的类型和反响的性质。171 单体酶牛胰RNase 124aa 单链鸡卵清溶

6、菌酶 129aa 单链胰凝乳蛋白酶 三条肽链由一条或多条共价相连的肽链组成的酶分子3、单体酶、寡聚酶、多酶复合体据酶蛋白分子特点分类182 寡聚酶a. 含相同亚基的寡聚酶： 苹果酸脱氢酶鼠肝，2个相同的亚基 种类较少，多催化水解反响 b. 含不同亚基的寡聚酶： 琥珀酸脱氢酶牛心，2个亚基 相当数量的寡聚酶是调节酶。大多数寡聚酶是胞内酶，而胞外酶一般是单体酶。193) 多酶复合体由两个或两个以上的酶，靠非共价键结合而成，每个酶催化一个反响，构成一个代谢途径或代谢途径的一局部。大肠杆菌丙酮酸脱氢酶复合体由三种酶组成：丙酮酸脱氢酶E1 以二聚体存在 29600二氢硫辛酸转乙酰基酶E2 70000二氢

7、硫辛酸脱氢酶E3 以二聚体存在 256000 12个E1 二聚体 2496000 24个E2 单体 2470000 6个E3 二聚体 1256000 总分子量：4600 103201、 习惯命名4) 有时加上酶的来源 胃蛋白酶、牛胰凝乳蛋白酶1依据底物命名绝大多数酶： 蛋白酶、淀粉酶2) 依据催化反响的性质命名： 水解酶、转氨酶3) 结合上述两个原那么命名：琥珀酸脱氢酶。五、酶的命名和分类21根本原那么：明确标明酶的底物及催化反响的性质底物为水时可略去不写。2、国际系统命名法国际酶学委员会年提出系统名称包括底物名称、构型、反响性质，最后加“酶。例如：习惯名称:谷丙转氨酶系统名称:丙氨酸：-酮戊

8、二酸氨基转移酶催化的反响: -酮戊二酸 + 丙氨酸谷氨酸 + 丙酮酸 223、 国际系统分类法及酶的编号EC编号1按反响性质分六大类2根据底物中被作用的基团或键的特点分亚类3每个亚类又可分为假设干个亚亚类乙醇脱氢酶 EC1.1.1.1 乳酸脱氢酶 EC1.1.1.27 苹果酸脱氢酶 EC1.1.1.37第一个1(类)： 氧化复原第二个1 (亚类) ：醇基第三个1 (亚亚类) ：NAD+或NADP+1；27；37 (亚亚类中的编号) ：乙醇，乳酸，苹果酸。 氧、转、水、裂、异、连231氧化复原酶类(Oxido-reductases)4、 六大类酶的特征和举例HH主要包括氧化酶(Oxidase)和

9、脱氢酶(dehydrogenase)A.2H +O2=A + H2 O22A.2H +O2=2A + 2H2 O242 转移酶类(Transferases)A.X + B=A + B.X253 水解酶类(hydrolases)多为胞外酶，在生物体内分布最广，数量最多A-B + HOH=A OH + BH脂肪酶(Lipase)催化的脂的水解反响264 裂合酶类裂解酶Lyase催化从底物上移去一个基团而形成双键的反响或其逆反响。A-B=A + B275 异构酶EC5.3.1.9(Isomerases)催化同分异构体相互转化，即分子内部基团的重新排列A=B6-磷酸葡萄糖异构酶催化的反响286 合成酶

10、连接酶 Ligases or Synthetases催化一切必须与ATP分解相偶联、并由两种物质合成一种物质的反响。 A + B + ATP=A-B + ADP + Pi29国际分类的盲区：忽略了酶的物种差异和组织差异2O2-+2H+H2O2+O2 三类不同的SOD 只有一个名称和编号：Cu Zn-SOD 真核生物细胞质中Mn-SOD 真核生物线粒体中同是Cu Zn-SOD，来自牛红细胞与猪红细胞的，其一级结构也有很大不同。在讨论一个具体的酶时，应对它的来源与名称一并加以说明30酶的专一性31 一、结构专一性1、绝对专一性Absolute specificity)有些酶对底物的要求非常严格，只

11、作用于一个特定的底物。例如：脲酶、麦芽糖酶、淀粉酶、碳酸酐酶等。32作用一类结构相近的底物。2、相对专一性(Relative Specificity)族(group)专一性对键两端的基团要求的程度不同，只对其中一个基团要求严格。如-葡萄糖苷酶，催化由-葡萄糖所构成的糖苷水解，但对于糖苷的另一端没有严格要求。胰蛋白酶，水解硷性氨基酸的羧基形成的肽键。键(Bond)专一性。如酯酶催化酯的水解，对于酯两端的基团没有严格的要求。331、旋光异构专一性酶的一个重要特性是能专一性地与手性底物结合并催化这类底物发生反响。即当底物具有旋光异构体时，酶只能作用于其中的一种。例如，淀粉酶只能选择性地水解D葡萄糖形

