RNA干扰技术原理及应用

1、RNAi的发现的发现19951995年，年，GuoGuo S S等试图阻断秀丽新小杆线虫（等试图阻断秀丽新小杆线虫（C. C. eleganselegans）中的）中的par-1par-1基因的表达。基因的表达。设计：设计： 反义反义RNA RNA 特异性地阻断特异性地阻断par-1par-1基因的表达；基因的表达； 正义正义RNA RNA 以期观察到基因表达的增强。以期观察到基因表达的增强。结果结果: : 二者都同样地切断了二者都同样地切断了par-1par-1基因的表达途基因的表达途径。这是与传统上对反义径。这是与传统上对反义RNARNA技术的解释不相技术的解释不相符合。该研究小组一直没能

2、给这个意外以合理符合。该研究小组一直没能给这个意外以合理解释。解释。 RNAi的提出的提出直到直到1998年年2月，月，Fire A和和Mello C才首次揭开这个悬才首次揭开这个悬疑之谜。疑之谜。他们将体外转录得到的他们将体外转录得到的单链单链RNA纯化后纯化后注射线虫时注射线虫时发现，基因抑制效应变得十分微弱；而经过发现，基因抑制效应变得十分微弱；而经过纯化的纯化的双链双链RNA却正好相反，能够高效特异性阻断相应基却正好相反，能够高效特异性阻断相应基因的表达。因的表达。他们证实，他们证实，Guo S博士遇到的正义博士遇到的正义RNA抑制基因表抑制基因表达的现象，以及过去的反义达的现象，以及

3、过去的反义RNA技术对基因表达的技术对基因表达的阻断，都是由于体外转录所得阻断，都是由于体外转录所得RNA中中污染了微量双污染了微量双链链RNA而引起。而引起。该小组将这一现象称为该小组将这一现象称为RNA干扰（干扰（RNA interference， 简称简称RNAi）。）。 RNAi广泛存在于自然界广泛存在于自然界随后，随后，RNAi现象被广泛地发现于真菌、拟南现象被广泛地发现于真菌、拟南芥、水螅、涡虫、锥虫、斑马鱼等大多数真核芥、水螅、涡虫、锥虫、斑马鱼等大多数真核生物中。生物中。这种存在揭示了这种存在揭示了RNAi很可能是出现于生命进很可能是出现于生命进化的早期阶段。化的早期阶段。随着

4、研究的不断深入，随着研究的不断深入，RNAi的机制正在被逐的机制正在被逐步阐明，而同时作为功能基因组研究领域中的步阐明，而同时作为功能基因组研究领域中的有力工具，有力工具，RNAi也越来越为人们所重视。也越来越为人们所重视。 体外实验结果的提示体外实验结果的提示体外实验表明：体外实验表明：RNAi反应中，加入的反应中，加入的dsRNA被切割被切割为为21-23核苷酸长的核苷酸长的RNA片段，后者会使目的片段，后者会使目的mRNA被切割为被切割为21-23核苷酸长的片段。核苷酸长的片段。从已经发生从已经发生RNAi的果蝇的果蝇S2细胞中，细胞中，Hammond等人等人部分纯化了一种核酸酶，该核酸

5、酶具有序列特异性，部分纯化了一种核酸酶，该核酸酶具有序列特异性，它仅降解与引起它仅降解与引起RNAi的的dsRNA具有同源序列的具有同源序列的mRNA。那么这种核酸酶是如何确定哪些那么这种核酸酶是如何确定哪些mRNA该降解而哪些该降解而哪些不该呢？不该呢？由于在纯化该核酸酶时，可以共分离出由于在纯化该核酸酶时，可以共分离出21-23核苷酸核苷酸长的长的dsRNA片段，这暗示该核酸酶对片段，这暗示该核酸酶对mRNA的切割有的切割有可能是以这些片段作模板指导进行的。根据以上的实可能是以这些片段作模板指导进行的。根据以上的实验结果，人们提出一种验结果，人们提出一种RNAi作用的简单模型。作用的简单模

6、型。RNAi作用的简单模型作用的简单模型当当dsRNA导入细胞后，被一种导入细胞后，被一种dsRNA特异的核酸内特异的核酸内切酶识别，切割成切酶识别，切割成21-23核苷酸长的小片段，这些核苷酸长的小片段，这些片段可与该核酸酶的片段可与该核酸酶的dsRNA结合结构域结合，并且作结合结构域结合，并且作为模板识别目的为模板识别目的mRNA。识别之后，识别之后，mRNA与与dsRNA的有义链发生链互换，的有义链发生链互换，原先原先dsRNA中的有义链被中的有义链被mRNA代替，从酶代替，从酶-dsRNA复合物中释放出来，而复合物中释放出来，而mRNA则处于原先的则处于原先的有义链的位置。有义链的位置