12、成的1，4糖苷键；L-氨基酸氧化酶只能催化L-氨基酸氧化；乳酸脱氢酶只对L-乳酸是专一的。 二、立体异构专一性34、几何异构专一性geometrical specificity有些酶只能选择性催化某种几何异构体底物的反响，而对另一种构型那么无催化作用。如延胡索酸水合酶只能催化延胡索酸即反-丁烯二酸水合生成苹果酸，对马来酸顺丁烯二酸那么不起作用35关于酶作用专一性的假说361、锁钥模型(lock-key hypothesis)In 1902 he was awarded the Nobel Prize in Chemistry for his work on sugar and purine s

13、yntheses.酶活性中心的形状与底物分子形状互补。底物分子或其一局部像钥匙一样，专一地插入酶活性中心，通过多个结合位点的结合，形成酶-底物复合物。酶活性中心的催化基团正好对准底物的有关敏感键，进行催化反响。37锁钥模型较好地解释了立体异构专一性。但不能解释可逆反响。382、诱导楔合模型 (induced-fit hypothesis) Koshland，1958酶分子与底物分子接近时，酶蛋白质受底物分子诱导，构象发生有利于与底物结合的变化，酶与底物在此根底上互补楔合，进行反响。39酶活性中心构象的变化是可逆的。酶有其原来的形状，不一定一开始就是底物的模板底物能诱导酶蛋白的形状发生一定变化专

14、一性结合当酶的形状发生变化后，就使得其中的催化基团形成正确的排列。40酶的活力测定和别离纯化41一、酶活力的测定1、酶活力酶活性酶促反响速率：单位时间、单位体积中底物的减少量或产物的增加量(浓度/单位时间)。酶催化的反响速率越大，酶的活力越高指酶催化一定化学反响的能力 。其大小可用在一定条件下，它所催化的某一化学反响的反响速度reaction rate来表示。42研究酶促反响速度，以酶促反响的初速度为准(底物消耗5%酶反响速度降低的原因：底物浓度的降低；酶的局部失活；产物对酶的抑制；产物增加引起逆反响速度增加等432、 酶的活力单位U1国际单位IU单位：在最适反响条件下，每分钟催化1 mol底

15、物转化为产物所需的酶量，1 IU = 1 mol /min酶活力单位：一定条件下、一定时间内将一定量的底物转化为产物所需的酶量。2Katal Kat单位：在最适反响条件下，每秒钟催化1 mol底物转化为产物所需的酶量 1 Kat=60 106 IU习惯用法：每小时催化1克底物所需的酶量。443、 酶的比活力代表酶的纯度每毫克酶蛋白所含的酶活力单位数(U/mg) 。有时用U/g或U/ml454、酶活力的测定方法1分光光度法利用底物和产物在紫外或可见光局部光吸收的不同，选择适当波长，测定反响过程的进行情况。简便、节约时间和样品，可以检测nmol/L水平的变化。2荧光法利用底物和产物荧光性质的差异,

16、灵敏度高，易受到干扰。3同位素法-灵敏度最高同位素标记底物，测定产物的脉冲数即可换算出酶的活力4电化学法 pH计、 氧电极法46酶的纯化包括两方面工作：1将酶制剂从很大体积浓缩到较小的体积2将酶制剂中大量的杂质蛋白和其他大分子物质别离出去判断别离提纯方法的优劣有两个指标：1总活力的回收2比活力提高的倍数二、酶的别离和纯化47提纯过程中总蛋白减少，总活力减少，比活力增高。一个酶的别离纯化分为4 步：酶的回收率：酶的纯化倍数：步骤 1 2 3 4总蛋白质mg 20 10 5 2总活力U 6 4 3 2 比活力U/mg 6/20 4/10 3/5 2/2每次比活力第一次比活力每次总活力第一次总活力1

17、0048核酶 (ribozyme，具有催化功能的RNA1982年，Thomas Cech四膜虫rRNA的内含子 L19RNA具有生物催化功能，催化rRNA前体的剪接L19RNA表现出经典酶促催化的几个标志：高度的底物专一性，米孟氏动力学，对竞争性抑制剂的敏感性491983年 Altman RNase P中的RNA局部具有加工tRNA前体的催化功能5051抗体酶20世纪80年代后期出现，本质为免疫球蛋白，但是在易变区被赋予了酶的属性，所以又称为“催化性抗体FabFc底物过渡态底物类似物52酶工程简介enzyme engineering53酶工程就是利用酶催化的作用，在一定的生物反响器中，将相应的

18、原料转化成所需要的产品。它是酶学理论与化工技术相结合而形成的一种新技术。酶工程的概念酶工程主要研究：酶的生产、纯化、固定化技术、酶分子结构的修饰和改造及其在工、农、医药等领域的应用。541、化学方法通过对酶的化学修饰或固定化处理，改善酶的性质以提高酶的效率和降低本钱，或通过化学合成法制造人工酶。目前在酶的应用方面所采取的一般方法2、生物方法利用基因重组技术生产酶、对酶基因进行修饰或设计新基因。天然酶在开发和应用方面受到限制：1、酶的不稳定性2、酶的别离、纯化较难，本钱高，价格贵55酶工程的应用、食品加工中的应用酶在食品工业中最大的用途是淀粉加工，其次是乳品加工、果汁加工、烘烤食品及啤酒发酵。与