7、。核酸酶在同样位置对核酸酶在同样位置对mRNA进行切割，这样又产生了进行切割，这样又产生了21-23核苷酸长的核苷酸长的dsRNA小片段，与核酸酶形成复小片段，与核酸酶形成复合物，继续对目的合物，继续对目的mRNA进行切割，从而使目的基因进行切割，从而使目的基因沉默，产生沉默，产生RNAi现象。现象。通过遗传分析的方法，目前已从线虫中已分离到通过遗传分析的方法，目前已从线虫中已分离到RDE-2,RDE-3和和Mut-7等等RNAi相关的基因。相关的基因。 RNAi研究的一般技术路线研究的一般技术路线何为何为siRNAssiRNAs越来越多的研究人员开始采用小分子干扰越来越多的研究人员开始采用小

8、分子干扰RNA（small interfering RNAs，siRNAs）来抑制特定的哺乳动物基因表达。来抑制特定的哺乳动物基因表达。siRNA即为能够以同源互补序列的即为能够以同源互补序列的mRNA为为靶目标并将其降解而介导靶目标并将其降解而介导RNA干扰途径的短干扰途径的短片断双链片断双链RNA分子。分子。如何设计有效的如何设计有效的siRNA一直是当前一直是当前RNAi研究研究的热点话题，不同的实验室有不同的结果。的热点话题，不同的实验室有不同的结果。 一般设计原则一般设计原则（1）从）从mRNA 的的AUG起始密码开始，寻找起始密码开始，寻找“AA”二连二连序列，并记下其序列，并记下

9、其3端的端的19个碱基序列，作为潜在的个碱基序列，作为潜在的siRNA靶位点。有研究结果显示靶位点。有研究结果显示GC含量在含量在30%50%左右的左右的siRNA要比那些要比那些GC含量偏高的更为有效。含量偏高的更为有效。 Tuschl等建议不要针对等建议不要针对5和和3端的非编码区端的非编码区（untranslated regions，UTRs）。这些地方有丰富）。这些地方有丰富的调控蛋白结合区域，而这些的调控蛋白结合区域，而这些UTR结合蛋白或者翻译起结合蛋白或者翻译起始复合物可能会影响始复合物可能会影响siRNP核酸内切酶复合物结合核酸内切酶复合物结合mRNA从而影响从而影响siRNA

10、的效果。的效果。（2）将潜在的序列和相应的基因组数据库（人，或者小）将潜在的序列和相应的基因组数据库（人，或者小鼠，大鼠等等）进行比较，排除那些和其他编码序列鼠，大鼠等等）进行比较，排除那些和其他编码序列/EST同源的序列。例如使用同源的序列。例如使用BLAST（3）选出合适的目标序列进行合成。通常一个基因需要）选出合适的目标序列进行合成。通常一个基因需要设计多个靶序列的设计多个靶序列的siRNA，以找到最有效的，以找到最有效的siRNA序列。序列。 负对照负对照一个完整的一个完整的siRNA实验应该有负对照。实验应该有负对照。作为负对照的作为负对照的siRNA应该和选中的应该和选中的siRN

11、A序列有相同的组成，但是和序列有相同的组成，但是和mRNA没有明显的同源性。没有明显的同源性。通常的做法是将选中的通常的做法是将选中的siRNA序列打乱，序列打乱，同样要检查结果以保证它和其他基因没同样要检查结果以保证它和其他基因没有同源性。有同源性。 （1）化学合成）化学合成尽管化学合成是最贵的方法，但是却是最方便的尽管化学合成是最贵的方法，但是却是最方便的研究人员几乎不需要做什么工作。许多公司都可以根研究人员几乎不需要做什么工作。许多公司都可以根据用户要求提供高质量的化学合成据用户要求提供高质量的化学合成siRNA。主要的缺点包括价格高，定制周期长，特别是有特殊主要的缺点包括价格高，定制周

12、期长，特别是有特殊需求的。需求的。由于价格比其他方法高，为一个基因合成由于价格比其他方法高，为一个基因合成34对对siRNAs 的成本就更高了，比较常见的做法是用其他的成本就更高了，比较常见的做法是用其他方法筛选出最有效的序列再进行化学合成。方法筛选出最有效的序列再进行化学合成。最适用于：最适用于：已经找到最有效的已经找到最有效的siRNA的情况下，需要的情况下，需要大量大量siRNA进行研究；进行研究；不适用于：不适用于：筛选筛选siRNA等长时间的研究，主要原因是等长时间的研究，主要原因是价格因素价格因素（2）体外转录）体外转录 相对化学合成法而言成本比较低，是一种性价比高的相对化学合成法