19、之有关的各种酶如淀粉酶、葡萄糖异构酶、乳糖酶、凝乳酶、蛋白酶等占酶制剂市场的一半以上。56二、轻化工业中的应用洗涤剂制造增强去垢能力、毛皮工业、明胶制造、胶原纤维制造粘接剂牙膏和化装品的生产、造纸、感光材料生产和饲料加工等。57三、医药上的应用常规治疗医学工程的某些组成局部：如体外循环装置中，利用酶去除血液废物，防止血栓形成和体内酶控药物释放系统等。体外检测试剂：快速、灵敏、准确地测定体内某些代谢产物58四、能源开发上的应用生物燃料：利用植物、农作物、林业产物废物中的纤维素、半纤维素、木质素、淀粉等原料，制造氢、甲烷等气体燃料以及乙醇和甲醇等液体燃料。另外，在石油资源的开发中，利用微生物作为石

20、油勘探、二次采油、石油精炼等手段也是近年来国内外普遍关注的课题。59五、环境工程上的应用废水净化：生物净化常常是本钱最低而最可行的。人们利用基因工程技术创造高效菌种，并利用固定化活微生物细胞等方法，在废水处理及环境保护工作中取得了显著的成效。生物传感器：降低环境监测本钱，加强环境监督力度。60酶促反响动力学研究酶促反响的速率以及影响此速率的各种因素的科学61一、化学动力学根底化学热力学： 反响进行的方向、可能性和限度 只研究体系的状态改变化学动力学： 反响进行的速率和反响机制 追究某一化学变化所需的时间和具体过程的机制通过化学动力学的研究，在理论上能够说明化学反响的机制，使我们能了解反响的具体

21、过程和途径622、化学反响动力学中研究化学反响速率与反响物浓度的关系时，有两种分类方法：反响分子数和反响级数1反响分子数 单分子反响: v=kc 双分子反响: v=kc1c21、反响速率及其测定63一级反响：能以单分子反响的速率方程式表示 反响速率与反响物浓度的一次方成正比 二级反响：最常见 能以双分子反响的速率方程式表示 反响速率与反响物浓度的二次方或两种物质 浓度的乘积成正比 零级反响：反响速率与反响物浓度无关 而受其他因素的影响 2反响级数(总反响速率与浓度的关系)64低底物浓度时, 速度与底物浓度成正比，表现为一级反响特征。底物浓度到达一定值，反响速度到达最大值Vmax，此时再增加底物

22、浓度，反响速度不再增加，表现为零级反响。二、底物浓度对酶反响速率的影响蔗糖酶水解蔗糖实验651、中间络合物学说(Henri & Wurtz)酶与底物先络合成一个中间产物，然后中间产物进一步分解成产物和游离的酶66中间复合物学说的证据：1电镜和X射线晶体结构分析直接观察到ES复合物2许多酶和底物的光谱特性在形成ES后发生变化3酶的物理性质在ES形成后发生变化4已别离到ES复合物5酶和底物共沉降现象672、酶促反响的动力学方程式1)反响初始阶段SE，因此S可以认为不变2)因为研究的是初速度，P的量很小，由P+E ES可以忽略不记早年的米氏方程基于快速平衡假说1米氏方程的推导 Michaelis和M

23、enten 1913年683)游离的酶与底物形成ES的速度极快快速平衡，而ES形成产物的速度极慢，故 ES 的动态平衡与ES P+E没有关系即K1、K2 K3ES的生成速度：K1E S=K1E0 - ESSES的分解速度：K2ESK1E0 - ESS = K2ES69反响速度： KS为解离常数(底物常数) 00米氏方程170 稳态理论及其对米氏方程的开展：Briggs和Haldane 1925ES的动态平衡不仅与 E+ S ES有关，还与ES P + E有关。所谓“稳态：ES的形成速度与分解速度相等、ES的浓度保持不变的反响状态71ES生成速度：k1E0 - ESSES分解速度：k2ES+k3

24、ES以上两个速度相等：k1E0 - ESS = k2ES+k3ES用稳态理论推导米氏方程：7200米氏常数：73Vmax=k3 ES= k3 E0 当Km及Vmax时，根据米氏方程可确定酶反响速度与底物浓度的关系。 0米氏方程274快速平衡假说与稳态理论的实质区别：K3！75当S?Km时当S?Km时当S=Km时由米氏方程可知：76当v=1/2 Vmax时， Km = S，Km的物理意义：当反响速度到达最大反响速度一半时底物的浓度。单位：molL-1或mmolL-1A. 米氏常数 Km的意义2动力学参数的意义Km是酶的特征常数之一。一般只与酶的性质、底物种类及反响条件有关，与酶的浓度无关。77Km最小的底物称该酶的最适底物或天然底物。因为Km愈小，到达Vmax一半所需的底物浓度愈小，表示V对S 越灵敏。 VS1/2VmaxVmaxKm2Km178Ks是底物常数，只反映ES解离趋势酶-底物亲和力，1/Ks可以准确表示酶与底物的亲和力大小。只有当K1 、 K2?K3时，KmKs，因此，1/K