13、而言成本比较低，是一种性价比高的筛选筛选siRNAs的好方法。的好方法。更重要的是能够更快的得到更重要的是能够更快的得到siRNAs。值得一提的是体外转录得到的值得一提的是体外转录得到的siRNAs只要较低的浓只要较低的浓度就可以达到化学合成度就可以达到化学合成siRNAs较高浓度得到的效果。较高浓度得到的效果。不足之处：实验的规模受到限制，虽然一次体外转录不足之处：实验的规模受到限制，虽然一次体外转录合成能提供足够做数百次转染的合成能提供足够做数百次转染的siRNAs，但是反应，但是反应规模和量始终有一定的限制。规模和量始终有一定的限制。最适用于：最适用于：筛选筛选siRNAs，特别是需要制

14、备多种，特别是需要制备多种siRNAs，化学合成的价格成为障碍时。，化学合成的价格成为障碍时。不适用于：不适用于：实验需要大量的，一个特定的实验需要大量的，一个特定的siRNA。长。长期研究。期研究。 Figure. Use of Chemically Synthesized and in Vitro Transcribed siRNAs targeting -Actin to Induce Gene Silencing.（3）用用RNase III 消化长片断双链消化长片断双链RNA制备制备siRNA 其他制备其他制备siRNA的方法的缺陷是需要设计和检验多个的方法的缺陷是需要设计和检验多个

15、siRNA序列以便找到一个有效的序列以便找到一个有效的siRNA。这种方法这种方法制备一份混合有各种制备一份混合有各种siRNAs “混合鸡混合鸡尾酒尾酒” 就可以避免这个缺陷。就可以避免这个缺陷。这个方法是选择通常是这个方法是选择通常是2001000碱基的靶碱基的靶mRNA模模版，用体外转录的方法制备长片断双链版，用体外转录的方法制备长片断双链dsRNA ，然，然后用后用RNase III (or Dicer) 在体外消化，得到一众在体外消化，得到一众siRNAs“混合鸡尾酒混合鸡尾酒”。在除掉没有被消化的在除掉没有被消化的dsRNA后，这个后，这个siRNA混合物混合物就可以直接转染细胞，

16、方法和单一的就可以直接转染细胞，方法和单一的siRNA转染一样。转染一样。由于由于siRNA混合物中有许多不同的混合物中有许多不同的siRNAs，通常能，通常能够保证目的基因被有效地抑制。够保证目的基因被有效地抑制。 （3）用用RNase III 消化长片断双链消化长片断双链RNA制备制备siRNAdsRNA消化法的主要优点在于可以跳过检测和筛选有消化法的主要优点在于可以跳过检测和筛选有效效siRNA序列的步骤，为研究人员节省时间和金钱序列的步骤，为研究人员节省时间和金钱（注意：通常用（注意：通常用RNAse III比用比用Dicer要便宜）。要便宜）。不过这种方法的缺点也很明显，就是有可能引

17、发非特不过这种方法的缺点也很明显，就是有可能引发非特异的基因沉默，特别是同源或者是密切相关的基因。异的基因沉默，特别是同源或者是密切相关的基因。现在多数的研究显示这种情况通常不会造成影响现在多数的研究显示这种情况通常不会造成影响(1-4)。最适用于：最适用于：快速而经济地研究某个基因功能缺失的表快速而经济地研究某个基因功能缺失的表型型不适用于：不适用于：长时间的研究项目，或者是需要一个特定长时间的研究项目，或者是需要一个特定的的siRNA进行研究，特别是基因治疗进行研究，特别是基因治疗 Ku-70 levels were reduced 86% in cells transfected wit

18、h the siRNA cocktail, compared to non-transfected controls. （4）siRNA表达载体表达载体 多数的多数的siRNA表达载体依赖表达载体依赖3种种RNA聚合酶聚合酶III 启动子启动子(pol III)中中的一种，操纵一段小的发夹的一种，操纵一段小的发夹siRNA在哺乳动物细胞中的表达。在哺乳动物细胞中的表达。包括的人源和鼠源的包括的人源和鼠源的U6启动子和人启动子和人H1启动子。启动子。之所以采用之所以采用RNA pol III启动子是由于它可以在哺乳动物细胞中启动子是由于它可以在哺乳动物细胞中表达更多的小分子表达更多的小分子RNA

19、，而且它是通过添加一串（，而且它是通过添加一串（3到到6个）个）U来终止转录的。来终止转录的。使用这类载体，需要使用这类载体，需要2段编码短发夹段编码短发夹RNA序列的序列的DNA单链，退单链，退火，克隆到相应载体的火，克隆到相应载体的pol III 启动子下游。启动子下游。 由于涉及到克隆，这个过程需由于涉及到克隆，这个过程需要几天的时间，同时也需要经要几天的时间，同时也需要经过测序以保证克隆的序列是正过测序以保证克隆的序列是正确的。确的。 不过幸好载体容易大量扩增，不过幸好载体容易大量扩增，这个优点足以弥补所有缺陷，这个优点足以弥补所有缺陷，特别是当载体在实验中确实有特别是当载体在实验中确

20、实有效的时候。效的时候。（4）siRNA表达载体表达载体 毫无疑问，毫无疑问，siRNA表达载体的优点在于这是众多方法中唯一可以表达载体的优点在于这是众多方法中唯一可以进行进行长期研究长期研究的方法的方法带有抗生素标记的载体可以在细胞中持带有抗生素标记的载体可以在细胞中持续抑制靶基因的表达，持续数星期甚至更久。续抑制靶基因的表达，持续数星期甚至更久。即使是对转染带有筛选标记质粒的细胞进行即使是对转染带有筛选标记质粒的细胞进行瞬时筛选瞬时筛选，也有助于，也有助于富集带质粒的细胞。这也可以帮助解决一些难转染的细胞由于转富集带质粒的细胞。这也可以帮助解决一些难转染的细胞由于转染效率低造成的问题。染效

21、率低造成的问题。 开始研究开始研究逆转录病毒和其他病毒载体逆转录病毒和其他病毒载体用于用于siRNAsiRNA表达，其优势在表达，其优势在于可以直接高效率感染细胞进行基因沉默的研究，避免由于质粒于可以直接高效率感染细胞进行基因沉默的研究，避免由于质粒转染效率低而带来的种种不便。转染效率低而带来的种种不便。最适用于：最适用于：已知一个有效的已知一个有效的siRNA序列，需要维持较长时间的基序列，需要维持较长时间的基因沉默，或者需要用抗生素筛选能表达因沉默，或者需要用抗生素筛选能表达siRNA的细胞。长期研究。的细胞。长期研究。不适用于：不适用于：筛选筛选siRNA序列（其实主要是指需要多个克隆和

22、测序序列（其实主要是指需要多个克隆和测序等较为费时、繁琐的工作）等较为费时、繁琐的工作） Following transfection, the cells were selected with hygromycin. Three weeks following selection, the cells were analyzed for GFP expression by fluorescence microscopy. Green: GFP. Blue: DAPI stained nuclei. GFP levels were remarkably reduced (94%) in cel

23、ls transfected with the GFP siRNA-encoding pSilencer 2.1-U6 hygro siRNA Expression Vector as compared to those transfected with an empty siRNA expression vector. HeLa cells expressing cycle 3 GFP were transfected with pSilencer 2.1-U6 hygro containing an insert encoding an siRNA targeting cycle 3 GF

24、P or pSilencer 2.1-U6 hygro without an siRNA-encoding insert.（5） siRNA表达框架表达框架 siRNA表达框架表达框架(siRNA expression cassettes，SECs)是一种由是一种由PCR得到的得到的siRNA表达模版，能够直表达模版，能够直接导入细胞进行表达而无需事前克隆到载体中。接导入细胞进行表达而无需事前克隆到载体中。这个方法最早是由这个方法最早是由Castanotto采用，包括一个采用，包括一个RNA pol III启动子，一段发夹结构启动子，一段发夹结构siRNA，一个，一个RNA pol III终止

25、位点。终止位点。和和siRNA表达载体不同的是，表达载体不同的是，SECs不需要载体克隆、不需要载体克隆、测序等颇为费时的步骤，可以直接由测序等颇为费时的步骤，可以直接由PCR得到，不用得到，不用一天的时间。一天的时间。因此，因此，SECs成为筛选成为筛选siRNA的最有效工具，甚至可以的最有效工具，甚至可以用来筛选在特定的研究体系中启动子和用来筛选在特定的研究体系中启动子和siRNA的最适的最适搭配！搭配！（5） siRNA表达框架表达框架 如果在如果在PCR两端添加酶切位点，那么通过两端添加酶切位点，那么通过SECs筛选筛选出的最有效的出的最有效的siRNA后，可以直接克隆到载体中构建后，

26、可以直接克隆到载体中构建siRNA表达载体。表达载体。构建好的载体可以用于稳定表达构建好的载体可以用于稳定表达siRNA和长效抑制的和长效抑制的研究。研究。 这个方法的主要缺点是这个方法的主要缺点是PCR产物很难转染到细胞中。产物很难转染到细胞中。如果有适合的新型转染试剂能提高如果有适合的新型转染试剂能提高SEC的转染效率的的转染效率的话，那问题就可以解决了。另外，没有克隆到载体中话，那问题就可以解决了。另外，没有克隆到载体中的的PCR片断并不适于大规模制备。片断并不适于大规模制备。最适用于：最适用于：筛选筛选siRNA序列，在克隆到载体前筛选最序列，在克隆到载体前筛选最佳启动子；佳启动子；不

27、适用于：不适用于：长期抑制研究。（如果克隆到载体后就可长期抑制研究。（如果克隆到载体后就可以了）以了） 。 72 hours post-transfection, the cells were assessed using nuclear staining with DAPI and immunofluorescence using a c-FOS antibody. Non-transfected cells (NT) as well as cells transfected with an SEC expressing a negative control siRNA (scramble)

28、 demonstrate wild-type levels of c-FOS. The relative level of reduction in gene expression was quantified and is provided in the bar graph. Variable Reduction in Target Gene Expression Using SECs with Different Promoters. siRNA Expression Cassettes featuring the mouse U6 (Mo-U6), human U6 (Hu-U6), a

29、nd human H1 (Hu-H1) promoters and encoding a c-fos-specific hairpin siRNA were transfected into HeLa cells. 制备制备siRNA5种不同方法的比较种不同方法的比较制备制备siRNA5种不同方法的比较（续）种不同方法的比较（续）siRNAs需要进入细胞后才能对蛋白的表达进需要进入细胞后才能对蛋白的表达进行抑制，因此将其高效地转入细胞也是研究成行抑制，因此将其高效地转入细胞也是研究成功与否的关键步骤。功与否的关键步骤。例如，一个例如，一个siRNA对某个特定基因表达的抑制对某个特定基因表达的抑

30、制效率是效率是90%，但是其转染效率只有，但是其转染效率只有10%，那么，那么总的抑制率只有总的抑制率只有9%。目前传统的转染方法与试剂的效果都不是很理目前传统的转染方法与试剂的效果都不是很理想。想。但是有专门的但是有专门的RNA转染试剂，其原理也是基于转染试剂，其原理也是基于脂质体技术，可用于多种真核细胞的脂质体技术，可用于多种真核细胞的RNAi研究。研究。可从可从mRNA和蛋白质两方面进行。和蛋白质两方面进行。mRNA：RT-PCR；定量；定量PCR；Northern 杂杂交等。交等。蛋白质：蛋白质：Western杂交；杂交；ELISA；免疫荧光等。；免疫荧光等。细胞的代谢过程，生理生化系

31、数等表型参数细胞的代谢过程，生理生化系数等表型参数的变化是的变化是RNAi效果最终和最大的体现。效果最终和最大的体现。 （1）在功能基因组中的应用）在功能基因组中的应用 在功能基因组研究中，需要对特定基因进行功能丧失在功能基因组研究中，需要对特定基因进行功能丧失或降低突变，以确定其功能。或降低突变，以确定其功能。由于由于RNAi具有高度的序列专一性，可以特异地使特定具有高度的序列专一性，可以特异地使特定基因沉默，获得功能丧失或降低突变，因此基因沉默，获得功能丧失或降低突变，因此RNAi可以可以作为一种强有力的研究工具，用于功能基因组的研究。作为一种强有力的研究工具，用于功能基因组的研究。将功能

32、未知的基因的编码区（外显子）或启动子区，将功能未知的基因的编码区（外显子）或启动子区，以反向重复的方式由同一启动子控制表达。这样在转以反向重复的方式由同一启动子控制表达。这样在转基因个体内转录出的基因个体内转录出的RNA可形成可形成dsRNA，产生，产生RNA干涉，使目的基因沉默，从而进一步研究目的基因的干涉，使目的基因沉默，从而进一步研究目的基因的功能，这种技术即为功能，这种技术即为RNAi技术。技术。根据所选用序列的不同，可将其分为根据所选用序列的不同，可将其分为编码区编码区RNAi和和启启动子区动子区RNAi技术技术。 编码区编码区RNAi技术技术自自19981998年在线虫中发现年在线

33、虫中发现RNAiRNAi现象以来，以基因编码区为靶序列现象以来，以基因编码区为靶序列的编码区的编码区RNAiRNAi技术已用于线虫功能基因组的研究。技术已用于线虫功能基因组的研究。最初这种技术是通过注射或浸泡等方法直接导入到线虫的性腺最初这种技术是通过注射或浸泡等方法直接导入到线虫的性腺或早期胚胎中。这些方法虽然可以关闭目的基因的表达，产生或早期胚胎中。这些方法虽然可以关闭目的基因的表达，产生突变表型，但这种表型变化却不能遗传。突变表型，但这种表型变化却不能遗传。这种早期的这种早期的RNAiRNAi技术可以用于研究与胚胎发育有关的基因的功技术可以用于研究与胚胎发育有关的基因的功能，但由于细胞分

34、裂造成能，但由于细胞分裂造成dsRNAdsRNA的稀释，使得这种方法在研究的稀释，使得这种方法在研究成体的基因功能时有一定的局限性。成体的基因功能时有一定的局限性。为弥补早期为弥补早期RNAiRNAi技术的上述不足，技术的上述不足，TavernarakisTavernarakis等对等对RNAiRNAi技术技术进行了改进，将目的基因的靶序列以反向重复的方式，由热激进行了改进，将目的基因的靶序列以反向重复的方式，由热激启动子控制在转基因生物中表达。启动子控制在转基因生物中表达。热激处理后，反向重复序列在细胞内开始转录，其产物会形成热激处理后，反向重复序列在细胞内开始转录，其产物会形成具发夹环结构

35、的具发夹环结构的dsRNAdsRNA，从而产生，从而产生RNAiRNAi，使目的基因沉默。，使目的基因沉默。编码区编码区RNAi技术技术这种改进的这种改进的RNAiRNAi技术与传统的技术与传统的RNAiRNAi技术相比，具有明技术相比，具有明显的优点：显的优点：首先转基因可以遗传给后代，有利于突变的分析；首先转基因可以遗传给后代，有利于突变的分析；其次其次dsRNAdsRNA可以被诱导产生，可以被诱导产生，RNAiRNAi能够在发育特定阶段能够在发育特定阶段出现，从而使研究发育早期必需基因在发育晚期的功出现，从而使研究发育早期必需基因在发育晚期的功能成为可能；能成为可能；另外，当用细胞特异性

36、启动子控制另外，当用细胞特异性启动子控制dsRNAdsRNA的表达时，可的表达时，可以研究特定基因在不同器官中的功能。以研究特定基因在不同器官中的功能。Kennerdell J. R.Kennerdell J. R.和和CarthewRCarthewR. W. W.用用GAL4/UASGAL4/UAS系统控系统控制制dsRNAdsRNA在果蝇中的表达，实现了诱导性或细胞特异性在果蝇中的表达，实现了诱导性或细胞特异性控制控制RNAiRNAi的发生。的发生。 编码区编码区RNAi技术技术随着应用随着应用RNAi技术研究线虫功能基因组工作的开展，技术研究线虫功能基因组工作的开展，研究人员对该技术在植

37、物中应用的可能性进行了探索。研究人员对该技术在植物中应用的可能性进行了探索。加州理工大学的加州理工大学的Chuang C. F.和和Megerowitz E. M.使用此技术研究了拟南芥的使用此技术研究了拟南芥的AG, CLV3, AP1, PAN四个开花相关基因。四个开花相关基因。结果表明使用结果表明使用RNAi技术可以产生功能丧失或降低突变技术可以产生功能丧失或降低突变体，其表型与以前通过其它方法鉴定的突变体类似。体，其表型与以前通过其它方法鉴定的突变体类似。RNA原位杂交表明，原位杂交表明，RNAi突变体的目的突变体的目的mRNA显著显著降低。降低。该结果说明该结果说明RNAi技术亦可以

38、成为植物功能基因组研究技术亦可以成为植物功能基因组研究中的有力工具。中的有力工具。 启动子区启动子区RNAi技术技术M. F. Mett等证明含有启动子区的等证明含有启动子区的dsRNA在植物体在植物体内同样被切割成内同样被切割成21-23核苷酸长的片段，这种核苷酸长的片段，这种dsRNA可使内源相应的可使内源相应的DNA序列甲基化，从而使启序列甲基化，从而使启动子失去功能，使其下游基因沉默。动子失去功能，使其下游基因沉默。 由于多基因家族的各成员之间高度同源，因而使用编由于多基因家族的各成员之间高度同源，因而使用编码区码区RNAi技术很难将各个成员区分开来研究，而多技术很难将各个成员区分开来

39、研究，而多基因家族内的启动子序列通常比编码区变化大，采用基因家族内的启动子序列通常比编码区变化大，采用启动子区启动子区RNAi技术有望将多基因家族的各个成员区技术有望将多基因家族的各个成员区分开来研究。分开来研究。这样综合编码区这样综合编码区RNAi技术和启动子区技术和启动子区RNAi技术的信技术的信息即可更全面地了解多基因家族地各成员的功能。息即可更全面地了解多基因家族地各成员的功能。RNAiRNAi现象存在的广泛性远远超过人们的预期，对此问现象存在的广泛性远远超过人们的预期，对此问题的深入研究结果将为进化的观点提供有力佐证。题的深入研究结果将为进化的观点提供有力佐证。启动子区启动子区RNA

40、i技术技术与其它几种进行功能丧失或降低突变的技术相比，与其它几种进行功能丧失或降低突变的技术相比，RNAiRNAi技术具有技术具有明显的优点，它比反义明显的优点，它比反义RNARNA技术和同源共抑制更有效，更容易产技术和同源共抑制更有效，更容易产生功能丧失或降低突变。生功能丧失或降低突变。而且通过与细胞特异性启动子及可诱导系统结合使用，可以在发而且通过与细胞特异性启动子及可诱导系统结合使用，可以在发育的不同时期或不同器官中有选择地进行，与育的不同时期或不同器官中有选择地进行，与T-DNAT-DNA技术造成的技术造成的功能永久性缺失相比，这是更受科学家偏爱的。功能永久性缺失相比，这是更受科学家偏

41、爱的。作为一种新的、强有力的研究工具，作为一种新的、强有力的研究工具，RNAiRNAi在功能基因组学领域呈在功能基因组学领域呈现出巨大的应用前景，成为当今研究领域最引人注意的话题之一。现出巨大的应用前景，成为当今研究领域最引人注意的话题之一。相对于基因敲除技术相对于基因敲除技术( (knockout)knockout)，RNAiRNAi具有快速、有效、容易操具有快速、有效、容易操作和序列特异性强等优点，被称为基因抑制作和序列特异性强等优点，被称为基因抑制(knockdown)(knockdown)技术，技术，是研究特定基因功能的有效方法。是研究特定基因功能的有效方法。因此，在某种程度上可以替代

42、操作复杂和费用昂贵的基因敲除技因此，在某种程度上可以替代操作复杂和费用昂贵的基因敲除技术。术。与基因芯片等高通量基因筛选技术相结合，在哺乳动物细胞基因与基因芯片等高通量基因筛选技术相结合，在哺乳动物细胞基因组学功能研究中将起重要作用，其应用前景不亚于组学功能研究中将起重要作用，其应用前景不亚于PCRPCR技术。技术。 （2）在基因治疗中的应用在基因治疗中的应用 治疗治疗HIV 感染感染由于由于RNAi是机体中古老而天然的抗病毒机制，是机体中古老而天然的抗病毒机制，HIV病病毒感染是我们亟待解决的问题，将毒感染是我们亟待解决的问题，将RNAi技术应用于艾技术应用于艾滋病治疗是顺理成章之事。滋病治

43、疗是顺理成章之事。针对针对HIV病毒研究有病毒研究有Jacque等设计的抑制等设计的抑制HIV 1长末长末端重复序列、附件基因端重复序列、附件基因vif和和nef表达的表达的siRNA，Lee等等针对针对rev转录子设计的转录子设计的siRNA及及Novina等等针对针对HIV病病毒毒gag基因设计的基因设计的siRNA，其基本策略都是选择，其基本策略都是选择HIV病病毒或宿主细胞基因为靶点毒或宿主细胞基因为靶点。治疗治疗HIV 感染感染然而，然而，RNAi治疗治疗HIV，应用于临床，有几个重要问，应用于临床，有几个重要问题必须解决：题必须解决：、作用靶点的选择，、作用靶点的选择，siRNA对

44、序列要求非常严格，对序列要求非常严格，1个碱基的错配，将大大降低个碱基的错配，将大大降低siRNA基因表达抑制作用。基因表达抑制作用。如果如果HIV逆转录酶有较高的错配率逆转录酶有较高的错配率(1/1000个核苷个核苷酸每个复制循环酸每个复制循环)，就可能迅速导致所谓，就可能迅速导致所谓siRNA逃逸逃逸突变的出现。感染个体中突变的出现。感染个体中HIV序列的多样性，为序列的多样性，为siRNA的设计和合成增加了难度。的设计和合成增加了难度。、如何有效导入、如何有效导入siRNA. DNA质粒、逆转录病毒载体、质粒、逆转录病毒载体、腺病毒载体和脂质体等在培养细胞株中有良好的导入腺病毒载体和脂质

45、体等在培养细胞株中有良好的导入效果，但在原代细胞中效果较差。效果，但在原代细胞中效果较差。、增强、增强siRNA在细胞中的稳定性在细胞中的稳定性.为了防止细胞内为了防止细胞内RNA酶对酶对siRNA的降解，可以用的降解，可以用DNA质粒和病毒载质粒和病毒载体将体将siRNA以发夹以发夹(hairpins)的形式导入细胞内。的形式导入细胞内。 治疗肝炎病毒感染治疗肝炎病毒感染Jude Lieberman等已经成功地利用等已经成功地利用 RNAi技术治愈了技术治愈了实验鼠的肝炎。实验鼠的肝炎。他们干扰的目标是他们干扰的目标是“凋亡相关蛋白质（凋亡相关蛋白质（FAs）基因）基因”。FAs存在于细胞表

46、面，它能够启动细胞的自杀程序。存在于细胞表面，它能够启动细胞的自杀程序。据认为，许多肝病是由于病毒、免疫系统失常或慢性据认为，许多肝病是由于病毒、免疫系统失常或慢性酒精中毒激活了酒精中毒激活了FAs基因所导致的。基因所导致的。Jude Lieberman等给实验鼠尾部血管注入旨在等给实验鼠尾部血管注入旨在“沉默沉默” FAs基因的基因的siRNA，发现有，发现有90的肝细胞接收到了这种的肝细胞接收到了这种RNA分子，分子，FAs蛋白质的产量变成原先的十分之一。蛋白质的产量变成原先的十分之一。结果，未接受结果，未接受RNAi治疗的实验鼠有治疗的实验鼠有40在天内死亡。在天内死亡。而而40只接受过

47、治疗的实验鼠有只接受过治疗的实验鼠有33只活了下来，只活了下来，10天后天后研究人员检查这些实验鼠的肝部，发现完全正常。研究人员检查这些实验鼠的肝部，发现完全正常。 治疗肝炎病毒感染治疗肝炎病毒感染McCaffre A及其导师及其导师Kay M结果则证明结果则证明RNAi可以直可以直接治疗肝炎并病毒。接治疗肝炎并病毒。他们首先将他们首先将HBV的基因组插入到小鼠肝脏细胞中，的基因组插入到小鼠肝脏细胞中，模拟模拟HBV感染，然后合成靶向感染，然后合成靶向HBV基因组不同部分基因组不同部分的的2种种siRNA并分别与表达载体连接后导入感染小鼠。并分别与表达载体连接后导入感染小鼠。结果发现治疗组小鼠

48、体内肝炎病毒结果发现治疗组小鼠体内肝炎病毒RNA的数量与对的数量与对照组相比减少了照组相比减少了92%。治疗组小鼠没有发现严重的副作用。治疗组小鼠没有发现严重的副作用。但但Kay指出，这种运送指出，这种运送siRNA方法不能用于人类。他方法不能用于人类。他们正在实验更温和的途径将们正在实验更温和的途径将siRNA运送到细胞中。运送到细胞中。对于人来说，身体比老鼠大得多，血液循环系统也庞对于人来说，身体比老鼠大得多，血液循环系统也庞大。大。如果解决了将如果解决了将siRNA有效而又充足地运送到细胞的问有效而又充足地运送到细胞的问题，将为许多疾病和感染提供新疗法。题，将为许多疾病和感染提供新疗法。

49、 治疗肿瘤治疗肿瘤 多种癌基因可以作为靶点设计相对应的多种癌基因可以作为靶点设计相对应的siRNAsiRNA 。 BrummelkampBrummelkamp 等用逆转录病毒载体将等用逆转录病毒载体将siRNAsiRNA导入肿瘤细导入肿瘤细胞中胞中, ,特异性抑制了癌基因特异性抑制了癌基因k rask ras (v12) (v12)的表达。的表达。对急性髓性白血病的研究已经取得了乐观的结果。对急性髓性白血病的研究已经取得了乐观的结果。ScherScher 等以引起慢性髓性白血病和等以引起慢性髓性白血病和bcrbcr ab1 ab1阳性急性成阳性急性成淋巴细胞白血病的淋巴细胞白血病的bcrbcr

50、 ab1 ab1癌基因为靶基因癌基因为靶基因, ,设计了对设计了对应的应的siRNAsiRNA, ,并获得了并获得了87%87%的有效抑制率。的有效抑制率。WildaWilda等用等用siRNAsiRNA抑制白血病抑制白血病bcr/ablbcr/abl融合基因表达也取融合基因表达也取得了成功。得了成功。 因此基于因此基于 RNAiRNAi技术的抗肿瘤治疗药物开技术的抗肿瘤治疗药物开发潜力巨大。发潜力巨大。 体内体内RNAi机制研究在深入机制研究在深入是什么原因使我们有可能通过外源是什么原因使我们有可能通过外源siRNA诱导内源性诱导内源性的靶基因转录后沉默？的靶基因转录后沉默？为解开这个迷题，

51、更有效地进行为解开这个迷题，更有效地进行RNAi应用，随着应用，随着RNAi应用研究的广泛开展，并迅速成为应用研究的广泛开展，并迅速成为RNAi研究研究中的重要领域，吸引着越来越多的研究者投身其中，中的重要领域，吸引着越来越多的研究者投身其中，涌现出一系列令人耳目一新的成果。涌现出一系列令人耳目一新的成果。多年来，生物学家认为多年来，生物学家认为RNA在生命过程中的作用仅仅在生命过程中的作用仅仅是将遗传信息从是将遗传信息从DNA传递到蛋白，就象蜂群中的雄蜂传递到蛋白，就象蜂群中的雄蜂般没有创意。般没有创意。但近几年的一系列发现使研究者对但近几年的一系列发现使研究者对RNA，尤其是，尤其是mRNA以外的哪些小以外的哪些小RNA的功能有了全新的认识。的功能有了全新的认识。体内小体内小RNA作用的重新认识作用的重新认识生物体中有一群小生物体中有一群小RNA（目前看来人体中编码约（目前看来人体中编码约255种小种小RNA，竟占整个基因组近，竟占整个基因组近1%，很多可能编码自以前被认，很多可能编码自以前被认为的为的“垃圾垃圾DNA”）可以影响蛋白表达水平，从而控制细）可以影响蛋白表达水平